BAB III METODE PENELITIAN. dan 1 kontrol terhadap ikan nila (O. niloticus). bulan, berukuran 4-7 cm, dan berat gram.

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen menggunakan 1 faktor, yaitu perlakuan limbah cair nata de coco yang terdiri atas 5 variasi kadar dan 1 kontrol terhadap ikan nila (O. niloticus). B. Populasi dan Sampel Penelitian 1. Populasi Ikan nila (O. niloticus) yang digunakan merupakan hasil seleksi secara random sampling yang disesuaikan morfologiknya, yaitu berumur 2 bulan, berukuran 4-7 cm, dan berat gram. 2. Sampel Ikan nila (O. niloticus) sebanyak 180 ekor yang diambil secara acak dari populasi. C. Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas Variasi dosis pengenceran limbah cair nata de coco, yaitu : a. 1,58% b. 2,52% c. 4,01% d. 6,38% e. 7,95% f. 0% (kontrol). 26

2 2. Variabel Terikat a. Mortalitas. b. Kerusakan struktur histologik ginjal. D. Waktu dan Tempat Penelitian 1. Waktu Penelitian : Penelitian dilaksanakan pada tanggal 20 Januari 2017 sampai 25 April Tempat Penelitian : a. Pengambilan limbah cair nata de coco dari Sentra Industri Nata De Coco di Pleret, Banguntapan, Bantul, Yogyakarta. b. Persiapan penelitian, uji pendahuluan dan uji definitif dilaksanakan di Unit Pengeloaan Hewan FMIPA Universitas Negeri Yogyakarta. c. Pembuatan preparat organ ikan dilakukan di Laboratorium Patologi dan Anatomi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gajah Mada. d. Pengujian fisikokimia air dan uji kandungan air dilakukan di Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. e. Pengamatan preparat histologik ginjal ikan nila dilakukan di Laboratorium Mikroskopi, Biologi FMIPA UNY. f. Pengujian kandungan bahan organik limbah cair nata de coco di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM. 27

3 E. Alat dan BahanPenelitian 1. Alat-alat yang diperlukan dalam penelitian adalah : a. Alat untuk tahap pemeliharaan dan perlakuan ikan uji antara lain ember, jaring kecil, jerigen, selang, beker glass, gelas ukur, kertas label dan aerator. b. Alat yang digunakan untuk pembuatan preparat organ ginjal antara lain satu set alat bedah, bak parafin, microtome knife, waterbath (45-50 o C), botol flakon, gelas benda, gelas penutup, kertas label, oven dan mikroskop. c. Alat pengukur kualitas fisikokimia antara lain ph, DO, COD, BOD, TSS, Amonia. 2. Bahan-bahan yang diperlukan dalam penelitian adalah : a. cairan sisa fermentasi bakteri A. xylinum (limbah) b. Air tawar yang berasal dari komplek Laboratorium Pendidikan Biologi FMIPA UNY. c. Pellet sebagai pakan ikan. d. Bahan untuk pembuatan preparat yaitu, larutan Bouin, Alkohol (20%, 30%, 40%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%), Alkohol absolute, Xylol, Toluel, Eosin, Hematoxylin, Aquades, Parafin dan Canada balsam. e. Formalin 10% sebagai pengawet organ. 28

4 F. Prosedur Penelitian 1. Aklimatisasi Ikan Nila (O. niloticus) Aklimatisasi berlangsung selama 9 hari di UnitPengelolaan Hewan, Kebun Biologi FMIPA UNY. 2. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan ambang atas (LC jam) dan ambang bawah (LC 0-48jam) limbah cair nata de coco. Kadar limbah uji pendahuluan dilakukan menggunakan deretan konsentrasi rentang Skala Logaritmik yaitu 10-2 %, 10-1 %, 10 0 %, 10 1 %, dan 10 2 % volume air sumur dan limbah cair nata de coco sebanyak 10 liter. 3. Uji Definitif Uji definitif dilakukan menggunakan skala Duodoroff. Kadar aman ditentukan berdasarkan 10% dari LC jam limbah cair nata de coco. Log N/n = k log a/n...(1) a/n : b/a : c/b : d/c : e/d : x...(2) Keterangan : a : konsentrasi terkecil setelah n n : konsentrasi ambang bawah N : konsentrasi ambang atas K : banyaknya selang konsentrasi b, c,.., x : konsentrasi selanjutnya Setelah uji definitif dilakukan, ikan yang masih hidup selama perlakuan 96 jam pada masing-masing sampel diambil untuk diamati secara mikroanatomi struktur ginjal dan dianalisis kerusakannya. 4. Pengukuran parameter fisikokimia 29

5 Pengukuran parameter fisikokimia ph, BOD, COD, TSS, DO, dan Amoniadiuji sebelum uji definitif dilakukan. 5. Pembuatan Preparat Organ Ginjal Ikan Nila a) Section (pembedahan) Pembedahan bertujuan untuk mengambil organ ginjal ikan nila yang akan dibuat preparat dan diamati kerusakan struktur histologiknya. b) Fixation Ginjal yang telah dibedah dimasukkan ke dalam botol flakon berisi cairan fixative, yaitu formalin 10% kemudian dilabeli sesuai perlakuan dan ulangan. c) Dehydration (Pengeringan) Dehidrasi merupakan penarikan molekul air dari dalam jaringan dengan menggunakan alkohol konsentrasi rendah ke alkohol konsentrasi tinggi. 1) Alkohol 70%, 3x perendaman, setiap perendaman 30 menit. 2) Alkohol 80%, 3x perendaman, setiap perendaman 30 menit. 3) Alkohol 90%, 3x perendaman, setiap perendaman 30 menit. 4) Alkohol 96%, 2x perendaman, setiap perendaman 30 menit. 5) Alkohol absolute, direndam 30 menit. 30

6 d) Clearing (penjernihan) Clearing merupakan proses membuat potongan jaringan supaya jernih atau transparan. Senyawa kimia yang digunakan harus dapat bercampur dengan dehidran, misalnya toluol dan xylol. e) Parrafination (pemasukan parrafin) Proses infiltrasi dilakukan dalam oven bersuhu 56 o C dengan parafin yang dipilih dengan titik cair o C atau mengunakan campuran parafin dengan titik cair o C dan o C. Lama proses tergantung dari jenis dan ukuran jaringan.. Tahapan-tahapan infiltrasi meliputi : zat penjernih dengan parafin murni (1:1) selama menit, parrafin murni I selama menit, parrafin murni II selama menit, dan parrafin murni III selama menit. Penetrasi parrafin tergantung dari tebal tipisnya pemotongan preparat yang dipakai. Parrafin dibiarkan memadat dan diberi petunjuk arah pemotongan dan nama dari jaringan tersebut. f) Embending (Penanaman) Embeding merupakan penanaman potongan jaringan kedalam parrafin murni sehingga jaringan dapat diiris dengan pisau mikrotom. Setelah jaringan berada pada paraffin dan mulai mengeras kemudian blok paraffin di ambil dan di lekatkan pada blok kayu ukuran 3x3 cm. Blok kayu berfungsi sebagai pemegang pada saat blok dipotong dengan pisau mikrotom. 31

7 g) Sectioning (pemotongan dengan mikrotom) 1) Blok parrafin berisi jaringan diiris menggunakan scalpel, sehinggga bagian yang akan diiris menggunakan mikrotom berbentuk segi empat. 2) Menempelkan blok parrafin pada blok kayu. 3) Memasang pisau mikrotom pada tempatnya dan mengatur tebal tipisnya coupes dengan pengaturan mikrotom (setebal 4 µm). 4) Setelah diiris, pita preparat langsung dimasukkan dalam tempat yang telah berisi air hangat agar coupes dapat terlentang dan tidak terlipat. h) Affixing 1) Meletakkan sejumlah coupes pada gelas benda yang telah diberi perekat gliserin albumin. 2) Memindahkan gelas benda yang berisi coupes di atas hotplate yang bersuhu (40-45ºC), mengatur letak coupes dan merentangkannya, menghisap kelebihan air dengan menggunakan kertas saring dan membiarkan gelas benda di atas hotplate sampai kering selama 24 jam. i) Staining (pewarnaan) Stainingmerupakan pemberian warna pada jaringan atau sel atau komponennya supaya mudah diamati di bawah mikroskop cahaya.langkah pertama adalah mencelupkan kaca benda yang telah ditempeli coupes ke dalam xylol selama 30 menit. 32

8 Selanjutnya melakukan rehidrasi berturut-turut dengan mencelupkan ke dalam alkohol absolute, alkohol 96%, 90%, 80%, 70% kemudian memasukkan dalam eosin selama 2 menit, mencelupkan ke dalam alkohol 60%, 50%, 40%, 30%, 20% kemudian dicelupkan ke dalam Hematoxylyn selama 10 menit dan mencucinya menggunakan air mengalir. Langkah selanjutnya melakukan dehidrasi dengan mencelupkan berurutan mulai alkohol 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% dan alkohol absolute beberapa kali celupan kemudian mengeringkannya dengan kertas filter atau tissue. Terakhir menetesi slide dengan Canada Balsamlalu ditutup dengangelas penutup. j) Pengamatan struktur histologik Preparat diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400X dan diamati bidang pandang preparat histologik ginjal, kemudian dibandingkan dengan perlakuan kontrol dan antar perlakuan. Pengambilan gambar preparat menggunakan Opticlab. G. Teknik Pengumpulan Data 1. Tahap Persiapan Tahap persiapan meliputi aklimatisasi ikan dan membuat berbagai variasi kadar limbah cair sisa fermentasi nata de coco untuk uji pendahuluan. Ikan Nila yang digunakan berumur 2 bulan, ukuran 5-7 cm, dan berat gram. 33

9 2. Tahap Penelitian a. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan dilakukan untuk menentukan ambang atas (LC jam) dan ambang bawah (LC 0-48 jam) limbah cair nata de coco. Kadar limbah uji pendahuluan dilakukan menggunakan deretan konsentrasi rentang skala logaritmik yaitu 10-2 %, 10-1 %, 10 0 %, 10 1 %, dan 10 2 %. Mortalitas ikan diamati setiap 24 jam sekali selama 48 jam. b. Uji Definitif Kadar uji definitif ditentukan dengan skala Duodoroff. Variasi kadar limbah cair nata de coco terdiri 5 perlakuan dan 1 kontrol. Mortalitas ikan diamati setiap 24 jam sekali selama 96 jam. c. Pengukuran Parameter Fisikokimia Pengukuran parameter fisikokimia dilakukan untuk mengukur kualitas air perlakuan dan limbah cair nata de coco. Pengukuran yang dilakukan antara lain ph, DO, BOD, COD, TSS, dan amonia. d. Pengamatan Struktur Histologik Ginjal Ikan Nila Preparat histologik ginjal ikan diamati dibawah mikroskop untuk diamati kerusakannya. Preparat secara sampling diamati dengan 4 posisi bidang pandang lalu dirata-rata persentase kerusakannya. 34

10 H. Teknik Analisis Data 1. Analisis probit untuk mengetahui konsentrasi yang menyebabkan kematian ikan nila (O. niloticus) dan penentuan nilai kadar aman limbah cair industri nata de coco di Pleret, Banguntapan, Bantul, Yogyakarta. 2. Analisis univariat untuk menentukan pengaruh beda nyata kadar limbah cair nata de coco terhadap mortalitas ikan nila (O. niloticus) pada uji toksisitas. 3. Analisis regresi digunakan untuk memprediksi parameter fisikokimia limbah cair nata de coco yang paling berpengaruh terhadap mortalitas ikan nila (O. niloticus) pada uji toksisitas. 4. Analisis one way anova digunakan untuk mengetahui pengaruh limbah cair nata terhadap kerusakan struktur histologik ginjal ikan nila. 35