IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE DAN LIPOPROTEIN LIPASE SERTA HUBUNGANNYA DENGAN KUALITAS MARBLING DAGING DOMBA

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE DAN LIPOPROTEIN LIPASE SERTA HUBUNGANNYA DENGAN KUALITAS MARBLING DAGING DOMBA HIDAYATI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

2

3 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi berjudul Identifikasi Keragaman Gen Lecithin Cholesterol Acyltransferase dan Lipoprotein Lipase serta Hubungannya dengan Kualitas Marbling Daging Domba adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Januari 2015 Hidayati NRP D

4

5 RINGKASAN HIDAYATI. Identifikasi Keragaman Gen Lecithin Cholesterol Acyltransferase dan Lipoprotein Lipase serta Hubungannya dengan Kualitas Marbling Daging Domba. Dibawah bimbingan CECE SUMANTRI, RONNY RAHMAN NOOR dan RUDY PRIYANTO Indonesia memiliki beberapa rumpun domba lokal yang memiliki keragaman fenotip dan genetik yang tersebar di beberapa wilayah. Keragaman genetik yang dimiliki oleh masing-masing individu atau masing-masing rumpun merupakan sumber daya genetik yang dapat digunakan dalam peningkatan dan pengembangan domba lokal di masa yang akan datang. Direktorat Jenderal Peternakan telah melaporkan peningkatan populasi domba secara Nasional selama 5 tahun terakhir ( ) yaitu ekor; ekor; ekor; ekor dan ekor secara berturut-turut. Peningkatan populasi domba ini merupakan suatu potensi untuk memenuhi permintaan daging merah yang terus meningkat dari tahun ke tahun. Namun konsumsi daging domba dan kambing di Indonesia masih rendah yaitu baru sekitar 5% dari total kebutuhan daging atau setara dengan 0.24 g/kapita/tahun. Masih rendahnya konsumsi daging kambing dan domba karena harga daging kambing yang relatif tinggi, persepsi masyarakat bahwa daging domba tidak sehat karena memiliki kandungan kolesterol dan lemak jenuh yang tinggi dan adanya bau khas yang sulit dihilangkan. Keberadaan lemak pada bagian intramuskuler atau dikenal dengan marbling merupakan lemak yang memiliki arti penting dalam penilaian terhadap daging masak karena berpengaruh terhadap keempukan, juiciness dan flavour terutama dalam pembuatan steak serta lemak pada bagian ini tidak dapat dipisahkan langsung karena merupakan bagian dari otot berbeda dengan lemak pada bagian lainya. Keragaman gen-gen fungsional yang berasosiasi dengan kualitas marbling merupakan suatu hal penting dalam mengembangkan domba yang aman untuk dikonsumsi diantaranya dengan eksplorasi keragaman gen LCAT dan gen LPL melalui metode sekuensing dan selanjutnya keragaman yang muncul dihubungkan dengan kualitas marbling untuk menemukan penanda genetik yang dapat digunakan dalam seleksi (Marker Assisted Selection) dalam pengembangan domba lokal di masa yang akan datang Hasil penelitian pertama menemukan 3 SNPs baru gen LCAT ekson 6 pada domba lokal Indonesia yaitu pada posisi basa c.742 C>T; c.770 T >A dan c.882 C>T. Kombinasi 3 SNPs membentuk sembilan diplotipe. Mutasi transisi sitosina menjadi timina c.742 merupakan synonymous mutation (Ala>Ala); mutasi transversi timina menjadi adenina c.770 dan mutasi transisi sitosina menjadi timina c.882 merupakan non-synonymous mutation mengakibatkan perubahan asam amino phenylalanina>isoleusina dan valina>alanina. Ketiga SNPs yang ditemukan merupakan SNPs baru yang belum dilaporkan pada populasi domba lainnya. Keragaman gen LCAT ekson 6 ditemukan pada rumpun domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa, domba ekor gemuk jawa, domba garut, domba lembah palu dan domba pulau rote dan tidak ditemukan pada rumpun domba kissar dan domba sumbawa. Hasil penelitian kedua menemukan 3 SNPs baru gen LPL bagian 5 UTR dan ekson 1 yaitu insersi pada posisi basa g.26>c/g, g.27>g dan mutasi pada

6 c.192t>c. Insersi g.26>c/g dan insersi g.27>g merupakan frameshift mutation dengan frekuensi munculnya SNPs pada kedua titik mutasi ini relatif rendah pada domba garut dan domba ekor tipis sumatera. Mutasi transisi pada posisi basa c.192 T>C merupakan non synonymous mutation karena perubahan basa mengakibatkan perubahan asam amino valina>alanina (Val>Ala). Mutasi pada c.192 bersifat polimorfik pada domba garut dan monomorfik pada domba ekor tipis sumatera. Penelitian tahap tiga bertujuan untuk mengasosiasikan keragaman gen LPL c.192 dengan kualitas marbling domba garut. Asosiasi keragaman genotipe gen LPL dan kualitas marbling dianalisis menggunakan analisis sidik ragama satu arah dan uji beda nyata terkecil untuk uji lanjut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan genotipe gen LPL mempengaruhi asam lemak heneikosanoat, dimana genotipe TT (0.04%) memiliki kandungan heneikosanoat lebih tinggi dibandingkan genotipe CC (0.03%) dan genotipe CT (0.02%). Asam lemak heneikosanoat merupakan asam lemak minor di alam, namun keberadaan asam lemak heneikosanoat harus diwaspadai karena keberadaan asam lemak jenuh rantai panjang dengan atom karbon ganjil ini mengindikasikan terjadinya akumulasi propionat pada ternak ruminansia. Propionat merupakan asam lemak terbang hasil fermentasi rumen pada ternak ruminansia yang diberi pakan konsentrat tinggi dan mengindikasikan terjadinya defisiensi biotin. Biotin dibutuhkan oleh ternak ruminansia dalam proses konversi propionat menjadi methyl malonyl CoA yang dibutuhkan dalam proses perpanjangan asam lemak dengan menyumbangkan dua atom karbon. Defisiensi biotin dapat menghambat pembentukan methyl malonyl CoA mengakibatkan munculnya asam lemak rantai panjang dengan atom karbon ganjil. Selain itu keberadaan asam lemak henekosanoat dapat mengoksidasi asam lemak omega, namun mekanisme pastinya belum diketahui. Rasio asam lemak tidak jenuh ganda (ALTJG): asam lemak jenuh (ALJ), kandungan kolesterol, nilai desirable fatty acid (DFA), nilai indeks atherogenicity dan rasio (stearat + oleat): palmitat marbling, merupakan indikator bagi daging domba yang sehat dikonsumsi. Hasil analisis menunjukkan bahwa daging domba garut relatif masih aman dan sehat dikonsumsi karena kandungan kolesterol rendah (6.10%-8.91%), nilai indeks atherogenicity berkisar , rasio (stearat + oleat): palmitat berkisar , nilai desirable fatty acid kecuali rasio ALTJG : ALJ lebih rendah ( ) dari rekomendasi Kata kunci: asam lemak, domba, gen LCAT, gen LPL, SNPs.

7 SUMMARY HIDAYATI. Identification of polymorphisms of Lecithin Cholesterol Acyltransferase gene and Lipoprotein Lipase gene and its association with marbling lamb quality on Indonesian local sheep. Supervised by CECE SUMANTRI, RONNY RAHMAN NOOR and RUDY PRIYANTO. Indonesia local sheep breeds was scattered in several provinces and its own phenotypic and genetic characteristic and variation. The existing genetic variation within and among groups can be utilized to improve their productivity. Directorate general of animal husbandry has reported increasing of sheep population last five years ( ) i.e heads; heads; heads; heads and heads respectively. However, sheep and goat meat consumption in Indonesia was still low, only about 5% of the total demand for meat, equivalent to 0.24 g/capita/ year. The low consumption of lamb is caused relatively by high cholesterol and saturated fatty acid of lamb. The consumers are concerned about health factors, due to strong statements from the medical profession that lamb may contain too much saturated fatty acid and trans monounsaturated fatty acid. Marbling is important on the assessment meat because effected the tenderness, juiciness and flavor, especially in steak. This fat could be separated from muscle. The genes exploration of Lecithin Cholesterol Acyltransferase and Lipoprotein Lipase polymorphisms by sequencing method and its association with marbling quality is an important to Marker Assisted Selection (MAS) can be utilized to development and enhanced the genetic quality of Indonesian local sheep. The results of the first study show three novel SNPs of LCAT gene exon 6 in Indonesian local sheep, at base c.742 C>T; c.770 T>A and c.882 C>T. The combination of three SNPs was formed nine diplotypes. The transition mutation of cytosine into thymine is synonymous mutation c.742 (Ala>Ala); the transversion mutation of adenine to thymine at c.770 and transition mutation thymine to cytosine c.882 were a non-synonymous mutations and resulted of changed phenylalanine>isoleucine and valine>alanine. So far there is no published studies describing three novel SNPs. Polymorphisms of LCAT gene exon 6 were found in sumatran thin tail ed sheep, javanese thin tail ed sheep, javanese fat tail ed sheep, garut sheep, lembah palu sheep and rote island sheep and neither in kissar sheep and sumbawa sheep. The results of the second study were showed three novel SNPs of LPL gene i.e. the insertion at base g.26>c/g, g.27>g and transition mutation at base c.192t>c. Insertion g.26.c/g and g.27>g were a frameshift mutation with appearance frequency relatively low in both sumatran thin tail ed sheep and garut sheep. Mutations in the base c.192 T>C was non synonymous mutation and changed of valine>alanine (Val> Ala). This mutation is monomorphic on sumtran thin tail and polymorphic on garut sheep. The third study showed the polymorphisms of LPL gene at c.192t>c on garut sheep was associated with heneicosanoic acid, whereas TT genotype (0.04) had higher than CC (0.03) and CT (0.02). Heneicosanoic is a minor fatty acid in nature, but the presence of heneicosanoic ( 21:0 ) affect the meat quality. The presence of odd long-chain saturated fatty acids indicates accumulation of

8 propionic acid and biotin deficiency. Propionate is one of the volatile fatty acids of rumen fermentation. Conversion propionate into methyl malonyl CoA requires biotin. The methyl malonyl CoA was required for elongated fatty acid process by providing two carbon atoms. Biotin deficiency could inhibit the formation of methyl malonyl CoA and caused odd long-chain fatty acids. In addition, the presence of fatty acids heneicosanoic acid could oxidize omega fatty acids, but the exact mechanism is still unknown. The results indicate that the lamb of garut sheep is relatively safe and healthy to be consumed because the cholesterol content still low (6.10%-8.91%), atherogenicity index of fatty acid was , the ratio of (stearic + oleic): palmitic was , and index of desirible fatty acid is They were still within the recommended range, except for PUFA: SFA ratio was lower ( ) than recomended Key words: Fatty acids, LCAT gene, LPL gene, sheep, SNPs.

9 Hak Cipta milik IPB, tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

10

11 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE DAN LIPOPROTEIN LIPASE SERTA HUBUNGANNYA DENGAN KUALITAS MARBLING DAGING DOMBA HIDAYATI Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Ilmu dan Teknologi Peternakan SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

12 Penguji pada Ujian Tertutup: 1. Dr Ir Dedi Duryadi Solihin, DEA Staf Pengajar FMIPA IPB 2. Dr Tuti Suryati, SPt MSi Staf Pengajar Fakultas Peternakan IPB Penguji pada Ujian Terbuka : 1. Dr Ir Dedi Rahmat, MSi Staf Pengajar Fakultas Peternakan UNPAD 2. Prof (R) Dr Ir Ismeth Inounu Peneliti Utama Puslitbangnak Kementerian Pertanian RI

13

14

15 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-nya sehingga disertasi ini dapat diselesaikan. Topik kajian yang diteliti dalam penelitian yang dilaksanakan dari bulan Oktober 2012 sampai dengan Agustus 2014 adalah Identifikasi Keragaman Gen Lecithin Cholesterol Acyltransferase dan Lipoprotein Lipase serta Hubungannya dengan Kualitas Marbling Daging Domba. Kedua gen ini memiliki peranan dalam transportasi lemak dan deposisi lemak di dalam tubuh. Karya ilmiah ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada program studi Ilmu dan Teknologi Peternakan, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penulis menyadari bahwa penelitian dan penyusunan disertasi ini tidak akan terlaksana dengan baik tanpa bantuan dan dukungan dari banyak pihak. Oleh karena itu ucapan terima kasih penulis haturkan kepada komisi pembimbing Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri, MAgrSc selaku ketua, Bapak Prof Dr Ir Ronny Rahman Noor, MRurSc dan Bapak Dr Ir Rudy Priyanto selaku anggota yang telah banyak meluangkan waktu, bimbingan, dorongan semangat dan masukan, dalam penelitian maupun penulisan disertasi ini. Ucapan terima kasih juga penulis haturkan kepada Kepala Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Bapak Prof Dr Ir Muladno, MSA berserta staf (Eryk Andreas, SPt MSi, Isyana, S Pt dan Selvi) yang telah memberikan izin dan kesempatan kepada penulis untuk melaksanakan penelitian di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak. Ucapan yang sama juga penulis haturkan kepada Kepala Laboratorium Terpadu IPB Baranang Siang dan staf (Bu Ani dan Mbak Rita). Kepada Dr Ir Salundik, MSi selaku ketua Program Studi ITP serta staf (Bu Ade dan Mbak Okta) terima kasih atas pelayanan administrasi yang ramah selama penulis menempuh studi. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan Nasional atas Beasiswa BPPS dan Bantuan Biaya Pendidikan tahun 2014 dari Direktorat Pendidikan Tinggi Islam, Kementerian Agama RI. Terlaksananya penelitian ini juga tidak terlepas dari bantuan biaya penelitian dari Lembaga Penelitian dan Pengembangan Universitas Islam Negeri Sultan Syarif Kasim Riau melalui SK Rektor Nomor: 988/R/2013 untuk itu penulis haturkan banyak terima kasih kepada mantan Rektor UIN Suska Riau Prof Dr HM Nazir dan mantan Kepala LPPM UIN Suska Riau Bapak Drs Husni Thamrin MS. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada mantan Dekan Fakultas Pertanian dan Peternakan UIN Suska Riau Ibu Ir Eniza Saleh, MSi yang telah memberikan bantuan biaya publikasi melalui DIPA Fakultas Pertanian dan Peternakan UIN Suska Riau tahun Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada Isnandar Putra, SPt dan drh Hanif dari Dinas Peternakan Provinsi Sumatera Barat yang telah banyak membantu dalam pengambilan sampel domba ekor tipis sumatera begitu juga kepada Holfinaldi, SPt atas luangan waktu untuk survey lokasi penelitian. Berikut kepada Bapak Saharudin dan peternak domba di Kecamatan Koto Tangah Padang juga diucapkan terima kasih. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak Dr Ir Agus Susanto, MSc beserta istri atas persaudaraan dan diskusi molekulernya selama ini. Kepada ibu Ir Sri Rahayu, MS juga diucapkan terima kasih atas bantuan materi penelitian domba garut. Semoga Allah SWT membalas segala kebaikan yang telah Bapak dan Ibu berikan selama ini.

16 Ungkapan terima kasih yang tulus penulis haturkan kepada yang tercinta Ayahnda H Heldi Syair dan Ibunda Hj Wasni Nawas, kakak/abang, abang/kakak ipar serta seluruh keluarga besar atas segala doa, kasih sayang, dukungan baik moril maupun materil serta motivasi yang diberikan sehingga disertasi ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada suami Edwin Perwira, ST MSc M Eng dan kedua putriku Raisha Adiva Khalila dan Naira Aliya Rafifa, terima kasih atas izin kuliah, doa, pengertian, kasih sayang dan dukungan yang diberikan selama ini. Berikut ucapan terima kasih juga penulis tujukan kepada semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu, untuk itu penulis memohon maaf yang sebesar-besarnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Januari 2015 Hidayati

17 xvii DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN DAFTAR ISI 1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1 Perumusan Masalah 2 Tujuan Penelitian 3 Manfaat Penelitian 3 Hipotesis 4 2 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE PADA DOMBA LOKAL INDONESIA 5 Pendahuluan 6 Bahan dan Metode 8 Hasil dan Pembahasan 11 Simpulan 19 3 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LIPOPROTEIN LIPASE PADA DOMBA EKOR TIPIS SUMATERA DAN DOMBA GARUT 20 Pendahuluan 21 Bahan dan Metode 25 Hasil dan Pembahasan 27 Simpulan 32 4 ASOSIASI KERAGAMAN GEN LIPOPROTEIN LIPASE c.192 DENGAN KUALITAS MARBLING DAGING DOMBA GARUT 33 Pendahuluan 34 Bahan dan Metode 35 Hasil dan Pembahasan 38 Simpulan 46 5 PEMBAHASAN UMUM 47 6 SIMPULAN DAN SARAN 50 DAFTAR PUSTAKA 51 LAMPIRAN 58

18 xviii DAFTAR TABEL 2.1 Diplotipe gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan nilai chi kuadrat gen LCAT pada posisi basa c.742 domba lokal Indonesia Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan nilai chi kuadrat gen LCAT pada posisi basa c.770 domba lokal Indonesia Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan nilai chi kuadrat gen LCAT pada posisi basa c.882 domba lokal Indonesia Diplotipe sekuens bagian dari 5 UTR dan ekson 1 gen LPL domba ekor tipis sumatera dan domba garut Frekuensi genotipe dan frekuensi gen LPL domba ekor tipis sumatera dan domba garut Nilai heterosigositas dan nilai chi kuadrat gen LPL domba ekor tipis sumatera dan domba garut Kandungan lemak, kolesterol dan komposisi asam lemak domba garut pada genotipe gen LPL yang berbeda Kandungan lemak dan kolestrol beberapa breed domba Kandungan ALJ, ALTJT, ALTJG dan rasio ALTJG:ALJ beberapa breed domba Profil asam lemak marbling domba garut berdasarkan genotipe gen LPL yang berbeda (%) Kandungan lemak, kolesterol dan profil asam lemak marbling domba garut berdasarkan genotipe gen LPL yang berbeda (mg/100g) Profil asam lemak pada breed domba lainnya 44 DAFTAR GAMBAR 1.1 Alur kerangka berpikir penelitian Peranan LPL dan LCAT dalam transport lemak dan kolesterol dalam tubuh ternak Struktur gen LCAT, terdiri atas 6 ekson (I, II, III, IV, V dan VI) dan 5 intron Sekuen amplikon gen LCAT (gen bank GQ ) Hasil amplifikasi PCR gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia Aligment sekuens gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia Potongan sekuens gen LCAT ekson 6 yang menunjukkan terjadinya 14 mutasi pada posisi basa c.742, c.770 dan c Transpor lemak ke jaringan pada ternak ruminansia dan non ruminansia Mekanisme aktivasi gen LPL pada otot Struktur gen LPL, terdiri atas 10 ekson (1,2, 3 10) dan 9 intron Amplikon sekuen gen LPL (gen bank X ) 24

19 xix 3.5 Hasil amplifikasi PCR gen LPL daerah 5 UTR dan bagian ekson Aligmnet gen lipoprotein lipase domba garut dan domba ekor tipis sumatera dengan gen bank nomor akses X Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan insersi pada posisi basa c.26 dan c Aligment sekuens protein gen LPL domba garut dan domba ekor tipis sumatera Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan adanya mutasi pada posisi c.192 T>C pada domba garut Otot longissimus dorsi Nilai desirable fatty acid (DFA), atherogenicity index dan rasio (stearat+oleat): palmitat marbling domba garut 41 DAFTAR LAMPIRAN 1 Ovis aries lecithin-cholesterol acyltransferase (LCAT) gene, exons 2, 3, 6 dan partial cds gen bank: GQ O.ovis mrna for lipoprotein lipase gen bank: X

20

21 1 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Peningkatan konsumsi daging di Indonesia diikuti dengan permintaan masyarakat akan penyediaan daging ASUH (Aman, Sehat, Utuh dan Halal), ramah lingkungan dan dijamin keberlanjutannya yang memiliki daya saing dan sesuai dengan kebutuhan pasar domestik. Konsumsi daging domba dan kambing di Indonesia masih sangat rendah, yaitu sekitar 5% dari total kebutuhan daging atau setara dengan 0.24 g/kapita/tahun (Inounu 2011). Direktorat Jenderal Peternakan telah melaporkan peningkatan populasi domba secara Nasional selama 5 tahun terakhir ( ) yaitu ekor; ekor; ekor; ekor dan ekor secara berturut-turut. Peningkatan populasi domba ini merupakan suatu potensi untuk memenuhi permintaan daging merah yang terus meningkat dari tahun ke tahun. Masih rendahnya konsumsi daging kambing dan domba karena harga daging yang relatif tinggi dan berkembang persepsi pada masyarakat bahwa daging kambing dan domba memiliki kandungan kolesterol tinggi, kandungan asam lemak jenuh tinggi dan bau khas yang sulit dihilangkan. Lemak di dalam tubuh ternak ditemukan pada jaringan adipose, hati, plasma, sel darah merah, otot rangka serta otak dan jaringan syaraf (Leat 1983). Jaringan adipose ditemukan dalam bentuk lemak visceral, lemak subkutan, lemak intermuskular dan lemak intramuskuler (marbling) (Kauffman dan Breidenstein 1994). Lemak intramuskuler merupakan butiran-butiran lemak yang ditemukan di dalam otot (Aberle et al. 2001). Lemak intramuskuler memberikan pengaruh terhadap penilaian konsumen terhadap daging karena dapat mempengaruhi keempukan, juiciness dan flavor (Miller 1994). Disisi lain keberadaan lemak di dalam makanan juga merupakan poin penting dalam memilih jenis makanan yang akan dikonsumsi terutama bagi penderita penyakit-penyakit tertentu. Konsumsi daging yang mengandung asam lemak jenuh (ALJ) tinggi terutama laurat dan miristat dapat mengakibatkan otot rentan terhadap resistensi insulin sehingga timbul hiperinsulinemia atau meningkatkan produksi kolesterol oleh hati (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Begitu juga mengkonsumsi daging dengan kandungan kolesterol tinggi berdampak timbulnya atherosclerosis atau penebalan pembuluh darah ke jantung. Rasio asam lemak tak jenuh ganda (ALTJG): ALJ yang tinggi dan kandungan kolesterol rendah pada daging domba dibutuhkan sebagai pangan fungsional bagi penderita penyakit-penyakit tertentu. Deposisi lemak pada jaringan ditentukan oleh keseimbangan proses-proses yang berlangsung di dalam tubuh meliputi lipogenic, lipolitic, transpor asam lemak dan jumlah asam lemak yang digunakan. Keseimbangan proses-proses tersebut ditentukan oleh jumlah lemak yang dimakan, sintesis de novo asam lemak, sintesis triasilgliserol, degradasi lipid dan proses transpor asam lemak (Zhao et al. 2010). Distribusi lemak, komposisi asam lemak dan tipe serabut otot, sekitar 35% dipengaruhi oleh genetik (Williams 2008). Karamichou et al. (2006) menyatakan bahwa nilai heritabilitas komposisi asam lemak marbling domba scottish blackface berkisar sedang sampai tinggi, mengindikasikan bahwa seleksi pada tetua dapat meningkatkan performans asam lemak pada turunannya.

22 2 Seleksi terhadap kualitas marbling menggunakan metode konvensional sangat sulit dan relatif mahal sehingga dalam program seleksi berdasarkan fenotipe, kualitas marbling tidak umum dilakukan. Alternatif yang dapat dilakukan adalah melalui seleksi genom. Seleksi genom diawali dengan penemuan kandidat gen yang berasosiasi dengan sifat-sifat yang diinginkan. Salah satunya melalui eksplorasi single nucleotide polymorphisms (SNPs) untuk mengetahui genotipe ternak dan selanjutnya dihubungkan dengan sifat-sifat yang dijadikan sebagai kriteria seleksi. SNP merupakan variasi sekuen DNA yang muncul ketika satu nukleotida (A, T, C atau G) berbeda dari sekuen pada umumnya. Guo et al. (2014) melaporkan bahwa kualitas marbling sapi dan domba ditentukan oleh poligen dan ekspresinya dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti penyakit dan pakan. Keberadaan dan aktivitas enzim dalam tubuh ternak disandikan oleh gen. Diantara enzim yang berperan terhadap kandungan kolesterol dan profil asam lemak adalah lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) dan lipoprotein lipase (LPL). Lecithin cholesterol acyltransferase adalah soluble enzyme yang mampu mengonversi kolesterol dan lecitin menjadi ester kolesterol dan lisolecitin pada permukaan high density lipoprotein (HDL) dan berperan penting dalam metabolisme lipoprotein, terutama dalam proses reverse cholesterol transport. Enzim ini disintesis di hati tapi sirkulasinya pada plasma darah sebagai komplek komponen HDL. Ketiadaan enzim ini menyebabkan akumulasi kolesterol bebas pada jaringan daging dan darah. Lipoprotein lipase adalah enzim kunci yang berperan utama pada metabolisme dan transpor lipoprotein serta memberikan pengaruh penting pada level trigliserida darah, mengontrol partisi trigliserida pada jaringan adipose dan otot sehingga meningkatkan penyimpanan lemak atau menyediakan energi dalam bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot (Ren et al. 2002; Dunner et al. 2013). Identifikasi keragaman gen LCAT dan LPL diperlukan dalam rangka mencari penanda genetik (genetic marker) yang dapat digunakan sebagai Marker Assisted Selection (MAS) untuk menghasilkan dan mengembangkan dombadomba lokal yang mampu menghasilkan daging yang aman dan sehat untuk dikonsumsi. Perumusan Masalah Kualitas lemak daging mempengaruhi penilaian konsumen terhadap daging masak. Pada umumnya lemak mengandung gliserol ester, kolesterol, phospholipid dan asam lemak. Lemak disusun atas rangkaian asam lemak yang dikelompokkan ke dalam 3 kategori berdasarkan ikatan rangkap yang dimilikinya yaitu asam lemak jenuh (ALJ), asam lemak tak jenuh tunggal (ALTJT) dan asam lemak tak jenuh ganda (ALTJG). Timbunan lemak pada otot ditentukan oleh keseimbangan dari proses yang berlangsung dalam tubuh. Keseimbangan proses ini juga dipengaruhi oleh jumlah lemak yang dimakan. Proses pembentukan lemak dan deposisi lemak di dalam tubuh dipengaruhi oleh peran serangkaian enzim yang saling bekerja sama di dalam tubuh. Enzim disandikan oleh gen penyandi. Setiap mutasi yang muncul pada suatu gen dapat mempengaruhi fungsi dari protein yang disandikan dan atau tidak dapat menghasilkan protein yang disandikan. Keaneka ragaman rumpun domba lokal Indonesia berpotensi memiliki gen-gen potensial yang perlu dieksplorasi lebih

23 3 lanjut. Eksplorasi keragaman gen-gen potensial yang berpengaruh terhadap kualitas marbling sapi ciamis dan sapi PO telah dilaporkan Hilmia (2013) melalui keragaman gen steoryl CoA desaturase, namun keragaman gen belum mempengaruhi profil asam lemak. Eksplorasi terhadap keragaman gen-gen potensial terhadap kualitas marbling domba lokal Indonesia belum pernah dilaporkan selama ini. Diantara gen yang diduga berhubungan dengan kualitas marbling adalah LCAT dan LPL. Alur kerangka berpikir penelitian disajikan pada Gambar 1.1. Gambar 1.1 Alur kerangka berpikir penelitian Tujuan Penelitian Tujuan penelitian ini adalah: 1. Mengidentifikasi keragaman gen LCAT pada domba lokal Indonesia 2. Mengidentifikasi keragaman gen LPL pada domba ekor tipis sumatera dan domba garut 3. Menganalisis hubungan perbedaan genotipe gen LPL terhadap kualitas marbling otot longissimus dorsi domba garut. Manfaat Penelitian Keluaran dari penelitian ini adalah; 1. Menginformasikan keragaman gen LCAT dan gen LPL pada domba lokal Indonesia sebagai salah satu upaya dalam mengeksplorasi sumber daya genetik domba lokal Indonesia yang dapat dijadikan sebagai data base dalam pengembangan domba lokal Indonesia di masa yang akan datang. 2. Ditemukannya penanda genetik penentu kualitas lemak intramuskuler daging domba yang dapat dijadikan sebagai Marker Assisted Selection (MAS) dalam menghasilkan ternak domba dengan kualitas lemak intramuskuler yang baik.

24 4 3. Dalam jangka panjang dapat membentuk breed domba lokal yang menghasilkan daging yang menyehatkan. Hipotesis Hipotesis dalam penelitian ini adalah: 1. Adanya keragaman genotipe gen LCAT dan gen LPL pada domba lokal Indonesia. 2. Keragaman genotipe gen LCAT dan gen LPL akan memberikan pengaruh yang berbeda terhadap kandungan lemak total, kolesterol dan profil asam lemak otot longissimus dorsi domba garut.

25 5 2 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LECITHIN CHOLESTEROL ACYLTRANSFERASE PADA DOMBA LOKAL INDONESIA Abstrak Lecithin cholesterol acyltransferase (LCAT) adalah soluble enzyme yang mampu mengonversi kolesterol dan lesitin menjadi ester kolesterol dan lisolesitin pada permukaan high density lipoprotein dan berperan dalam metabolisme lipoprotein. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi single nucleotide polymorphisms (SNPs) gen LCAT pada domba lokal Indonesia. Total 118 DNA genom domba lokal Indonesia, terdiri dari domba ekor tipis sumatera (43 ekor); domba garut (19 ekor); domba ekor tipis jawa (17 ekor); domba ekor gemuk jawa (6 ekor), domba pulau rote (7 ekor); domba kissar (7 ekor); domba sumbawa (10 ekor) dan domba lembah palu (9 ekor) digunakan dalam penelitian ini. Amplifikasi DNA genome menggunakan Polymerase Chain Reaction pada fragment ekson 6 gen LCAT menghasilkan amplikon dengan panjang 250 bp dan metode direct sequencing digunakan untuk mengidentifikasi keragaman sekuens. Hasil sekuens dianalisis menggunakan software Bioedit dan MEGA 5.2. Kemudian sekuens disejajarkan dengan metode Clustal W dan selanjutnya diblast dengan gene bank nomor akses GQ Hasil penelitian menunjukkan ditemukan tiga SNPs baru yaitu pada posisi basa c.742 C>T, c.770 T>A dan c.882 C>T. Substitusi sitosina menjadi timina c.742 merupakan synonymous mutation; timina menjadi adenina c.770 dan sitosina menjadi timina c.883 merupakan non synonymous mutation. Kata kunci: Domba, gen LCAT, PCR, sekuens, SNPs Abstract Lecithin Cholesterol Acyltransferase (LCAT) was a soluble enzyme that converted cholesterol and lecithin to cholesteryl esters and lysolecithins on the surface of high density lipoprotein and played in lipoprotein metabolism. The research was aimed to explore single nucleotide polymorphisms (SNPs) of LCAT gene in Indonesian local sheeps. A total of 118 genomic DNA of Indonesian local sheeps used in this study, consisted of sumatran thin tail ed sheep (43 heads); garut sheep (19 heads); javanese thin tail ed sheep (17 heads); javanese fat tail ed sheep (6 heads), rote island sheep (7 heads); kissar sheep (7 heads); sumbawa sheep (10 heads) and lembah palu sheep (9 heads). Polymerase chain reaction was used to amplify genomic DNA for exon 6 (250 bp) and direct sequencing method was used to identify polymorphism sequences. The results of sequence were analyzed with BioEdit and MEGA 5.2 software. The sequences were aligned with Clustal W method and BLAST sequence obtained from Gene Bank with accession number GQ The results were showed three novel SNPs, i.e. c.742c>t, c.770 T>A dan c.882 C>T. Substitution cytosine to thymine c.742 is a synonymous mutation; thymine to adenine c.770 and cytosine to thymine c.882 are non synonymous mutation. Key words: LCAT gene, PCR, sequences, sheeps, SNPs

26 6 Pendahuluan Domba merupakan salah satu ternak potong yang memiliki nilai penting bagi masyarakat Indonesia terutama dalam menyediakan daging segar, hewan kurban (Inounu 2011), sosial, budaya dan sumber gen yang digunakan dalam memperbaiki mutu ternak lokal melalui persilangan diantara ternak lokal atau dengan bangsa eksotik lainnya (Sumantri et al. 2007). Menurut FAO (2002), ternak lokal penting dilindungi karena telah beradaptasi dengan lingkungan setempat, dapat bertahan pada kondisi pakan seadanya dan lebih tahan terhadap penyakit dan parasit. Domba lokal Indonesia memiliki keragaman yang tinggi berdasarkan karakter morfometrik (Sumantri et al. 2007), keragaman DNA mikrosatelit (Sumantri et al. 2008a dan Jakaria et al. 2012). Domba merupakan salah satu ternak potong di Indonesia. Berkembangnya persepsi di masyarakat bahwa daging domba mengandung kolesterol dan kandungan asam lemak jenuh (ALJ) tinggi, harga yang relatif mahal, bau daging yang kurang diminati dan sulit untuk dihilangkan merupakan faktor-faktor yang diduga sebagai penyebab rendahnya konsumsi daging domba secara Nasional yaitu sekitar 5% atau setara dengan 0.24 g/kapita/tahun. Konsumsi makanan dengan kandungan kolesterol dan asam lemak jenuh tinggi ditenggarai sebagai pemicu penyakit jantung. Kromhout et al. (1995), telah melaporkan bahwa konsumsi makanan mengandung asam lemak jenuh dan kolesterol yang tinggi merupakan faktor penting penentu angka penderita penyakit jantung pada 9 negara. Kandungan lemak tubuh ternak meningkat di antara awal pertumbuhan sampai saat dipotong dan proporsi asam lemak juga turut berubah (Wood et al. 2008). Kandungan ALJ dan asam lemak tak jenuh tunggal (ALTJT) meningkat sangat cepat seiring dengan peningkatan lemak, berbeda dengan asam lemak tak jenuh ganda (ALTJG) cenderung menurun sehingga rasio ALTJG:ALJ juga akan menurun (Smeet et al. 2004). Berbeda dengan daging dengan kandungan lemak sedikit (lean), proporsi ALTJG mayor lebih tinggi (Wood et al. 2008). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa kandungan kolesterol dan asam lemak diatur oleh gen-gen fungsional. Lecithin Cholesterol Acyltransferase (LCAT) adalah enzim kunci yang berperan dalam katabolisme ekstra seluler dari lipoprotein darah, disintesis di hati dan disekresikan ke dalam plasma darah. Enzim ini bekerja mengonversi kolesterol dan lesitin menjadi ester kolesterol dan lisolesitin pada permukaan high density lipoprotein (HDL), terutama dalam proses reverse cholesterol transport (Kaplanova et al. 2010; Crisa et al. 2010; Qiao et al. 2010). Defisiensi enzim ini ditenggarai dapat mengakibatkan akumulasi kolesterol bebas di dalam darah dan jaringan (Klein et al. 1993; Kaplanova, et al. 2010; Qiao et al. 2010). Metabolisme Kolesterol dan Peran Lecithin Cholesterol Acyl Transferase Kolesterol di dalam tubuh berasal dari pakan dan sintesis de novo pada hati dan jaringan lainnya. Kolesterol ditemukan dalam bentuk kolesterol bebas atau kombinasi kolesterol dengan asam lemak rantai panjang (long chain fatty acid) dalam bentuk kolesterol ester. Lipoprotein memiliki peranan utama dalam metabolisme kolesterol (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Reaksi LCAT terhadap lipoprotein melewati beberapa tahapan yaitu dimulai dengan pengikatan enzim

27 7 terhadap permukaan lipid, diikuti dengan aktivasi LCAT oleh apolipoprotein, pengikatan substrat lipid dan tahapan katalitik yang mengakibatkan peningkatan produk lipid (Jonas 2000). Kolesterol masuk ke jaringan melalui low density lipoprotein (LDL) dan dipindahkan dari jaringan oleh HDL melalui mekanisme reverse cholesterol transport dengan bantuan enzim LCAT (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Saat HDL menerima kolesterol dari membran sel, kolesterol bebas mengalami esterifikasi oleh LCAT. Terdapat dua mekanisme yaitu HDL memindahkan kolesterol bebas dan ester kolesterol ke hati dan kolesterol bebas dan ester kolesterol dibentuk menjadi very low density lipoprotein (VLDL) melalui CETP (Cholesterol Ester Transfer Protein). VLDL yang mengalami hidrolisis dengan perantaraan LPL menjadi LDL. Kolesterol LDL dibuang dari darah melalui interaksi dengan reseptor LDL. Kejadian ini memungkinkan kolesterol masuk ke dalam sel jaringan (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Mekanisme peranan LPL dan LCAT dalam transpor lemak dan kolesterol dalam tubuh ternak dijelaskan pada Gambar 2.1. Gambar 2.1 Peranan LPL dan LCAT dalam transpor lemak dan kolesterol dalam tubuh ternak (Sumber: lipoprot/ index.htm) Struktur, Letak dan Fungsi Gen LCAT Enzim LCAT dikodekan oleh gen LCAT, pada domba terletak pada kromosom ke 14 ( Gen LCAT terdiri atas 6 ekson dan 5 intron. Struktur gen LCAT disajikan pada Gambar 2.2. Ekson enam merupakan ekson yang paling panjang yaitu 559 bp (Gene Bank nomor akses GQ ). Gambar 2.2 Struktur gen LCAT, terdiri atas 6 ekson (I, II,III, IV, V dan VI) dan 5 intron

28 8 Beberapa penelitian telah melaporkan adanya keragaman gen LCAT pada ternak yang berhubungan dengan sifat-sifat produksi yaitu pada babi (Kaplanova et al. 2010; Qiao et al. 2010); domba (Crisa et al. 2010; Moioli et al. 2012). Crisa et al. (2010) menemukan adanya satu SNP pada intron 2 g.181 T>C dan 2 SNPs pada exon 6 c.806 G>A dan c.1075 T>C. Mutasi ini berhubungan negatif dengan asam lemak jenuh ganda C 18:2 (asam lemak linoleat) dan berhubungan positif dengan produksi dan kandungan asam lemak jenuh stearat pada susu domba (Crisa et al. 2010; Moioli et al. 2012). Qiao et al. (2010) melaporkan satu SNP pada posisi intron 1 g.266 C>G berhubungan sangat nyata dengan beberapa karakteristik karkas pada babi. Single nucleotide polymorphism merupakan variasi yang muncul pada sekuen DNA ketika satu nukleotida (A, T, C atau G) berbeda dari sekuen pada umumnya. SNP digunakan untuk mengetahui keragaman suatu gen dan frekuensi genotipe yang muncul pada suatu populasi ternak. Asosiasi keragaman SNP dengan sifat-sifat yang memiliki nilai ekonomis dan memiliki arti penting untuk menemukan penanda genetik (genetic marker) yang dapat digunakan dalam seleksi genom. Seleksi genom digunakan untuk memprediksi nilai pemuliaan (breeding value) untuk sifat-sifat kuantitatif pada ukuran populasi yang kecil dan akurasi terhadap Estimated Breeding Value (EBV) rendah. Seleksi genom dapat ditingkatkan melalui eksplorasi SNPs pada kandidat lokus dan memperkirakan pengaruh SNPs pada populasi yang berbeda (Dunner et al. 2013). Langkah awal yang dapat dilakukan adalah melakukan eksplorasi dan identifikasi keragaman gen-gen potensial yang diasumsikan berhubungan dengan sifat-sifat yang diinginkan. Eksplorasi keragaman gen LCAT pada domba lokal Indonesia merupakan upaya untuk menemukan Marker Assisted Selection (MAS) untuk memproduksi dan mengembangkan domba lokal Indonesia di masa yang akan datang. Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Pengambilan sampel darah domba ekor tipis sumatera dilakukan di Kecamatan Koto Tangah Kota Padang, Sumatera Barat pada bulan Oktober 2012 dan pengambilan sampel darah domba garut dilakukan di Kandang B Fakultas Peternakan IPB Bogor pada bulan Juni Ekstraksi dan amplifikasi PCR dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB dari bulan Oktober 2012 s/d Juni Identifikasi keragaman segmen gen LCAT ekson 6 dilakukan dengan metode direct sequencing dengan mengirimkan sampel ke First Base Laboratory Juni s/d Agustus Materi Sampel darah domba lokal Indonesia sebanyak 57 sampel darah terdiri dari 43 sampel domba ekor tipis sumatera berasal dari Kecamatan Koto Tangah Padang, Sumatera Barat dan 14 sampel domba garut (Jawa Barat) diambil pada bagian vena jugularis menggunakan venojact. Darah disimpan dalam tabung 5 ml dan ditambahkan ethanol absolut. Selain itu juga digunakan 61 koleksi DNA domba Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB terdiri dari domba garut, Jawa Barat (garut-margawati tipe pedaging 5); ekor tipis jawa-

29 9 Jawa Barat (Jonggol, 7; MT Farm Bogor, 10); ekor gemuk jawa-jawa Timur (Situbundo, 6); Pulau Rote (7); Kissar (7); Sumbawa-Nusa Tenggara Barat (10) dan Lembah Palu (9). Total DNA yang diuji dalam penelitian ini adalah 118 sampel domba lokal Indonesia. Ekstraksi DNA Ektraksi DNA menggunakan metode Phenol-chloroform technique (Sambrook et al. 1989) yang telah dimodifikasi. Sebanyak 200 µl sampel darah dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml lalu ditambahkan 1000 µl delution water, divortex dan didiamkan selama ± 20 menit pada suhu ruang. Selajutnya proses presipitasi dengan cara disentrifugasi pada kecepatan rpm selama 5 menit. Larutan supernatan yang terbentuk dibuang dan ditambahkan 200 µl 1 x sodium tris EDTA (1 x STE), 40 µl sodium dosesil sulfate (SDS) 10% dan 20 µl Proteinase K (5 mg/ml). Larutan selanjutnya dikocok perlahan pada suhu 55 0 C selama 2 jam. Kemudian ditambahkan larutan phenol 400 µl, 400 µl chloroform:isoamyl alcohol = 24:1 (CIAA) dan 40 µl NaCl 5 M. Tabung selanjutnya dikocok pada suhu ruang selama 1 jam dan disentrifugasi selama 5 menit. Larutan bening selanjutnya dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru dan ditambahkan 800 µl ethanol absolute, 40 µl NaCl 5 M, dan disimpan pada suhu - 20 o C selama semalam. Selanjutnya larutan disentrifugasi pada kecepatan rpm selama 5 menit, supernatan yang terbentuk dibuang lalu tabung didiamkan dalam keadaan terbuka sampai alkohol yang ada pada tabung hilang. Selanjutnya ditambahkan 100 µl TE (Tris EDTA) 80% pada tabung tersebut dan disimpan pada suhu C. Amplifikasi Gen LCAT Ekson 6 dengan Polymerase Chain Reaction Sampel DNA diamplikasi menggunakan mesin PCR GeneAmp PCR sistem 9700 dan Master Cycler Personal Eppendorf, menggunakan primer yang dirancang sendiri menggunakan program Primer Blast dari NCBI ( dengan referensi yang digunakan adalah gen bank nomor akses GQ Primer forward yang digunakan adalah F 5- GAGCAGCGCATGACGACAACG-3 dan primer reverse F 5- AGGTGCTAGGAGTGGGCAGGC-3. Posisi primer forward dan primer reverse pada sekuens GenBank GQ mengapit pada fragment ekson 6 gen LCAT pada posisi basa ke 701 sampai 950 dengan panjang product 250 bp (Gambar 2.3). Setiap reaksi PCR terdiri dari 50 ng (2 3 µl) DNA template, 0.25 µm primer forward and reverse, 12.5 µl Dream Tag Green Master Mix dari Thermo Scientific #K1081 ditambah dengan dh 2 O hingga 25 µl. Kondisi mesin PCR diatur dengan suhu denaturasi awal pada 95 0 C selama 5 menit dan diikuti dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 0 C selama 30 detik, annealing pada suhu 62 0 C selama 45 detik dan ekstensi pada suhu 72 0 C selama satu menit. Ekstensi akhir dilakukan pada suhu 72 0 C selama 5 menit. Hasil dari PCR kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarose (1.5% agarose/0.5x TBE) menggunakan 200 ng/ml ethidhium bromide (EtBr). Penentuan panjang produk menggunakan ladder marker 100 bp. Elektroforesis berlangsung pada tegangan 100 volt selama 30 menit. Selanjutnya visualisasi gel menggunakan UV transilluminator untuk mengetahui berhasil atau tidaknya

30 10 proses amplifikasi primer pada gen target. Selanjutnya produk PCR dikirim ke First Base Laboratory Singapore untuk analisis direct sequencing menggunakan Dideoxy Sequencing ABI 3730 XL Automated DNA Sequencer. Gambar 2.3 Amplikon gen LCAT (gen bank nomor akses GQ ) dengan panjang 250 bp mengapit sekuens gen LCAT c.701-c.950 merupakan bagian dari ekson 6. Primer ditandai dengan garis bawah, bold dan italic. Analisis Data Hasil sekuens fragmen gen LCAT ekson 6 dianalisis menggunakan BioEdit (Hall 2011) dan MEGA versi 5.2 (Kumar et al. 2004) menggunakan metode Clustal W. Selanjutnya hasil sekuens disejajarkan menggunakan BLAST (Basic Local Aligmnet Search Tool) dengan sekuens Gene Bank nomor akses GQ POP GENE ver.1.31 (Yeh et al. 1999) software untuk menghitung frekuensi gen, frekuensi genotipe, uji chi kuadrat dan nilai heterosigositas pada setiap titik mutasi. Rumus untuk menghitung frekuensi gen dan frekuensi genotipe menurut Nei dan Kumar (2000) yaitu; Keterangan: x i = Frekuensi gen ke-i x j = Frekuensi gen ke-j = Jumlah sampel dengan genotipe ii = Jumlah sampel dengan genotipe ij N = Jumlah sampel Frekuensi genotipe dihitung menggunakan rumus: Keterangan: = Frekuensi genotipe ke-ii = Frekuensi genotipe ke-jj = Frekuensi genotipe ke-ij ; ;

31 11 Penyimpangan frekuensi genotipe yang muncul dari keseimbangan Hardy- Weinberg dianalisis menggunakan chi square test ( ) berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000); Keterangan: = chi square test O = Frekuensi genotipe sampel yang diamati E = Frekuensi genotipe harapan Nilai heterosigositas pengamatan (H o ) dan harapan (H e ) dihitung menggunakan POPGENE 32 versi 1.31 software (Yeh et al. 1999): Keterangan: = Heterosigositas observasi = Heterosigositas harapan = Ukuran populasi efektif = Frekuensi genotipe AiAj, populasi ke-k Hasil dan Pembahasan Single Nucleotide Polymorphisms Gen LCAT Ekson 6 Pada Domba Lokal Indonesia Hasil amplifikasi DNA pada fragmen gen LCAT (Gambar 2.4), menghasilkan amplikon dengan panjang 250 bp, yang mengapit sekuens gen LCAT pada posisi basa ke 701 sampai 950 bp merupakan sebagian dari ekson 6 (Lampiran 1). Hasil aligment 118 sekuens gen LCAT domba lokal Indonesia dengan sekuens gen bank nomor akses GQ (Lampiran 1), menunjukkan 3 titik mutasi baru yaitu pada posisi basa c.742 C>T, c.770 T>A dan c.882 C>T. Tiga SNPs ini membentuk 9 diplotipe (Gambar 2.5) dan tersebar pada 8 rumpun domba lokal Indonesia. Tiga diplotipe dengan frekuensi yang tinggi adalah diplotipe H1H1 (66.10%), H1H3 (16.10%) dan H1H5 (5.08%) (Tabel 2.1). Tiga SNPs yang ditemukan dalam penelitian ini merupakan SNPs baru yang belum pernah dilaporkan oleh peneliti lain. Keragaman gen LCAT pada domba lokal Indonesia bersifat polimorfik pada 6 rumpun yaitu domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa, domba ekor gemuk jawa, domba lembah palu dan domba pulau rote dan monomorfik pada rumpun domba kissar dan domba sumbawa. Mutasi transisi pada posisi basa c.742, substitusi sitosina menjadi timina merupakan synonymous mutation, tidak merubah asam amino alanina (Ala>Ala) (Gambar 2.6). Mutasi ini ditemukan pada diplotipe H2H2 (4 ekor) dan H4H10 (1 ekor), yang tersebar pada domba ekor tipis sumatera (2 ekor); domba garut (2 ekor) dan domba lembah palu (1 ekor). Genotipe heterozigot (CT) ditemukan

32 12 pada H1H2 dan H1H4 pada domba ekor tipis sumatera (1 ekor) dan domba ekor tipis jawa (4 ekor). Menurut Komar (2007), secara alami, munculnya silent SNP bisa menyandikan sintesis protein dengan sekuens asam amino yang sama, namun dapat mengakibatkan struktur dan fungsi protein yang disandikan berbeda. Mutasi transversi yang muncul pada posisi basa c.770 yaitu subsitusi timina menjadi adenina dan mutasi transisi pada posisi basa c.882 yaitu subsitusi sitosina menjadi timina (Gambar 7) merupakan non-synonymous mutation, dimana perubahan basa mengakibatkan perubahan penilalanina menjadi isoleusina (Phe>Ile) dan alanina menjadi valina (Ala>Val). Non-synonymous SNPs (nssnps), dapat merubah susunan asam amino yang berdampak pada perubahan protein yang terbentuk, pada manusia umumnya berhubungan dengan penyakit keturunan (Bao dan Cui 2005) M bp Gambar 2.4 Hasil amplifikasi PCR gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia dengan panjang produk 250 bp; M= DNA ladder 100 bp; 01, = kode sampel domba ekor tipis sumatera Tabel 2.1 Diplotipe gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia Posisi Mutasi Jumlah individu Frekuensi (%) Diplotipe c.742 c.770 c.882 H1H1 CC TT CC 78 66,10 H1H2 CT TT CC 3 2,54 H1H3 CC AT CC 19 16,10 H1H4 CT AT CC 2 1,69 H1H5 CC TT CT 6 5,08 H2H2 TT TT CC 4 3,39 H3H5 CC AT CT 4 3,39 H4H10 TT AT CT 1 0,85 H5H6 CC AT TT 1 0,85 Total SNP pada posisi c.770, tidak ditemukan domba dengan genotipe AA. Heterozigot AT ditemukan pada 5 diplotipe yaitu; H1H3; H3H5; H5H6; H1H4 dan H4H10, tersebar pada rumpun domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis

33 13 jawa, domba lembah palu, domba ekor gemuk jawa dan domba garut. Genotipe TT ditemukan pada empat diplotipe yaitu H1H1, H1H2, H1H5 dan H2H2. SNP pada posisi basa c.882 membentuk 3 genotipe (CC, CT dan TT). Genotip CC ditemukan pada 106 individu dengan 5 diplotipe yaitu H1H1, H1H2, H1H3, H1H4 dan H2H2. Genotipe CT ditemukan pada 3 diplotipe yaitu. H1H5, H3H5 dan H4H10, dimana genotipe TT hanya ditemukan pada satu diplotipe H5H6. Potensi munculnya variasi sekuens nukleotida menghasilkan synonymous mutation dan nonsynonymous mutation bervariasi antara satu gen dengan gen lainnya (Nei dan Kumar 2000). Gambar 2.5 Aligment sekuens gen LCAT ekson 6 domba lokal Indonesia Hasil penelitian menunjukkan bahwa penyebaran SNPs gen LCAT pada domba lokal Indonesia ditemukan pada 6 sub populasi, kecuali Kissar dan Sumbawa yang menujukkan monomorfik. Keragaman gen yang tinggi ditemukan

34 14 pada kelompok domba ekor tipis (domba ekor tipis sumatera dan domba ekor tipis jawa), diikuti domba garut dan domba ekor gemuk jawa. Crissa et al. (2010) melaporkan 3 SNPs pada gen LCAT pada 3 bangsa domba (altamurana, gentile di puglia dan sarda) yaitu pada posisi basa g.181 T>C, c.806 G>A dan c.1075 T>C, dengan keragaman gen yang relatif rendah. Keterangan: SNP pada posisi basa c.742 C>T merupakan synonymous mutation (Ala>Ala) Keterangan: SNP pada posisi basa c.770 T>A merupakan non synonymous mutation (Phe>Ile) Keterangan: SNP pada posisi basa c.882 C>T merupakan non synonymous mutation (Ala>Val) Gambar 2.6 Potongan sekuens gen LCAT ekson yang menunjukkan terjadinya mutasi pada posisi basa c.742, c.770 dan c.882 Setiap mutasi yang muncul berpengaruh terhadap satu atau lebih peranan protein yang disandikan. Peranan protein yang mungkin dipengaruhi oleh mutasi yang timbul adalah stabilitas atau folding protein, ligand binding protein, katalisis, regulasi dengan allosteric dan mekanisme lainnya serta modifikasi post translational protein (Wang dan Moult 2001; Teng et al. 2008). Namun, peranan 3 titik mutasi gen LCAT ekson 6 pada domba lokal Indonesia belum diketahui. Crissa et al. (2010) menemukan 2 titik mutasi pada ekson 6 yaitu pada posisi basa c.806 (G>A) dan c.1075 (T>C). Mutasi pada posisi basa c.806 merupakan nonsynonymous mutation (Asp>Asn), yang berpengaruh terhadap rasio asam lemak tak jenuh C 18:2 (linoleat) dan C 18:3 (linolenat) pada susu domba (Crissa et al. 2010)

35 15 dan menurunkan produksi susu dan berpengaruh terhadap kandungan asam lemak stearat dan oleat (Moili et al. 2012). Mutasi pada bagian intron 1 gen LCAT c.266 G>C pada babi berhubungan dengan peningkatan kandungan kolesterol darah babi (Kaplanova et al. 2010). Menurut Uchida et al. (1995) bahwa penurunan aktivitas LCAT mengakibatkan penurunana fertilitas pada induk sapi yang berhubungan dengan fatty liver karena esterifikasi kolesterol oleh LCAT, penting untuk transpor kolesterol dari hati ke jaringan peripheral, seperti corpus luteum dan karena kolesterol merupakan sumber bagi sintesis progesteron. Hasil penelitian in vivo menunjukkanbahwa aktivasi LCAT oleh Apo A-I, namun mekanisme pastinya belum diketahui (Rousset et al. 2010) Insersi adenina menghasilkan frameshift mutation pada posisi basa g.214 pada manusia, mengubah dalam porsi yang besar enzim LCAT yang dihasilkan, yaitu daerah protein dan aktivitas putative lipase (Bender et al. 2007). Dua titik mutasi yang ditemukan pada manusia yaitu mutasi frameshift pada asam amino ke-83 (tirosina) menyebabkan terpotongnya enzim pada asam amino ke-82 yang menyebabkan jika disekresikan enzim tersebut, namun tidak dapat berfungsi secara normal. Perubahan asam amino ke 156 (Tyr>Asn) membentuk amphipathic helix yaitu residu dalam fase hydrophobic menghasilkan ph yang rendah. LCAT berperan penting pada formasi dan pematangan HDL dan pada tahapan intra vascular yaitu pada tahapan reverse cholesterol transpor (Savel et al. 2012). Frekuensi Gen, Frekuensi Genotipe dan Nilai Heterosigositas Gen LCAT Ekson 6 Domba Lokal Indonesia Keragaman genetik dalam populasi dapat diketahui melalui dua ukuran keragaman yaitu proporsi polimorfisme gen dalam populasi dan rata-rata proporsi individu heterozigot dalam setiap lokus (Nei dan Kumar 2000). Identifikasi keragaman genetik digunakan untuk mengetahui dan melestarikan bangsa-bangsa pada populasi terkait dan kaitannya dengan sifat-sifat tertentu untuk menjamin keamanan dan ketersediaan bahan pangan yang berkesinambungan (Blott et al. 1998); mempelajari genetika populasi dan genetika evolusi (Nei dan Kumar 2000); dapat digunakan dalam menentukan hubungan antar sub populasi yang terfragmentasi dalam suatu species (Hartl dan Clark 1997) dan dapat mendeteksi alel-alel positif yang berhubungan dengan sifat-sifat yang diinginkan (Sumantri et al. 2011). Keragaman genetik antara sub populasi dapat diketahui melalui persamaan atau perbedaan frekuensi gen atau frekuensi alel diantara sub populasi (Li et al. 2000). Frekuensi gen atau frekuensi alel adalah ukuran frekuensi relatif dari gen atau alel pada suatu populasi (Nei dan Kumar 2000). Frekuensi alel menunjukkan keragaman genetik dari sebuah populasi spesies atau equivalent dengan kekayaan/keragaman gen tersebut pada poolnya. Hasil analisis menunjukkan keragaman gen yang tinggi pada lokus c.742 (Tabel 2.2), ditemukan pada domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa, domba garut dan domba lembah palu. Frekuensi gen C merupakan gen dominan dengan kisaran antara 88.20% % dengan nilai rataan 95.70% dan frekuensi gen T berkisar 1.20 % %, yang mengindikasikan lokus tersebut polimorfik (Tabel 2.2). Nilai rataan frekuensi genotipe CC (94.10%) lebih tinggi dibandingkan CT (3.20%) dan TT (2.70%). Genotipe CC merupakan genotipe

36 16 dominan yang ditemukan pada semua rumpun domba. Frekuensi genotipe lokus SNP c.742 berada pada ketidak seimbangan Hardy-Weinberg pada domba ekor tipis sumatera, domba garut dan domba lembah palu (P<0.01), kecuali pada domba ekor tipis jawa berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg (P>0.05). Hal ini diperkuat dengan hasil penghitungan nilai heterosigositas yang didapat pada rumpun domba ekor tipis sumatera, garut dan lembah palu, dimana nilai heterosigositas harapan lebih besar dibandingkan nilai heterosigositas pengamatan. Nilai heterosigositas pengamatan lebih kecil dibandingkan nilai heterosigositas harapan mengindikasikan telah terjadi perkawinan berkerabat yang intensif pada populasi tersebut (Tombasco et al. 2003) Penyimpangan frekuensi genotipe dalam suatu populasi dapat disebabkkan karena adanya mutasi, migrasi, perkawinan terarah, seleksi dan jumlah sampel yang relatif kecil. Suatu populasi berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg jika frekuensi genotipe dan frekuensi gen tetap dari satu generasi ke generasi berikutnya (Nei dan Kumar, 2000; Noor 2004). Mutasi transversi pada posisi basa c.770, ditemukan 2 genotipe yaitu genotipe AT dan TT kecuali pada domba kissar dan domba sumbawa hanya satu genotipe (TT). Nilai rataan frekuensi genotipe TT (80.70%) lebih tinggi dibandingkan genotipe AT (19.30%) dan AA (0.00%). Tingginya frekeunsi genotipe TT menghasilkan tingginya kisaran frekuensi gen T (76.50% %), dimana frekuensi genotipe berada dalam keseimbangan Hardy Weinberg pada lokus SNP c.742 ini sejalan dengan hasil analisis keseimbangan Hardy-Weinberg yang menunjukkan semua populasi berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg (P>0.05) dan nilai heterosigositas observasi dan harapan relatif sama (Tabel 2.3). Mutasi transisi pada posisi basa c.882 C>T ditemukan pada rumpun domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa, domba garut dan domba pulau rote. Rataan frekuensi genotipe CC (89.60%) lebih tinggi daripada CT (9.80%) dan TT (0.7%) (Tabel 2.4). Berdasarkan uji keseimbangan Hardy-Weinberg pada empat rumpun domba, frekuensi genotipe berada dalam ketidak seimbangan Hardy- Weinberg (P<0.01) pada rumpun domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa dan domba garut, kecuali pada rumpun domba pulau rote. Hasil ini sejalan dengan hasil penghitungan nilai heterosigositas yang menunjukkan bahwa nilai heterosigositas observasi lebih rendah dibandingkan nilai heterosigositas harapan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ditemukannya keragaman gen LCAT ekson 6, pada domba lokal Indonesia kecuali pada sub populasi domba kissar dan domba sumbawa. Penyimpangan frekuensi genotipe pada posisi basa c.742 ditemukan pada domba ekor tipis sumatera, domba garut dan domba lembah palu dan pada posisi basa c.882 ditemukan pada domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa dan domba garut.

37 17 Tabel 2.2 Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan χ 2 test gen LCAT posisi basa c.742 domba lokal Indonesia Sub Populasi Jumlah Frekuensi Genotipe Frekuensi Gen Equilibrium Individu CC CT TT C T χ 2 test H o H e ETS ** ETJ ns EGJ Garut ** Lembah Palu ** Pulau Rote Kissar Sumbawa Nilai Rataan Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera; ETJ = ekor tipis jawa; EGJ = ekor gemuk jawa; ** = berbeda sangat nyata P<0.01 pada taraf α = 0.01; ns = tidak berbeda nyata P>0.05 pada taraf α = 0.05 Tabel 2.3 Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan χ 2 test gen LCAT posisi basa c.770 domba lokal Indonesia Sub Populasi Jumlah Frekuensi Genotipe Frekuensi Gen Equilibrium Individu AA AT TT A T χ 2 test H o H e ETS ns ETJ ns EGJ Garut ns Lembah Palu ns Pulau Rote ns Kissar Sumbawa Nilai Rataan Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera; ETJ = ekor tipis jawa; EGJ = ekor gemuk jawa; ns = tidak berbeda nyata P>0.05 pada taraf α =

38 Tabel 2.4 Frekuensi genotipe, frekuensi gen, nilai heterosigositas dan χ 2 test gen LCAT posisi basa c.882 domba lokal Indonesia Sub Frekuensi Genotipe Frekuensi Gen Equilibrium n Population CC CT TT C T χ 2 test H o H e ETS ** 0, ETJ ** 0, EGJ Garut ** Lembah Palu Pulau Rote ns Kissar Sumbawa Nilai Rataan , Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera; ETJ = ekor tipis jawa; EGJ = ekor gemuk jawa; ** = berbeda sangat nyata P<0.01 pada taraf α = 0.01; ns = tidak berbeda nyata P>0.05 pada taraf α =

39 19 Kecenderungan peternak untuk menjual jantan dewasa yang memiliki performan yang baik sebagai ternak potong, populasi yang tertutup, perkawinan tidak secara acak (selective mating) dan ukuran efektif populasi tidak seimbang diduga sebagai faktor yang menyebabkan rendahnya heterosigositas dalam suatu populasi. Menurut Sumantri et al. (2008b), nilai heterosigositas dipengaruhi oleh jumlah sampel, jumlah dan frekuensi alel serta marka genetik yang digunakan. Tingginya keragaman gen-gen yang dimiliki oleh domba lokal Indonesia telah dilaporkan diantaranya gen calpastatin (Sumantri et al. 2008b; Dagong et al. 2011) dan tidak adanya keragaman gen terdeteksi pada gen myostatin (Sumantri et al. 2011). Simpulan Hasil penelitian menemukan 3 SNPs baru gen LCAT ekson 6 pada domba lokal Indonesia yaitu pada posisi basa c.742 C>T; c.770 T>A dan c.882 C>T. Kombinasi 3 SNPs membentuk sembilan diplotipe. Substitusi sitosina menjadi timina c.742 pada posisi kodon ketiga (GCC>GCT) merupakan synonymous mutation (Ala>Ala); subsitusi timina menjadi adenina c.770 pada posisi kodon pertama (TTC>ATC) dan sitosina menjadi timina c.882 (GCA>GTA) pada posisi kodon kedua merupakan non-synonymous mutation mengakibatkan perubahan asam amino fenilalanina>isoleusina dan alanina>valina. Ketiga SNPs yang ditemukan merupakan SNPs baru yang belum dilaporkan pada populasi domba lainnya. Keragaman gen LCAT ekson 6 ditemukan pada rumpun domba ekor tipis sumatera, domba ekor tipis jawa, domba ekor gemuk jawa, domba garut, domba lembah palu dan domba pulau rote dan tidak ditemukan pada rumpun domba kissar dan domba sumbawa.

40 20 3 IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN LIPOPROTEIN LIPASE PADA DOMBA EKOR TIPIS SUMATERA DAN DOMBA GARUT ABSTRAK Liporotein lipase merupakan enzim kunci yang berperan dalam metabolisme dan transpor lipoprotein sehingga dapat meningkatkan level trigliserida darah. Lipoprotein lipase juga berfungsi mengontrol partisi trigliserida pada jaringan adipose dan otot sehingga dapat meningkatkan penyimpanan lemak dan menyediakan energi dalam bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot. Lipoprotein lipase (LPL) dikodekan oleh gen LPL. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi single nucleotide polymorphisms (SNPs) gen LPL. Total 66 DNA genom digunakan dalam penelitian ini, terdiri dari domba sumatera ekor tipis (50 ekor) dan domba garut (16 ekor). Amplifikasi DNA genom menggunakan metode polymerase chain reaction dan metode direct sequencing digunakan untuk mengidentifikasi keragaman sekuens. Selanjutnya sekuens disejajarkan dengan metode Clustal W dan pensejajaran sekuens dengan gen bank nomor akses X menggunakan program BioEdit dan program MEGA 5.2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ditemukan tiga SNPs baru yaitu pada posisi basa g.26, g.27 dan c.192. Insersi sitosina atau guanina pada basa ke 26 dan insersi guanina pada basa ke 27 merupakan frameshift mutation. Substitusi timina menjadi sitosina pada c.192 adalah non synonymous mutation (Val>Ala), ditemukan pada domba garut. Kata kunci: direct sequencing, domba, gen LPL, SNPs ABSTRACT Lipoprotein lipase is a key enzyme that plays in metabolism and transport lipoprotein as well as influence on blood triglyceride levels. Lipoprotein lipase controls triacyl glycerol partitioning between adipose tissue and muscle that increases fat storage or provides energi in the form of fatty acids for muscle growth. Lipoprotein lipase (LPL) is encoded by LPL gene. The research was aimed to explore single nucleotide polymorphisms of LPL gene. A total of 66 genomic DNA of Indonesian local sheeps, consisted of sumatera thin tail (50 heads) and garut (16 heads) sheeps were used in this study. Polymerase chain reaction was used to amplify genomic DNA and direct sequencing method was used to identify polymorphism sequences. The sequences were aligned with Clustal W method and BLAST sequence obtained from Gene Bank with accession number X The results showed three novel single nucleotide polymorphisms at g.26, g.27 and c.192. Insertion cytosine or guanine g.26 and insertion guanine g.27 were frame shift mutation. Substitution thymine to cytosine c.192 was a non synonymous mutation (Val>Ala), it was found in garut sheep. Keywords: direct sequencing, LPL gene, sheep, SNPs,

41 21 Pendahuluan Domba merupakan salah satu ternak potong yang memberikan kontribusi dalam penyediaan daging merah di Indonesia. Domba tersebar di beberapa wilayah Indonesia, hidup dan berkembang biak dengan baik di suatu wilayah sehingga membentuk karakteristik fenotipe khas membentuk rumpun, diantaranya adalah domba garut dan domba ekor tipis sumatera. Domba garut adalah domba yang berkembang di daerah Garut, Jawa Barat yang merupakan hasil persilangan dari domba ekor tipis jawa, domba kapstad dan domba merino. Domba kapstad merupakan domba ekor gemuk afrika (fat tailed africander) dari Afrika Selatan sedangkan domba merino diimpor dari Australia (Mason 1980). Pengembangan domba garut tidak terlepas dari kegiatan budaya berupa adu ketangkasan sehingga seleksi domba garut diarahkan untuk menghasil domba tangkas dan domba pedaging. Asal usul domba ekor tipis sumatera tidak diketahui jelas (Bradford dan Inounu 1996) dan diduga berasal dari domba ekor tipis jawa (Priyanto et al. 2000). Domba ekor tipis sumatera dicirikan dengan warna tubuh dan kepala dominan coklat muda di samping warna putih dan hitam dengan satu atau dua pola warna dengan ukuran tubuh relatif kecil (Sodiq dan Tawfik 2004) dan memiliki wol kasar, daya adaptasi terhadap iklim tropis basah tinggi, dapat dikawinkan sepanjang tahun dan lebih resisten terhadap beberapa penyakit walaupun memiliki tubuh yang lebih kecil karena pertumbuhannya lambat (Priyanto et al. 2000). Pengembangan domba ekor tipis sumatera lebih diarahkan sebagai ternak potong. Peranan lemak memberikan arti penting bagi penilaian konsumen terhadap daging yang akan dikonsumsi. Lemak memberikan pengaruh terhadap keempukan, juiciness, flavour serta kesehatan bagi yang mengkonsumsinya. Deposisi lemak dalam tubuh ternak dijumpai pada bagian visceral, subcutan, intermuscular dan intramuscular (marbling). Marbling merupakan bagian dari otot sehingga tidak dapat dipisahkan, berbeda dengan lemak pada bagian lainnya. Timbunan lemak pada otot ditentukan oleh keseimbangan dari proses yang berlangsung dalam tubuh termasuk lipogenic, lipolitic, transpor asam lemak dan jumlah asam lemak yang digunakan. Keseimbangan proses ini ditentukan oleh jumlah lemak yang dimakan, sintesis de novo asam lemak, sintesis triacylglycerol, degradasi lemak dan transport asam lemak (Zhao et al. 2010). Sifat-sifat yang mempengaruhi kualitas lemak seperti komposisi asam lemak, distribusi lemak, tipe serabut otot, sekitar 35% dipengaruhi oleh genetik (Williams 2008) dan sisanya dipengaruhi oleh faktor lingkungan seperti pakan. Kualitas lemak tubuh ditentukan oleh sekelompok enzim yang disandikan oleh gen. Enzim-enzim penentu kualitas dan deposisi lemak tubuh dapat dikelompokkan ke dalam 9 kelompok yaitu 1) enzim yang berfungsi dalam biosintesa asam lemak 2) enzim pembatas dalam katabolisme asam lemak 3) enzim yang berfungsi dalam metabolisme lemak dan jaringan lemak melalui ekspresi gen 4) enzim yang berfungsi dalam transpor asam lemak ke jaringan 5) enzim yang berperan dalam metabolisme lipoprotein terutama dalam proses reverse cholesterol transport 6) enzim yang berperan dalam penjenuhan asam lemak 7) enzim yang berperan dalam metabolisme dan fisiologi pertumbuhan 8) enzim pengatur terjadinya lipolisis dan menghambat lipogenesis dan 9) enzim

42 22 yang berperan dalam gluconeogenesis (Lee dan Hossner 2002; Scanes 2003; Zhao et al. 2010; Crissa et al. 2010; Kaplanova et al. 2010; Cheeke dan Dierenfeld 2010; Sevane et al. 2013). Salah satunya adalah enzim lipoprotein lipase. Mekanisme dan Fungsi Lipoprotein Lipase dalam Tubuh Ternak Lipoprotein merupakan bentuk transpor lemak dalam darah berupa kompleks protein lipid, terdiri atas empat tipe: kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL), dan high density lipoprotein (HDL) (Bender 1992; Bandara 1997; Cheeke dan Dierenfeld 2010). Lipoprotein terdiri dari kolesterol, trigliserida phospholipid dan apolipoprotein. Persentase masing-masing komponen pembentuk lipoprotein berbeda tergantung tipe lipoprotein yang terbentuk. Pada ternak ruminansia, lemak yang telah mengalami lipolysis oleh bakteri rumen (anaerovibrio lipolytica dan butyrivibrio fibrisolven) dan biohidrogenasi diserap melalui dinding rumen sedangkan asam lemak rantai panjang dan asam lemak jenuh hasil sintesis de novo dan lemak pakan yang lolos dari transformasi mikroba masuk ke usus halus (Jenkins 1994; Wina dan Susana 2013). Setelah masuk ke usus halus, asam lemak akan bergabung dengan lisolesitin dan garam empedu. Lisolesitin berfungsi sebagai pengemulsi lemak sehingga dapat diserap oleh dinding usus membentuk triasilgliserol. Triasilgliserol akan dilipolisis oleh enzim lipase pankreas menjadi monogliserol, digliserol dan asam lemak bebas. Monogliserol dan diasilgliserol pada bagian mucosa usus dirakit menjadi triasilgliserol. Triasilgliserol mengandung asam lemak dengan rantai karbon lebih dari 12. Triasilgliserol bersatu dengan protein membentuk kilomikron (Collier 1985; Cheeke dan Dierenfeld 2010). Kilomikron yang terbentuk disekresikan melalui sistem limfe dan masuk ke aliran darah. Kilomikron plasma darah masuk ke hati, jaringan adipose dan jaringan perifer ambing. Hati mengambil kilomikron langsung dari plasma darah sedangkan pada jaringan adipose dan jaringan ambing, kilomikron harus dipecah menjadi triasilgliserol dengan bantuan enzim lipoprotein lipase (LPL). Aktivasi enzim LPL dengan bantuan apoprotein C-II pada dinding kapiler. Melalui perantaraan enzim LPL, kilomikron melepaskan monoasilgliserol dan asam lemak bebas. Asam lemak bebas masuk ke dalam jaringan lemak dan otot yang dapat dipakai untuk pemenuhan energi melalui proses oksidasi atau sebagai cadangan energi (Gambar 3.1). Hati memiliki peranan penting dalam transpor dan metabolisme lemak. Fungsi hati yaitu 1) memfasilitasi pencernaan dan pencernaan lipid melalui sekresi bile 2) mensintesis dan mengoksidasi asam lemak 3) mengonversi asam lemak menjadi keton body 4) sintesis dan katabolisme lipoprotein (Giesecke 1983; Cheeke dan Dierenfeld 2010). Lipoprotein lipase diproduksi dalam jaringan adipose, jantung dan otot rangka. Lipoprotein lipase ditransfer ke permukaan endothelium kapiler, menghidrolisis trigliserida dari bentuk kilomikron menjadi VLDL. Lipoprotein lipase mengontrol partisi triasilgliserol antara jaringan adipose dan otot sehingga meningkatkan penyimpanan lemak atau menyediakan energi dalam bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot (Bonnet et al. 2000; Dunner et al. 2013). Lipoprotein lipase adalah enzim kunci yang berperan utama pada metabolisme dan transpor lipoprotein serta memberikan pengaruh penting pada level trigliserida darah (Wang et al. 2012).

43 23 Ac = asam asetat AcAc = asetoasetat BHB = β hidroksi butirat FA = asam lemak FFA = asam lemak bebas GI = gastrointestinal LP = lipoprotein TG = triasilgliserol Gambar 3.1 Transpor lemak ke jaringan (jaringan adipose, hati, otot rangka dan ginjal) pada ternak ruminansia dan non ruminansia (Sumber: Giesecke 1983) Gen yang bertugas sebagai pengatur transkripsi dari gen-gen yang mengontrol metabolisme, adipogenesis dan menjaga homeostatis di dalam tubuh adalah peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARG) dan peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha (PPARGC1A). Peroxisome proliferator activated receptor gamma berfungsi lipogenic dan adipogenic pada jaringan adiposit dan hepatosit serta berfungsi lipolisis karena merupakan promotor oksidasi asam lemak pada otot sehingga dapat menurunkaan ketersediaan lipid. Aktivasi gen LPL pada otot (Gambar 3.2) dimulai dengan aktivasi gen peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPARG) oleh sirtuin (SIRT1) dan peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha (PPARGC1A) pada saat kadar glukosa darah rendah dalam tubuh. PPARG akan memerintahkan gen LPL dan solute carrier family 2 member 4 (SLC2A4) untuk meningkatkan oksidasi asam lemak, pengambilan glukosa dan biogenesis pada mitochondria (Sevane et al. 2013). Perbedaan jenis jaringan lemak dan otot jantung tidak mengakibatkan terjadinya perbedaan ekspresi gen LPL pada domba, begitu juga perbedaan pemberian pakan (Bonnet et al. 2000).

44 24 Glukosa SIRT1 PPARG PPARGC1 LPL SLC2 A Gambar 3.2 Mekanisme aktivasi gen LPL pada otot, dimodifikasi dari Sevane et al. (2013). Struktur dan Letak Gen LPL Okisdasi Asam Lemak otot Gen LPL terdiri atas 10 exon, 9 intron (Gambar 3.3) pada domba terletak pada kromosom ke 2 ( Gambar 3.3 Struktur gen LPL terdiri atas 10 ekson (1, 2,3.10) dan 9 intron Keragaman gen LPL dan hubungannya dengan sifat-sifat produksi pada ruminansia telah dilaporkan pada domba (Bonnet et al. 2000; Crissa et al. 2010) sapi (Tank et al. 2012; Wang et al. 2012; Sevane et al. 2013), kambing (Badaoui et al. 2012; Qin et al. 2012) dan Yak (Ding et al. 2012). Identifikasi keragaman gen LPL pada domba lokal Indonesia belum pernah dilakukan. Berdasarkan hasil penelitian pada tahap 1, disimpulkan bahwa keragaman gen LCAT tinggi pada kelompok domba ekor tipis (domba ekor tipis sumatera dan ekor tipis jawa) dan domba garut. Berdasarkan penelitian pada tahap 1 dan ketersediaan sampel domba di lapangan, maka pada penelitian tahap 2 ini, identifikasi keragaman gen LPL dilakukan pada dua rumpun yaitu domba ekor tipis sumatera dan domba garut.

45 25 Bahan dan Metode Tempat dan Waktu Ekstraksi dan amplifikasi PCR dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak Fakultas Peternakan IPB dari bulan Oktober 2012 s/d Juni Identifikasi keragaman segmen gen LPL dilakukan dengan metode direct sequencing dengan mengirimkan sampel ke First Base Laboratory Juni s/d Agustus Materi Lima puluh sampel darah domba ekor tipis sumatera dan 16 ekor domba garut digunakan dalam penelitian ini. Total sampel DNA yang digunakan adalah 66 sampel. Amplifikasi DNA Menggunakan Metode PCR Amplifikasi fragmen gen LPL dari domba sumatera ekor tipis dan domba garut menggunakan metode PCR. Primer dirancang dengan bantuan program Primer Blast dari NCBI ( dengan nomor akses gen bank X Primer forward yang digunakan adalah F 5 AAACCTGCCGCTTCTAGCTC-3 dan primer reverse adalah F 5- TCTTGTAATCCTGTCGGCGG-3. Primer mengapit sekuens gen LPL pada posisi basa 17 hingga 277 dengan panjang produk 260 bp. Sekuens ini merupakan bagian kecil dari 5 UTR (untranslated region) dan ekson pertama dari gen LPL domba (Gambar 11). Gambar 3.4 Amplikon gen LPL (gen bank nomor akses X ) dengan panjang 260 bp mengapit sekuens gen LPL c.17-c.277 merupakan bagian dari daerah 5 UTR dan bagian dari ekson 1. Primer ditandai dengan garis bawah, bold dan italic. Setiap reaksi PCR terdiri atas 50 ng (2-3 µl) DNA template, 0.25 µm primer forward dan reverse, 12.5 µl Dream Tag Green Master Mix dari Thermo Scientific #K 1081 dan dh 2 O hingga 25 µl. Amplifikasi DNA menggunakan mesin GeneAmp PCR sistem 9700 dan Master Cycler Personal Eppendorf. Amplifikasi gen LPL dilakukan menggunakan metode PCR. Amplifikasi bertujuan untuk memperbanyak DNA target yang akan dianalisis lebih lanjut menggunakan metode direct sequencing. Amplifikasi dimulai dengan denaturasi awal pada suhu 95 o C selama 5 menit diikuti dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95 o C selama 45 detik, annealing pada suhu 58 o C selama satu menit dan ekstensi pada suhu 72 o C selama satu menit. Selanjutnya ekstensi akhir pada suhu 72 o C selama 5 menit. Visualisasi Hasil PCR Produk PCR selanjutnya diseparasi pada gel agarose 1.5% dalam 0.5 x TBE yang mengandung 200 ng/ml ethidhium bromide (EtBr) dan dikalibrasi

46 26 menggunakan 100 bp ladder marker. Elektroforesis dijalankan pada teganggan 100 volt selama 30 menit dilanjutkan visualisasi gel di bawah UV transilluminator. Produk PCR selanjutnya dikirim ke First Base Laboratory untuk dianalisis sekuensnya menggunakan dideoxy sequencing in ABI 3730 XL automated DNA sequencer. Analisis Data Hasil sekuens segmen gen LPL domba garut dan sumatera ekor tipis, dianalisis menggunakan BioEdit (Hall 2011) dan MEGA 5.2 (Tamura et al. 2007) untuk menemukan titik mutasi atau single nucleotide polymorphisms. Selanjutnya sekuen yang berbeda, diblast dengan sekuens gen bank nomor akses X Nilai frekuensi gen, frekuensi genotipe, heterosigositas harapan (He) dan heterosigositas pengamatan (Ho) serta uji keseimbangan Hardy-Weinberg dihitung menggunakan program POPGENE (Yeh et al. 1999). Frekuensi gen dan genotipe dihitung menggunakan rumus menurut Nei dan Kumar (2000) yaitu; ; Keterangan: x i = Frekuensi gen ke-i x j = Frekuensi gen ke-j = Jumlah sampel dengan genotipe ii = Jumlah sampel dengan genotipe ij N = Jumlah sampel Frekuensi genotipe dihitung menggunakan rumus : ; Keterangan: = Frekuensi genotipe ke-ii = Frekuensi genotipe ke-jj = Frekuensi genotipe ke-ij Penyimpangan frekuensi genotipe yang muncul dari keseimbangan Hardy- Weinberg dianalisis menggunakan chi square test ( ) berdasarkan rumus Nei dan Kumar (2000); Keterangan: = Nilai uji chi kuadrat O = Frekuensi genotipe sampel yang diamati E = Frekuensi genotipe harapan Nilai heterosigositas pengamatan (H o ) dan harapan (H e ) dihitung menggunakan POPGENE 32 versi 1.31 software (Yeh et al. 1999);

47 27 Keterangan: = Heterosigositas observasi = Heterosigositas harapan = Ukuran populasi efektif = Frekuensi genotipe AiAj, populasi ke-k Hasil dan Pembahasan Single Nucleotide Polymorphisms Gen Lipoprotein Lipase Domba Sumatera Ekor Tipis dan Domba Garut Amplifikasi gen LPL menghasilkan amplikon dengan panjang 260 bp (Gambar 3.5), merupakan bagian dari 5 UTR dan ekson 1 dari gen LPL domba (Lampiran 2). M C48 C06 C39 C47 02 C7 C51 03 C11 C C bp 100 bp 260 bp Gambar 3.5 Hasil amplifikasi PCR gen LPL daerah 5 UTR dan bagian dari ekson 1 dengan panjang 260 bp. M = DNA ladder 100 bp; C48,C06,.08 = kode sampel domba garut Hasil aligment 66 sekuens gen LPL yang terdiri dari 50 sekuens domba sumatera ekor tipis dan 16 sekuens domba garut, ditemukan tiga titik mutasi baru atau tiga SNPs baru yaitu pada posisi basa g.26, g.27 dan c.192 (Gambar 3.6). Tiga SNPs baru ini ditemukan pada domba garut dan hanya satu SNP ditemukan pada domba ekor tipis sumatera yaitu pada posisi basa g.26. Tiga SNPs pada domba garut terdiri atas insersi basa sitosina g.26>c, insersi basa guanina g.27>g dan mutasi timina menjadi sitosina c.192t>c membentuk 5 diplotipe yaitu diplotipe A, B, C, F dan G (Gambar 3.6). Insersi C atau G pada posisi basa g.26 (Gambar 3.7) pada domba ekor tipis sumatera membentuk 3 diplotipe yaitu diplotipe A, D dan E. Diplotipe A merupakan diplotipe yang persis sama dengan sekuens gen bank X Tiga SNPs ini merupakan SNPs baru yang tidak atau belum dilaporkan pada populasi domba lainnya.

48 Diplotype_A T A A A C C T G C C - - G C T T C T A G C T C C C C A C C C T C C C C T T T A A A G G G T Diplotype_A Diplotype_B Diplotype_B Diplotype_C Diplotype_C Diplotype_D C Diplotype_D Diplotype_E G Diplotype_E Diplotype_F C G Diplotype_F Diplotype_G C G Diplotype_G O.ovies_LPL_X68308 G A A T T C G C G G C C G C G G O.ovies_LPL_X Diplotype_A G A C T T G C T C C G C G C C A G A C C G C T G C T C C A G C C T G C T G C C G C C T C G G G C T C A G C G G C T C T A Diplotype_A Diplotype_B Diplotype_B Diplotype_C Diplotype_C Diplotype_D Diplotype_D Diplotype_E Diplotype_E Diplotype_F Diplotype_F Diplotype_G Diplotype_G O.ovies_LPL_X O.ovies_LPL_X Diplotype_A C T G C T C T G T C C G C G C T C G C G C C C G G T G C C C C G C A T C T C C T A C G G A G G G A C A T C C C C C G A G Diplotype_A Diplotype_B Diplotype_B Diplotype_C Diplotype_C Diplotype_D Diplotype_D Diplotype_E Diplotype_E Diplotype_F Diplotype_F Diplotype_G Diplotype_G O.ovies_LPL_X O.ovies_LPL_X Diplotype_A A T G G A G A G C A A G G T C C T G C T T C T G C T G G C T C T G A G C G T G T G G C T G C A G A G T C T G A C C G T C Diplotype_A Diplotype_B C Diplotype_B Diplotype_C Y Diplotype_C Diplotype_D Diplotype_D Diplotype_E Diplotype_E Diplotype_F Diplotype_F Diplotype_G C Diplotype_G O.ovies_LPL_X O.ovies_LPL_X Diplotype_A T C C C G C G G A G G G C T G G T C G C C G C C G A C A G G A T T A C A Diplotype_A Diplotype_B Diplotype_B Diplotype_C Diplotype_C Diplotype_D Diplotype_D Diplotype_E Diplotype_E Diplotype_F Diplotype_F Diplotype_G Diplotype_G Gambar 3.6 Aligment gen lipoprotein lipase domba garut dan domba ekor tipis sumatera dengan gen bank nomor akses X

49 C G G T C T T G T A30A A C C T G C CGG40 T T C T A G C T C 50 C C C A C C C T C C C C T T T A A A G G T TA A A C C T G CC C G CT T C T A G C T C C C C A C C C T C C C C T T T A A A G G G T G A C T T G CT C C G C G Keterangan: Insersi c.26>c dan c.27>g Keterangan: Insersi c.26>g 10 T G G A A A C C T G C C C GC T C T A G C T C C C C TA AC AC AC CT C TC G C CT GT CT TA TAC AT GA G GC T GC AC C TC TA GC CTC CT C GC C GC CT T T A A A Keterangan: Adanya insersi c.26>c Keterangan: Tidak adanya insersi Gambar 3.7 Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan adanya insersi pada posisi basa c.26 dan c.27. Insersi pada daearah 5 UTR gen LPL ditemukan pada posisi basa g.26>c dan g.27>g (Gambar 3.7). Daerah 5 UTR (untranslated region) yaitu daerah sebelum triplet pemulai (ATG) merupakan tempat ribosom melekat. Daerah 5 UTR merupakan daerah tempat terjadinya transkripsi dimulai atau disebut juga transcription initiation site (Mignone et al. 2002; Nicholas 2004). Daerah 5 UTR gen LPL domba sepanjang 178 nukleotida (Lampiran 2). Insersi pada daerah 5 UTR berperan penting dalam pengaturan ekspresi gen (Araujo et al. 2012) dan menyebabkan terjadinya kesalahan dalam proses replikasi DNA (Nei dan Kumar 2000). Insersi pada posisi basa g.26>c dan g.27>g menyebabkan munculnya stop codon pada asam amino ke 13, 66 dan ke 73 (Gambar 3.8) sedangkan insersi pada posisi basa g.26>g/c (Gambar 3.7) menyebabkan munculnya stop codon pada posisi asam amino ke 6 dan 15 (Gambar 3.8). Mutasi pada posisi basa g.26 dan g.27 disebut dengan frameshift mutation yaitu adanya insersi satu atau dua nukleotida menyebabkan munculnya stop codon tidak pada tempatnya (Griffiths et al. 2000; Nei dan Kumar 2000; Nicholas 2004). Frekuensi munculnya SNPs pada 5 UTR relatif kecil pada kedua populasi yang diuji (Tabel 3.1). Mutasi transisi pada daerah ekson pertama gen LPL ditemukan pada posisi basa c.192 (Gambar 3.9) pada populasi domba garut, merupakan non synonymous mutation karena perubahan basa timina menjadi sitosina merubah asam amino valina menjadi alanina (Val>Ala)(Gambar 3.8). Substitusi nukleotida pada posisi pertama atau kedua dari triplet kodon pada umumnya merupakan non synonymous mutation sedangkan pada nukleotida yang ketiga merupakan synonymous mutation (Griffiths et al. 2000; Nei dan Kumar 2000). Dalam hal ini substitusi T>C terjadi pada posisi triplet ke dua yaitu GTC>GCC. Mutasi transisi

50 30 merupakan substitusi basa yang memiliki struktur yang sama yaitu basa purin dengan basa purin (A>G) atau basa primidin dengan basa pirimidin (C>T) (Griffiths et al. 2000). Mutasi pada posisi basa c.192 membentuk 3 genotipe yaitu TT, CT dan CC. Lokus SNP c.192 bersifat polimorfik pada domba garut dan monomorfik pada domba ekor tipis sumatera. Tabel 3.1 Diplotipe sekuens bagian dari 5 UTR dan ekson 1 gen LPL domba ekor tipis sumatera dan domba garut Diplotipe Titik Mutasi Frekuensi (n) g.26 g.27 c.192 ETS Garut Diplotipe A - - T 0.840(42) (3) Diplotipe B - - C (0) (6) Diplotipe C - - C/T (0) (5) Diplotipe D C - T (1) (0) Diplotipe E G - T (7) (0) Diplotipe F C G T (0) (1) Diplotipe G C G C (0) (1) Total Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera Hasil penelitian Ding et al. (2011) melaporkan bahwa satu SNP pada ekson 7 gen LPL pada posisi basa 19913C>T mengakibatkan perubahan Phe>Ser bertanggung jawab terhadp sifat-sifat karkas dan deposisi lemak pada Yak. Tiga SNPs pada daerah 3 UTR yaitu g.74 T>C, g.130 T>C dan g.133 T>A berasosiasi dengan kandungan Conjugated Linoleic Acid susu domba (Crisa et al. 2010). Sevane et al (2013) melaporkan bahwa keragaman gen LPL pada sapi berpengaruh terhadap kandungan ALTJG yaitu asam dihomo-gama-linolenat (C 20:3n-6 ) dan asam arakidonat (C 20:4n-6 ) dan belum pernah dilaporkan mengenai pengaruh 3 SNPs yang ditemukan pada penelitian ini. Gambar 3.8 Aligment sekuens protein gen LPL domba garut dan domba ekor tipis sumatera

51 G G G AC A T C C C C C G A G A T G G A G A G C A A G G C C C T G C T T C A T G C C C T C G C G C G T C AG T G A TG G C GA G T AG GA T AG G CAA C A AGG G GT/C T CC C TT G C T TCG G C T T C T G C T G G C T C T G AG C G Keterangan: Mutasi c.192t>c Keterangan: Mutasi c.192t>ct G AC A T C C C C C G A G A T G G A G A G C A A G G T C C T G C T T C T G C T G G C T C T G A G C G T G T G G C T G C Keterangan: tidak mengalami mutasi Gambar 3.9 Parsial sekuens gen LPL yang menunjukkan adanya mutasi pada posisi c.192 T>C pada domba garut Frekuensi Gen, Frekuensi Genotipe, Nilai Heterosigositas dan Keseimbangan Hardy-Weinberg Gen Lipoprotein Lipase c.192 Hasil penghitungan frekuensi gen dan frekuensi genotipe gen LPL domba sumatera ekor tipis dan domba garut disajikan pada Tabel 6. Frekuensi gen C (59.00%) pada domba garut, lebih tinggi dibandingkan gen T (41.00%) dan frekuensi genotipe tertinggi yaitu CC (43.80%), diikuti CT (31.20%) dan TT (25.00%) sedangkan pada domba sumatera ekor tipis hanya ditemukan satu genotipe TT berarti monomorfik. Tabel 3.2 Frekuensi gen dan genotipe gen LPL domba garut dan domba sumatera ekor tipis pada posisi basa c. 192 Sub populasi Jumlah Frekuensi Gen Frekuensi Genotipe individu C T CC CT TT Garut ETS Keterangan: ETS = ekor tipis sumatera Nilai heterosigositas merupakan deskripsi keragaman genetik dari suatu gen pada suatu populasi (Nei dan Kumar 2000). Nilai heterosigositas merupakan persentase lokus heterozigot tiap individu atau rataan persentase individu heterozigot pada suatu populasi (Marson et al. 2005). Hasil analisis menunjukkan bahwa domba garut memiliki nilai heterosigositas pengamatan sebesar 31.30% dan nilai heterosigositas harapan sebesar 49.80% (Tabel 7). Nilai heterosigositas berkisar nol sampai dengan satu. Nilai nol menunjukkan bahwa kekerabatan yang

52 32 dekat diantara populasi yang diukur dan nilai satu menunjukkan tidak adanya hubungan kekerabatan (Nei 1987). Nilai heterosigositas yang didapatkan menunjukkan bahwa gen LPL pada domba garut adalah polimorfik. Keseimbangan gen LPL dalam suatu populasi dapat diketahui dengan pendekatan hukum keseimbangan Hardy-Weinberg (Tabel 3.3). Apabila dalam suatu populasi, perkawinan berlangsung secara acak, tidak terjadi seleksi, mutasi dan genetic drift maka frekuensi genotipe dalam suatu populasi akan tetap dari satu generasi ke generasi berikutnya. Hasil uji chi square (χ 2 ) menunjukkan bahwa frekuensi genotipe gen LPL pada domba garut berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg (P>0.05). Diduga alel C yang ditemukan pada gen LPL merupakan alel khas pada domba garut. Tabel 3.3 Nilai heterosigositas dan uji chi square gen LPL domba garut dan domba ekor tipis sumatera Sub Populasi Jumlah Nilai Heterosigositas Individu Ho He Nilai χ 2 Garut ns ETS Keterangan : ETS = ekor tipis sumatera; Ho = heterosigositas pengamatan; He = heterosigositas harapan; ns = tidak berbeda nyata P>0,05 pada taraf α = 0.05 Hasil penelitian gen LPL memperlihatkan bahwa satu SNP pada ekson 7 pada posisi basa c.19913, merubah sitosina menjadi timina mengakibatkan perubahan fenilalanina menjadi serina, bertanggung jawab terhadap sifat-sifat karkas dan deposisi lemak pada Yak telah dilaporkan oleh Ding et al. (2011). Tiga SNPs yang ditemukan pada daerah 3 UTR pada domba yaitu pada posisi basa g.74, perubahan timina menjadi sitosina; g.130 perubahan timina menjadi sitosina dan g.133 substitusi timina menjadi adenina berhubungan dengan kandungan Conjugated Linoleic Acid (CLA) pada susu domba (Crissa et al. 2010). Keragaman gen LPL pada daerah 5 flanking region dan ekson 3,6,7,8 dan 9 memberikan pengaruh nyata terhadap deposisi lemak pada ayam (Liu et al. 2006). Begitu juga SNPs yang ditemukan pada ekson 5 c.645 C>T dan c.726 G>A pada itik berhubungan nyata dengan bobot badan, berat lemak dan sifat-sifat karkas (Yang et al. 2012) dan belum ada laporan yang menjelaskan pengaruh tiga SNPs yang ditemukan dalam penelitian ini. Simpulan Hasil penelitian menunjukkan bahwa ditemukan 3 SNPs baru gen LPL yaitu insersi pada daerah 5 UTR pada posisi basa g.26>c/g, g.27>g dan mutasi pada ekson pertama c.192 T>C. Insersi g.26 C/G dan insersi g.27>g merupakan frameshift mutation dengan frekuensi munculnya SNPs pada kedua titik mutasi ini relatif rendah pada domba garut dan domba ekor tipis sumatera. Mutasi pada posisi basa c.192 T>C merupakan non synonymous mutation karena perubahan basa timina menjadi sitosina mengakibatakan perubahan asam amino valina menjadi alanina (Val>Ala). Mutasi pada c.192 bersifat polimorfik domba garut dan monomorfik pada domba ekor tipis sumatera.

53 33 4 ASOSIASI KERAGAMAN GEN LIPOPROTEIN LIPASE c.192 DENGAN KUALITAS MARBLING DOMBA GARUT Abstrak Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis hubungan single nucleotide polymorphisms (SNPs) gen lipoprotein lipase pada posisi basa c.192 dengan kualitas lamb marbling pada domba garut. Sembilan ekor domba garut digunakan dalam penelitian ini. Kandungan lemak total ditentukan menggunakan metode soxhlet menggunakan pelarut petroleum eter (AOAC 2005). Kandungan kolesterol ditentukan menggunakan alat spektrofotometri dengan pewarnaan 10 g FeCl 3 6H 2 O dalam 100 ml asam glasial asetat (AOAC 2005), dengan panjang gelombang 565 nm. Kandungan asam-asam lemak diukur menggunakan metode AOAC (2005). Lemak setelah diekstraksi, diesterifikasi dan dimetilasi dengan BF3 20%. Selanjutnya fatty acids methyl ester (FAME) dipisahkan dan dikuantifikasi menggunakan gas kromatografi menggunakan GC-2010 plus Shimadzu. Asosiasi diantara keragaman genotipe dan kualitas marbling dianalisis menggunakan analisis sidik ragam satu arah dan uji lanjut menggunakan uji beda nyata terkecil. Hasil penelitian menunjukkan bahwa keragaman gen LPL pada posisi basa c.192 T>C pada domba garut berasosiasi dengan asam lemak jenuh heneikosanoat, genotipe TT (0.04%) lebih tinggi dibandingkan genotipe CC (0.03%) dan genotipe CT (0.02%). Kata kunci: asam lemak, domba garut, gen LPL, heneikosanoat, SNP Abstract This study was aimed to analyze association single nucleotide polymorphisms (SNPs) of lipoprotein lipase gene c.192 with lamb marbling quality on garut sheeps. A total of 9 heads garut sheep were used in this study. The fat determined with soxhlet method with petroleum eter (AOAC 2005). The cholesterol content was carried out with dye 10 g FeCl 3 6H 2 O in 100 ml glacial asetic acid (AOAC 2005) by spectrofotometer in absorbance with wavelength of 565 nm. Determined of fatty acids content was followed AOAC (2005). The lipids after extraction were esterified and methylated with BF3 20%. The fatty acids methyl esters (FAMEs) were separated and quantified in a gas chromatograph (GC-2010 plus Shimadzu). The association between the genotipe and marbing quality was analyze by one way ANOVA and least significant difference (LSD) used to know different least squares means. The results showed that polymorphisms of LPL gene at c.192 T>C on garut sheep was associated with heneicosanoic acid, whereas TT genotipe (0.04%) had higher than CC (0.03%) and CT (0.02%). Key words: garut sheep, henecosanoic acid, SNP, LPL gene

54 34 Pendahuluan Kualitas daging dapat didefenisikan sebagai faktor-faktor yang dapat mempengaruhi penilaian konsumen terhadap daging yang berhubungan dengan sifat-sifat yang bersifat poligenik (Dunner et al. 2013). Tingkat kesukaan konsumen terhadap daging masak dipengaruhi oleh keempukan, juiciness dan flavour yang berhubungan erat dengan marbling. Marbling atau lemak intramuscular adalah bintik-bintik (flecks) dan lapisan (streaks) lemak di dalam lean (Guo et al. 2014). Deposisi lemak tubuh ternak ditemukan pada beberapa daerah yaitu visceral, subcutan, intermuscular dan intramuscular. Kualitas marbling mempengaruhi penilaian konsumen karena dapat mempengaruhi flavour, odor, (Sanudo et al. 2000), juiciness dan keempukan (Aberle et al. 2001). Lemak terdiri atas gliserol ester, kolesterol, pospolipida dan asam lemak. Asam lemak berdasarkan ikatan rangkapnya dikelompokkan ke dalam 3 kategori (Wina dan Susana 2013) yaitu asam lemak jenuh (ALJ), asam lemak tidak jenuh tunggal (ALTJT) dan asam lemak tidak jenuh ganda (ALTJG). Ahli nutrisi menyarankan bahwa fat intake berkisar 15%-30% dari total kalori yang dibutuhkan. Asam lemak jenuh dibatasi antara 0-10%, ALTJT 16%, ALTJG 7% dan kolesterol tidak boleh lebih 300 mg/hari (Wong 1989; Chizzolini et al. 1999; USDA dan USDHHS 2010). Konsumsi ALJ, trans MUFA dan kolesterol melebihi kebutuhan pada orang-orang yang memiliki kelebihan bobot badan (obesitas) ditenggarai sebagai penyebab timbulnya berbagai macam penyakit seperti cardiovascular disease, atherosclerosis dan penyakit lainnya (USDA dan USDHHS 2010). Konsumsi ALJ, trans MUFA dan kolesterol melebihi kebutuhan tubuh mengakibatkan tingginya kandungan low density lipoprotein (LDL) dan kolesterol darah. Terdapat korelasi positif antara konsumsi ALJ dan kandungan kolesterol tubuh. Konsumsi ALJ yang tinggi mengakibatkan kandungan kolesterol darah menjadi tinggi, begitu juga sebaliknya. Konsumsi kolesterol 300 mg/hari dapat menjaga normalitas kolesterol darah namun konsumsi kolesterol kurang dari 200 mg/hari dalam waktu yang lama dapat mengakibatkan munculnya penyakit jantung (USDA dan USDHHS 2010). Nilai heritabilitas komposisi asam lemak marbling domba scottish blackface berkisar sedang sampai tinggi (Karamichou et al. 2006), yang mengindikasikan bahwa seleksi pada tetua dapat meningkatkan performa asam lemak pada turunannya. Seleksi terhadap kualitas marbling menggunakan metode konvensional sangat sulit dan relatif mahal sehingga dalam program seleksi berdasarkan fenotipe, kualitas marbling tidak umum dilakukan. Alternatif yang dapat dilakukan adalah melalui seleksi genom. Seleksi genom diawali dengan penemuan kandidat gen yang berasosiasi dengan sifat-sifat yang diinginkan. Salah satunya melalui eksplorasi single nucleotide polymorphisms (SNPs) untuk mengetahui genotipe ternak dan selanjutnya dihubungkan dengan sifat-sifat yang diinginkan. SNP merupakan variasi sekuen DNA yang muncul ketika satu nukleotida (A, T, C atau G) berbeda dari sekuen pada umumnya. Salah satu gen yang diduga berpengaruh terhadap kualitas marbling domba adalah gen lipoprotein lipase (LPL). Sevane et al. (2013) melaporkan keragaman gen LPL pada beberapa breed sapi berasosiasi dengan peningkatan asam lemak dihomo-

55 35 gama linolenat dan asam lemak arachidonat. Gen LPL akan menyandikan enzim LPL. Lipoprotein lipase adalah enzim kunci yang berperan utama pada metabolisme dan transpor lipoprotein serta memberikan pengaruh penting pada level trigliserida darah, mengontrol partisi trigliserida pada jaringan adipose dan otot sehingga meningkatkan penyimpanan lemak atau menyediakan energi dalam bentuk asam lemak untuk pertumbuhan otot (Ren et al. 2002; Dunner et al. 2013). Lipoprotein merupakan kompleks protein-lipid dalam darah yang terdiri atas empat tipe yaitu kilomikron, very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL), dan high density lipoprotein (HDL). Lipoprotein terdiri dari kolesterol, trigliserida pospolipida dan apolipoprotein. Persentase masing-masing komponen pembentuk lipoprotein berbeda, tergantung tipe lipoprotein yang terbentuk. Lipoprotein lipase diproduksi dalam jaringan adipose, jantung dan otot rangka. Lipoprotein lipase ditransfer ke permukaan kapiler endothelium, menghidrolisis trigliserida dari bentuk VLDL menjadi LDL dan LDL menjadi LDL remnat yang akhirnya kembali ke hati. Perbedaan jenis jaringan (lemak dan otot jantung) dan jenis pakan tidak mempengaruhi perbedaan ekspresi gen LPL pada domba (Bonnet et al. 2000). LPL disandikan oleh gen penyandi yaitu gen LPL. Gen LPL terdiri atas 10 exon dan 9 intron, pada domba terletak pada kromosom ke 2 ( Hasil penelitian pada tahap 2 menunjukkan adanya keragaman gen LPL pada domba garut pada posisi basa c. 192T>C merupakan non synonymous mutation menyebabkan terjadinya perubahan asam amino valina>alanina, namun belum diketahui bagaimana hubungan titik mutasi tersebut terhadap kualitas marbling domba garut. Berdasarkan hal diatas dilaksanakan penelitian yang bertujuan mengasosiasikan keragaman gen LPL c.192t>c dengan kualitas marbling domba garut. Waktu dan Tempat Bahan dan Metode Penelitian dilakukan dari bulan Februari 2014 sampai dengan bulan Juni 2014 di Laboratorium Terpadu IPB Baranang Siang Bogor. Materi Sembilan domba garut tipe pedaging jantan kisaran umur 8-10 bulan dengan bobot badan ± 3.07 kg yang telah diidentifikasi keragaman gen LPL c.192, terdiri atas genotipe TT (n=4), CT (n=2) dan CC (n=3). Domba dipelihara di kandang, diberi pakan dengan kandungan ISO protein 16% dan ISO TDN 65% terdiri atas hijauan, konsentrat dan limbah tauge. Selanjutnya domba dipotong dan diambil bagian otot longissimus dorsi dan dianalisis kandungan lemak, kolesterol dan komposisi asam lemaknya. Analisis Kualitas Lemak Intramuskuler Domba Garut Daging lean yang berasal dari otot longissimuss dorsi (Gambar 4.1) dari 9 ekor domba garut jantan yang telah ditentukan keragaman gen LPLnya, dianalisis kualitas lemak intramuskuler mengikuti prosedur AOAC (2005).

56 36 Gambar 4.1 Otot longissimus dorsi (Sumber: Soeharsono 2010) Analisis Kandungan Lemak (AOAC 2005) Analisis kandungan lemak menggunakan metode soxhlet menggunakan pelarut petroleum eter (AOAC 2005). Sebanyak g daging (x), dimasukkan dalam selongsong yang dibuat dari kertas saring dan ditutup dengan kapas yang bebas lemak (hulls). Hulls dimasukkan ke dalam soxhlet yang telah terhubung dengan labu lemak kering yang telah ditimbang berat kosongnya (a). Ditambahkan petroleum eter ml pada suhu 100 o C. Proses ekstraksi berlangsung sampai larutan di dalam soxhlet sebening heksan murni atau ± 6 jam. Dilanjutkan dengan pemisahan petroleum eter dengan cara destilasi dan evaporasi. Labu lemak yang berisi hasil ekstraksi dikeringkan di dalam oven, didinginkan dalam desikator sehingga didapatkan berat constant (b). Kadar lemak kasar dihitung dengan rumus; Analisis Kandungan Kolesterol (AOAC 2005) Kandungan kolesterol ditentukan menggunakan alat spektrofotometri menggunakan pereaksi pewarna (10 g FeCl 3 6H 2 O dalam 100 ml asam asetat glasial), selanjutnya 1 ml perekasi pewarna dilarutkan dalam 100 ml larutan H 2 SO 4. Lemak hasil ekstraksi (15-25 mg) ditambahkan 2 ml NaOH etanol 0.5 N dipanaskan selama 30 menit lalu didinginkan dan ditambahkan 5 ml aquadest. Lalu disaponifikasi menggunakan larutan heksan 2 x 2 ml, lalu diuapkan agar sisa larutan heksan hilang. Selanjutnya ditambahkan 3 ml asam asetat glasial dan ditambahkan 2 ml pereaksi pewarna sehingga terbentuk warna kuning muda hingga ungu. Selanjutnya sampel diinjeksikan pada alat spektrofotometri dengan panjang gelombang 565 nm. Penentuan kandungan kolesterol (%) dengan rumus: Analisis Kandungan Asam Lemak (AOAC 2005) Analisis asam lemak menggunakan alat GC-2010 plus Shimadzu. Kandungan asam lemak ditentukan sebagai FAME (fatty acid methyl ester) oleh alat kromatografi gas. Pembentukan FAME didahului oleh proses saponifikasi dan dilanjutkan dengan metilasi. Kurang lebih mg lemak dihidrolisis menggunakan 1 ml NaOH 0.5 N dalam metanol yang dipanaskan pada penangas

57 37 air suhu 80 0 C selama 20 menit, kemudian didinginkan. Selanjutnya ditambahkan 2 ml BF 3 20% dan 5 mg/ml standar internal dan dipanaskan selama 20 menit dan didinginkan. Selanjutnya sampel diasamkan dengan penambahan 2 ml NaCl jenuh dan diekstraksi menggunakan 1 ml iso okta, dikocok dengan baik sehingga membentuk 2 lapisan. Lapisan atas (lapisan iso okta) dipindahkan dengan bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi ± 0.1 g Na 2 SO 4 anhidrat dibiarkan 15 menit. Pemindahan fasa cair dilakukan dengan memindahkan sampel ke tabung vial 1 ml dan dilanjutkan dengan injeksi ke GC dengan kondisi GC; suhu injector 220 o C, suhu detector 240 o C dan suhu kolom diprogram sebagai berikut; suhu 125 o C selama 5 menit, 185 o C dengan kecepatan 10 o C/menit selama 5 menit, 205 o C dengan kecepatan 5 o C/menit selama 10 menit dan 225 o C dengan kecepatan 3 o C/menit selama 7 menit. Setelah alat disiapkan dilanjutkan dengan injeksi 1 µl pelarut ke dalam kolom. Puncak pelarut akan nampak dalam waktu kurang dari 6 menit apabila aliran gas pembawa sistem pemanasan sempurna. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan. Penentuan kandungan komponen dalam sampel dilakukan dengan teknik standar eksternal dan internal standar. Luas puncak dari masing-masing komponen adalah berbanding lurus dengan jumlah komponen tersebut dalam sampel. Untuk meminimalkan kesalahan akibat volume injeksi, preparasi sampel, pengenceran dan lain-lain digunakan standar internal. Juga dilakukan koreksi terhadap respon detektor dan interaksi antar komponen dalam matrik contoh selama melewati kolom. Waktu retensi dan puncak masing-masing komponen diukur dan selanjutnya dibandingkan waktu retensi dengan standar untuk mendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen asam lemak sampel. Penghitungan kandungan komponen asam lemak dihitung menggunakan rumus; Konsentrasi Asam Lemak (%) = Keterangan: = Volume contoh = Konsentrasi standar = Luas puncak komponen x = Luas Puncak standar Analisis Data Analisis hubungan keragaman gen LPL c.192 dengan kandungan lemak, kolesterol dan asam lemak otot longissimus dorsi Domba Garut diuji menggunakan program SPSS18 menggunakan metode One-way Anova dan uji lanjut menggunakan metode LSD (least significant difference) pada taraf nyata (α = 0.05). Model matematis yang digunakan adalah (Kaps dan Lamberson 2004); Keterangan: = Nilai pengamatan pengaruh genotipe ke-i, ulangan ke-j

58 38 = Nilai tengah umum = Pengaruh genotipe ke-i = Pengaruh galat percobaan pada perlakuan ke-i, ulangan ke-j Hasil dan Pembahasan Assosiasi Keragaman Gen Lipoprotein Lipase c.192 dengan Kandungan Lemak, Kolesterol dan Rasio Asam Lemak Otot Longissimus dorsi Domba Garut Hasil penelitian menunjukkan kisaran kandungan lemak intramuskuler otot longissimus dorsi domba garut adalah 1.60%-1.730% dengan nilai rataan 1.67% atau setara dengan 16.7 mg/100 g daging dan kandungan kolesterol 6.10% % dengan nilai rataan 7.69% atau setara dengan mg/100 g (Tabel 4.1 dan Tabel 4.2). Hasil Anova menunjukkan bahwa perbedaan genotipe tidak berpengaruh nyata (P>0.05) terhadap kandungan lemak dan kolesterol otot longissimus dorsi domba garut. Tabel 4.1 Kandungan lemak, kolesterol dan komposisi asam lemak domba garut pada genotipe gen LPL yang berbeda Genotipe Nilai Rataan Peubah TT (n=4) CT (n=2) CC(n=3) Gabungan Rataan KK Rataan KK Rataan KK Lemak (%) Kolesterol (%) ALJ (%) ALTJT (%) ALTJG (%) ALTJ (%) Rasio ALTJ/ALJ Rasio ALTJT/ALJ Rasio ALTJG/ALJ Keterangan : ALJ = asam lemak jenuh; ALTJ = asam lemak tidak jenuh; ALTJT = asam lemak tidak jenuh tunggal; ALTJG = asam lemak tidak jenuh ganda Kandungan lemak domba garut lebih rendah dibandingkan domba lainnya seperti domba south african mutton, domba merino, domba dormer (Cloete et al. 2004), domba moranda nova, santa inez dan silangannya (Costa et al. 2009), domba jazersko-solcava (Cividini et al. 2008) (Tabel 4.2). Hasil penelitian menunjukkan kandungan kolesterol domba garut lebih tinggi dibandingkan domba lainnya, kecuali untuk domba lokal hasil penelitian Priyono et al. (2013) menunjukkan angka yang relatif sama yaitu mg/100 g (Tabel 4.2). Rendahnya kandungan lemak yang ditemukan dalam penelitian ini diduga karena umur domba yang digunakan relatif masih muda yaitu 8-10 bulan, dimana energi pakan masih digunakan untuk pertumbuhan dan reproduksi sehingga penumpukan lemak belum terjadi pada bagian intramuskuler. Menurut Chizzolini et al. (1999), kandungan kolesterol daging dipengaruhi oleh tipe otot. Peningkatan jumlah serat dalam otot mengakibatkan peningkatan sarcolemma perimeter

59 39 hingga rasio serat per volume meningkat. Hal ini mengakibatkan peningkatan kandungan kolesterol. Selanjutnya dijelaskan pula bahwa tingginya kandungan pospolipida otot juga mengakibatkan peningkatan kolesterol daging. Oleh sebab itu jika jumlah lemak yang dikandung sedikit maka jumlah kolesterol yang dikandung daging juga sedikit namun hal ini tidak selalu muncul. Tabel 4.2 Kandungan lemak dan kolesterol beberapa breed domba Peubah Breed Lemak (%) Kolesterol (mg/100 g) Sumber Lokal jantan Priyono et al SAMM Cloete et al Dormer Cloete et al Moranda Nova (MN) Costa et al Santa Inez (SI) Costa et al Silangan MN x SI Costa et al Silangan SM (int) Borys et al Silangan SM (semi int) Borys et al Jezersko-Solcava (Pst) Cividini et al Jezersko-Solcava (Stb) Cividini et al Garut Hasil Penelitian Keterangan : SAMM = south african mutton merino; SM = suffolk x merinofin; int = intensif; Pst = pasture; Stb = stable (dikandangkan) Rendahnya kandungan lemak dan kandungan kolesterol otot longissimus dorsi diikuti dengan tingginya kandungan ALJ. Hasil Anova menunjukkan bahwa perbedaan genotipe belum memberikan pengaruh nyata (P>0.05) terhadap kandungan ALJ. Asam lemak jenuh merupakan komponen utama pembentuk lemak daging pada ruminansia (Lawrie 2003). Kandungan ALJ domba garut lebih rendah dibandingkan domba SAMM (49.5%), dormer (52.8%), santa inez (56.82%), moranda nova (57.44%) dan silangan santa inez x moranda (55.86%), silangan suffolk x merinofin (41.64%-43.85%), jezersko-solcava (41.68% %), merino spanish (43.22%), rasa aragonesa (47.35%), welsh mountain (49.97%) dan early lamb (51.53%) (Tabel 4.3). Hasil Anova juga menunjukkan bahwa perbedaan genotipe tidak mempengaruhi kandungan ALTJT dan ALTJG marbling domba garut (P>0.05). Kandungan ALTJT dan ALTJG domba garut jauh lebih rendah dibandingkan breed domba lainnya. Kandungan ALTJG domba garut (2.43%) juga lebih rendah dibandingkan sapi PO (2.74%) dan kerbau (22.57%) (Yurleni 2013) dan sapi ciamis (3.79%) (Tabel 4.3).

60 40 Tabel 4.3 Kandungan ALJ, ALTJT, ALTJG, ALTJ, rasio ALTJG:ALJ beberapa breed domba, sapi PO, sapi ciamis dan kerbau Peubah Breed ALJ (%) ALTJT (%) ALTJG (%) Rasio ALTJG:ALJ Sumber SAMM Cloete et al Dormer Cloete et al Moranda Nova (MN) Costa et al Santa Inez (SI) Costa et al Silangan MN x SI Costa et al Suffolk Down Gollardo et al Silangan SM (int) Borys et al Silangan SM (semi int) Borys et al JZ (Pst) Cividini et al JZ (Stab) Cividini et al Merino Spanish Sanudo et al Rasa Aragonesa Sanudo et al Welsh Mountain Sanudo et al Early lamb Sanudo et al Sapi PO Yurleni 2013 Sapi Ciamis Hilmia 2013 Kerbau Yurleni 2013 Garut Hasil Penelitian Keterangan : SAMM = south african mutton merino; SM = suffolk x merinofin; int = intensif; JZ = jezersko-solcava; Pst = pasture; Stb = stable (dikandangkan) Rasio ALTJG:ALJ merupakan indikator bagi daging yang sehat. Semakin tinggi nilai rasio ALTJG:ALJ semakin sehat daging yang dikonsumsi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rasio ALTJG:ALJ domba garut berkisar antara (Tabel 4.1), lebih rendah dibandingkan breed domba lainnya, sapi ciamis dan kerbau, serta relatif sama dengan sapi PO (Tabel 4.2). Hasil analisis Anova memperlihatkan bahwa perbedaan genotipe tidak memberikan pengaruh nyata (P>0.05) terhadap rasio ALTJG:ALJ. Rasio ALTJG:ALJ penting untuk menurunkan resiko penyakit jantung koroner. Rekomendasi kesehatan menjelaskan bahwa rasio ALTJG:ALJ dari makanan sebaiknya diatas 0.40 dan batas minimal adalah 0.12 (Wood et al. 2003). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa rasio ALTJG:ALJ domba garut berada di bawah ambang batas yang direkomendasikan. Kandungan. Rasio ALTJG:ALJ diatas 0.40 ditemukan pada breed domba jezersko-solcava yang dipelihara pada padang rumput pegunungan m dpl dengan bobot potong 34 kg (Cividini et al. 2008). Asam lemak tidak jenuh tunggal (oleat) dan ALTJG (asam linoleat dan α-linolenat) dapat menurunkan kandungan LDL-kolesterol sehingga dapat mengurangi resiko obesitas, kanker dan penyakit jantung (Costa et al. 2009). Asam linoleat dan linolenat tidak dapat disintesis tubuh, merupakan asam lemak esensial bagi tubuh ternak (Cheeke dan Dierenfeld 2010). Profil asam lemak yang diinginkan juga dapat diketahui melalui nilai desirable fatty acid (DFA) yaitu hasil penjumlahan ALTJT, ALTJG dan asam stearat (Costa et al. 2009). Hasil penelitian menunjukkan bahwa genotipe CT memiliki kandungan DFA lebih tinggi (47.720%), diikuti genotipe CC (46.020%)

61 41 dan genotipe TT (42.360%). Hal ini sejalan dengan nilai indeks atherogenicity, dimana genotipe CT memiliki nilai indeks paling kecil (0.965) diikuti genotipe CC (1.064) dan TT (1.180) (Gambar 4.2). Nilai indeks atherogenicity domba garut pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan breed domba moranda nova, santa inez dan silangannya, namun masih berada pada batas rekomendasi yaitu tidak boleh melebihi 4 (Costa et al. 2009). Nilai indeks ini berhubungan dengan munculnya arteriosclerosis dan cardiovascular. Dijelaskan lebih lanjut, rasio asam stearat dan oleat terhadap asam palmitat juga merupakan indikator bagi daging merah sehat dengan kisaran nilai 2.1 sampai 2.8 untuk daging domba. Pada penelitian ini nilai rasio tertinggi ditemukan pada genotipe CT (2.322) diikuti TT (2.152) dan CC (1.984). Genotipe CC memiliki nilai rasio di bawah nilai yang direkomendasikan TT CT CC Gambar 4.2 Nilai desirable fatty acid (DFA), atherogenecity index dan rasio (stearat+oleat): palmitat marbling domba garut Hubungan Keragaman Gen Lipoprotein Lipase dengan Profil Asam Lemak Marbling Domba Garut Hasil penelitian menunjukkan telah teridentifikasi 20 jenis asam lemak terdiri dari 11 jenis ALJ dan 9 jenis ALTJ (4 jenis ALTJT dan 5 jenis ALTJG). Perbedaan genotipe tidak berpengaruh nyata (P>0.05) terhadap profil asam lemak kecuali pada asam lemak heneikosanoat (heneicosanoic acid, C 21:0 ), dimana perbedaan genotipe memberikan pengaruh nyata (P<0.05) terhadap kandungan asam heneikosanoat. Domba garut bergenotipe TT (0.04%) memiliki kandungan asam lemak heneikosanoat lebih tinggi dibandingkan genotipe CC (0.03%) dan CT (0.02%) (Tabel 4.4). Hasil konversi komposisi asam lemak marbling domba garut ke mg/100 g ditampilkan pada Tabel 4.5. Asam lemak heneikosanoat merupakan asam lemak yang jarang ditemukan di alam merupakan asam lemak rantai panjang dengan jumlah atom karbon ganjil. Ternak yang diberi ransum dengan konsentrat tinggi, pada proses perpanjangan asam lemak sumber atom karbon berasal dari propionat berbeda dengan ternak