EVALUASI KEMURNIAN GENETIK BENIH JAGUNG HIBRIDA DENGAN MARKA MIKROSATELIT

Transkripsi

1 11 EVALUASI KEMURNIAN GENETIK BENIH JAGUNG HIBRIDA DENGAN MARKA MIKROSATELIT Abstract The development of hybrid varieties should be supported by the availability of high quality seeds. Genetic purity is one of the quality criteria required for successful seed production of maize hybrid. In producing hybrid seeds, it is frequently contaminated by crossed pollen from another variety or the occurrence of selfing. The objectives of this study were 1) to obtain SSR markers specific for male and female parents, 2) to know the effectiveness of SSR markers for the genetic purity testing of maize hybrid seeds. The experiments were conducted at field station at University Farm Cikabayan Bogor Agricultural University, and in the molecular laboratory at Indonesian Center for Agricultural Biotechnology and Genetic Resources Bogor, from April until December Maize hybrid varieties and their parental lines seed used in this research were obtained from Indonesian Cereal Research Institute (ICERI) Maros, South Sulawesi. Five SSR markers selected for parental lines were phi109275, phi96100, phi374118, phi328175, and phi072. The assessment of genetic purity of two hybrid varieties namely cv. Bima-3 and Bima-4, used specific markers from previous experiment. Fourty samples of individual plants from each maize hybrid variety were tested. From five markers tested, three markers namely phi96100, phi and phi072 produced polymorphic bands and capable to distinguish parental line of two maize hybrids. Microsatellite marker phi96100 was specifically used for testing genetic purity of cv. Bima-4 and phi072 for cv. Bima-3. While phi was specific marker for both maize hybrids. The genetic purity test of cv. Bima-3 and Bima-4 indicated that both varieties had purity levels of 97.5% and 80%, respectivelly. This study showed that SSR markers were more reliable for assessing genetic purity as compared to morphological marker. The results of study can be useful in verifying varieties and seed purity testing in the laboratory quickly and accurately. Key words : parental lines, polymorphic bands, quality of maize hybrid seed Abstrak Pengembangan varietas hibrida perlu didukung oleh ketersediaan benih yang bermutu. Kemurnian genetik merupakan salah satu kriteria yang harus dipenuhi untuk keberhasilan produksi jagung hibrida. Tujuan dari penelitian ini adalah 1) mendapatkan marka mikrosatelit (SSR) yang spesifik untuk tetua jantan dan betina, 2) mengevaluasi kemurnian genetik benih jagung hibrida Bima-3 dan Bima-4. Penelitian dilakukan di Laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor, pada bulan April Desember Tetua betina dan tetua jantan jagung hibrida yang digunakan adalah tetua yang digunakan untuk memproduksi benih hibrida Bima-3 dan Bima-4. Sampel benih berasal dari Balai Penelitian Tanaman Serealia (BALITSEREAL) Maros Sulawesi Selatan, dan marka yang diseleksi untuk mendapatkan marka spesifik tetua jantan dan betina yaitu phi109275, phi96100, phi374118, phi328175, dan phi072. Untuk penilaian kemurnian genetik, digunakan dua varietas hibrida yaitu Bima-3 dan Bima-4, dan marka hasil identifikasi spesifik untuk kedua tetua hibrida tersebut. Individu tanaman dari masing-masing varietas yang diuji sebanyak 40 sampel. Dari 5 primer yang diuji, 3 diantaranya menghasilkan pita polimorfis yaitu phi96100, phi dan phi072. Primer phi072 spesifik untuk tetua Bima-3, primer phi96100 spesifik terhadap tetua Bima-4. Sementara primer phi spesifik untuk tetua kedua hibrida yang diuji. Hasil pengujian kemurnian genetik menunjukkan bahwa masing-masing 80% benih hibrida Bima-4 dan 97,5% benih Bima-3 murni secara genetik. Hasil penelitian ini dapat berguna dalam memverifikasi varietas dan uji kemurnian benih di laboratorium secara cepat dan akurat. Kata kunci: galur tetua, mutu benih jagung hibrida, pita polymorpic

2 12 Pendahuluan Jagung merupakan komoditas prioritas yang diprogramkan oleh pemerintah. Beberapa tahun terakhir, produksi jagung belum dapat memenuhi kebutuhan nasional sehingga masih dilakukan impor. Dalam rangka peningkatan produksi dan produktivitas jagung, penggunaan varietas unggul seperti hibrida merupakan salah satu alternatif. Penggunaan varietas unggul hibrida perlu dibarengi dengan penyediaan benih yang bermutu tinggi. Mutu benih mencakup mutu genetis, mutu fisiologis, mutu fisik, dan mutu patologis (Ilyas 2012). Penanaman benih hibrida yang tidak murni secara genetik akan berakibat pada penurunan produktivitas. Sehubungan dengan hal itu diperlukan teknik untuk mengidentifikasi dan menguji kemurnian hibrida dan tetuanya sehingga kualitas genetiknya dapat terjaga. Dengan dirilisnya berbagai varietas jagung hibrida akan menyebabkan kesulitan dalam mengatasi kemurnian genetik, karena secara kasat mata sulit untuk membedakan antara varietas yang satu dengan yang lainnya. Selama ini metode yang digunakan untuk uji kemurnian hibrida dan tetuanya adalah melalui pengamatan keseragaman tanaman di lapang (grow out test), namun cara ini membutuhkan waktu dan sumberdaya yang cukup besar (Komori dan Nitta 2004). Selain itu, estimasi kemurnian karakter morfologi kadang-kadang sering mengalami kesulitan, karena karakter-karakter ini sangat dipengaruhi oleh lingkungan. Teknik seperti ini masih banyak digunakan untuk perlindungan varietas dan standarisasi kemurnian genetik benih jagung di Indonesia. Mutu genetik benih dipengaruhi oleh praktek agronomi dan karakteristik ekologi dari lokasi di mana bibit ditanam. Dalam produksi benih jagung hibrida, sumber utama kontaminasi genetik di lapangan adalah silang diri (selfing) dari induk betina karena detaselling yang tidak sempurna. Selain itu kontaminasi dapat pula terjadi pada saat prosesing benih dan pengelolaan digudang selama penyimpanan. Kontaminasi ini mengurangi mutu genetik dan mutu fisiologis benih yang akibatnya dapat menurunkan produktivitas tanaman. Dengan berkembangnya teknologi biologi molekuler, identifikasi varietas dapat dilakukan dengan bantuan marka molekuler, baik berdasarkan DNA maupun protein. Marka molekuler merupakan alat yang efektif karena deteksinya berdasarkan variasi genetik, yang tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Marka DNA tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan atau fase perkembangan dari tanaman (Tanksley dan McCouch, 1997; Yashihota et al. 2002). Marka mikrosatelit atau marka simple sequence repeats (SSR) memiliki beberapa keunggulan diantaranya adalah tingkat polimorfisme yang tinggi, bersifat kodominan, dan memiliki akurasi yang tinggi. Marka SSR dapat digunakan untuk mengidentifikasi dan memverifikasi suatu varietas tanaman (Maesang et al. 2001; Nunome et al. 2003). Yashitola et al. (2002) mengemukakan bahwa penggunaan marka mikrosatelit dapat menentukan tingkat heterosigositas di antara inbrida inbrida tetua padi hibrida, dan lebih tepat untuk mengetahui tingkat kemurnian benih hibrida. Sejumlah penelitian lain telah dilakukan pada jagung (Senior et al. 1998; Pabendon 2005; Wu et al. 2010), pada padi (Garland et al. 1999; Mulsanti 2011), dan pada tomat hibrida (Liu et al. 2007). Penelitian Daniel et al. (2012) menunjukkan bahwa marka SSR merupakan alat bioteknologi yang mampu mendeteksi kemurnian genetik jagung hibrida. Marka SSR telah terbukti menjadi penanda molekuler yang saat ini lebih banyak digunakan untuk identifikasi

3 13 kemurnian genetik beberapa tanaman (Yashitola et al. 2002), karena efisiensi dan sederhana pelaksanaannya (Wu et al. 2010). Tujuan penelitian ini adalah 1) untuk mendapatkan marka SSR yang spesifik untuk tetua jantan dan betina, dan 2) untuk mengevaluasi kemurnian genetik benih jagung hibrida Bima-3 dan Bima-4. Bahan dan Metode Identifikasi Marka SSR Spesifik Tetua Jantan dan Tetua Betina Jagung Hibrida Percobaan dilaksanakan di laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Tetua jagung hibrida yang digunakan untuk identifikasi marka spesifik adalah tetua varietas Bima-3 (Nei9008/Mr-14) dan Bima-4 (G180/Mr-14). Sampel benih berasal dari Balai Penelitian Tanaman Serealia (Balitsereal) Maros Sulawesi Selatan, sedangkan marka yang digunakan untuk identifikasi spesifik tetua jantan dan betina adalah marka molekuler yang mempunyai tingkat polimorfisme yang tinggi dalam penelitian sidik jari materi-materi hibrida jagung (Pabendon 2005) (Tabel 1). Tabel 1. Marka SSR yang digunakan dalam penelitian Marka SSR phi phi96100 phi phi phi072 Sekuen AAGCTCAGAAGCCGGAGC// GGTCATCAAGCTCTCTGATCG AGGAGGACCCCAACTCCTG// TTGCACGAGCCATCGTAT TACCCGGACATGGTTGAGC// TGAAGGGTGTCCTTCCGAT GGGAAGTGCTCCTTGCAG// CGGTAGGTGAACGCGGTA ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGCCTT// GACAGCGCGCAAATGGATTGAACT Benih masing-masing tetua jagung hibrida ditanam sebanyak 20 individu pada bak plastik dengan menggunakan media tanah. Materi tanaman yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah daun tanaman yang sudah membuka penuh saat berumur 15 hari setelah tanam (HST). Isolasi DNA, amplifikasi dan visualisasi pola pita DNA mengikuti prosedur George et al. (2004) yang dimodifikasi sesuai kondisi laboratorium. Sampel daun diambil dari 20 individu tanaman, dipotong-potong kecil dan dicampur, dimasukkan ke dalam mortal dan ditambahkan nitrogen cair agar mudah digerus. Sampel digerus sampai halus, kemudian diambil 1 g dan dimasukkan ke dalam ependorf, kemudian ditambahkan larutan buffer CTAB 0.7 ml dan ß-mercaptoethanol 10 μl. Tabung ependorf dimasukkan ke dalam waterbath dengan suhu berkisar 65ºC selama 60 menit dan setiap 15 menit membolak-balik tabung agar larutan tercampur dengan baik.

4 14 Setelah proses inkubasi, tabung dikeluarkan dari waterbath dan didinginkan pada suhu ruang selama + 10 menit, kemudian ditambahkan 700 μl clorofom isoamylalkohol (24:1 v/v). Tabung ependorf dibolak-balik agar larutan tercampur dengan baik, kemudian disentrifugasi pada rpm selama 15 menit. Supernatan DNA dipisahkan ke ependorf steril dan ditambahkan 700 μl isopropanol kemudian disimpan dalam freezer selama semalam. Pelet DNA dihasilkan melalui sentrifugase selama 5 menit, kemudian dicuci dengan alkohol 70% dan dikeringkan dengan cara membalik tabung ependorf di atas kertas tissue. Pelet DNA yang telah dicuci, ditambahkan 200 µl buffer 1 x TE. Untuk setiap reaksi PCR digunakan 1.5 µl DNA dan ditambahkan 3 µl buffer (5x), 3 µl Enhancer (5x), 0.3 µl dntp mix (1 µm), 1.0 µl primer (0.5 mm), 0.15 µl Taq DNA polimerase, dan 6.05 µl ddh 2 O. Larutan tersebut masing-masing ditutup dengan satu tetes mineral oil. Proses amplifikasi terdiri atas beberapa tahap yaitu tahap denaturasi awal pada 94 o C selama 2 menit, denaturasi-1 94 o C selama 0.5 menit, 56 o C selama 1 menit annealing, 72 o C selama 1 menit extention, 72 o C selama 5 menit extention tambahan. Siklus diulang 29 kali dan berakhir dengan siklus pemanjangan pada 4 o C. Produk PCR ditambahkan 4 µl loading dye pada masing-masing sumur, dan dielektroforesis dengan menggunakan PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) 6% pada tegangan 100 Volt selama 65 menit atau hingga bromphenol blue telah mencapai bagian bawah plate. Selanjutnya gel dipisahkan dari plate kaca, dan segera direndam dalam larutan Etidium bromida sambil dishaker selama kurang lebih 10 menit, dan dilanjutkan perendaman dalam air selama 15 menit. Pita-pita DNA dideteksi melalui dengan Bio-Rad Laboratories Segrate Milan Italy. Pengamatan dilakukan terhadap pita spesifik yang terbentuk pada setiap tetua/inbrida yang diuji. Evaluasi Kemurnian Genetik Benih Jagung Hibrida dengan Marka SSR Pengujian kemurnian genetik dilakukan di laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor dan penanaman di lapang dilakukan di University Farm Cikabayan, IPB Bogor. Varietas jagung hibrida yang diuji kemurnian genetiknya yaitu Bima-3 dan Bima-4 berasal dari Balitsereal Maros Sulawesi Selatan, dan marka yang digunakan untuk menguji kemurnian genetik adalah marka yang teridentifikasi polimorfis (spesifik pada tetua jantan atau betina) dari hasil percobaan 1. Percobaan terdiri atas dua bagian. Bagian pertama, berupa pengujian keseragaman tanaman di lapang. Pengujian ini dilakukan dengan menanam varietas yang akan diuji kemurniannya. Sebelum ditanam, benih diberi perlakuan fungisida metalaksil. Penanaman jagung hibrida di lapang satu butir per lubang dengan jarak tanam 0.75 x 0.20 m. Pemupukan dilakukan dua kali yaitu : 1) Pupuk Urea, SP-36, dan KCl dengan dosis masing-masing 100 kg, 200 kg, dan 75 kg ha -1 diberikan pada saat tanaman berumur 7 HST, 2) pupuk Urea, dan KCl dengan dosis masing-masing 200 kg dan 25 kg ha -1 saat tanaman berumur 30 HST. Pengendalian hama penyakit dilakukan sesuai kondisi serangan. Uji keseragaman di lapang dilakukan dengan mengamati karakter morfologi berdasarkan deskripsi varietas hibrida yang diuji. Pengamatan morfologi yang dilakukan antara lain adalah umur 50% berbunga jantan dan betina (hari), tinggi tanaman, tinggi letak tongkol, warna anther dan warna rambut tongkol, warna batang, bentuk tongkol, tipe biji, warna biji, jumlah baris/tongkol, dan bobot 1000 biji.

5 15 Bagian kedua adalah pengujian kemurnian genetik benih menggunakan marka SSR di laboratorium. Sampel tanaman yang diambil sebanyak 40 ditentukan secara acak untuk masing-masing varietas hibrida. Isolasi DNA dengan cara mini-prep dan berdasarkan metoda CTAB Doyle dan Doyle (1990) yang dimodifikasi. Sampel daun muda yang telah membuka penuh diambil pada saat tanaman berumur 15 HST, dimasukkan ke dalam ependorf, kemudian dimasukkan ke dalam box yang berisi es. Isolasi dilakukan dengan menambahkan nitrogen cair, kemudian sampel daun digerus dengan menggunakan sumpit, selanjutnya dilakukan seperti pada percobaan 1. Proses amplifikasi, dan visualisasi pola pita DNA seperti percobaan 1. Persentase tingkat kemurnian genetik hibrida dihitung berdasarkan pola pita yang muncul pada individu tanaman sampel, dengan formula sebagai berikut : Kemurnian hibrida (%) dimana : TS (total sampel) = jumlah sampel/individu tanaman yang diuji NH (non hibrida) = jumlah individu tanaman yang memiliki satu pola pita yang sama dengan tetua betina atau tetua jantan, atau sampel yang tidak mempunyai pita Hasil dan Pembahasan Marka SSR Spesifik Tetua Jantan dan Betina Berdasarkan identifikasi 5 primer, terdapat satu primer (phi96100) teridentifikasi spesifik untuk tetua jantan dan tetua betina hibrida Bima-4 (Mr-14 dan G180), primer phi072 spesifik untuk tetua jantan dan tetua betina Bima-3 (Mr-14 dan Nei9008), dan 1 primer (phi ) teridentifikasi spesifik untuk tetua jantan dan tetua betina kedua hibrida Bima-3 dan Bima-4 (Gambar 2). Primer phi96100, phi072, dan phi dipertimbangkan untuk digunakan dalam pengujian kemurnian genetik hibrida Bima-3 dan Bima-4. Identifikasi kebenaran suatu genotipe tanaman dengan menggunakan satu marka yang polimorfik sudah cukup untuk pengujian kemurnian benih (Yashitola et al. 2002). Gambar 2. Visualisasi fragmen DNA hasil amplifikasi dengan primer SSR pada tetua jantan dan tetua betina jagung hibrida; (G= G180; M=Mr-14; N=Nei9008; L=DNA ladder) (a)

6 16 Kemurnian Genetik Benih Jagung Hibrida Uji kemurnian genetik terhadap 40 sampel individu tanaman hibrida Bima-4 yang diidentifikasi dengan menggunakan primer Phi96100, terdapat tujuh sampel tanaman (no.4,6,8,9,19,31,39) yang serupa dengan pita tetua jantan (Mr-14), dan satu sampel tanaman (no.12) yang serupa dengan pita tetua betina (G180) (Gambar 3). Hasil identifikasi yang menunjukkan terdapat pola pita yang sama dengan tetua jantan, diduga bahwa terjadi percampuran dalam proses panen atau dalam kegiatan prosesing, sedang terdapatnya pola pita yang sama dengan tetua betina menunjukkan bahwa dalam proses produksi terjadi selfing akibat ketidaktepatan dalam melakukan detaseling. Secara keseluruhan dari total sampel tersebut terdapat 20% dari benih Bima-4 tidak murni secara genetik. Gambar 3. Visualisasi pola pita DNA dengan marka SSR phi96100 melalui elektroforesis vertikal 6% PAGE pada hibrida Bima-4. F= tetua betina, M= tetua jantan. F1= No. 1, 2, 3, 40 adalah hibrida Bima-4. Jika dibandingkan dengan pengamatan secara morfologi, marka SSR dapat mengidentifikasi tanaman campuran lebih banyak dalam satu lot benih (Tabel 2). Hal ini menunjukkan bahwa marka SSR lebih akurat dalam mengidentifikasi benih hibrida dibanding pengamatan morfologi. Individu tanaman nomor 31 dan 39 berdasarkan pengamatan morfologi (warna anter) teridentifikasi bukan merupakan hibrida Bima-4. Individu tanaman nomor 31 terdeteksi bukan hibrida Bima-4, baik dengan marka SSR maupun dengan pengamatan morfologi, berbeda dengan tanaman sampel no 39 berdasarkan marka morfologi bukan hibrida ternyata berdasarkan SSR teridentifikasi merupakan hibrida. Tanksley dan McCouch (1997), melaporkan bahwa marka DNA tidak dipengaruhi oleh lingkungan dan/atau fase perkembangan dari tanaman seperti marka morfologi. Tabel 2. Deteksi kemurnian genetik benih hibrida Bima-4 berdasarkan marka SSR dan marka morfologi Metode uji Jumlah Tanaman kemurnian sampel campuran (%) Nomor sampel Marka SSR ,6,8,9,10,12,31,34 Marka morfologi ,39 Pengujian kemurnian genetik terhadap hibrida Bima-3 dengan menggunakan primer phi072, menunjukkan bahwa 97.5% benih hibrida yang diproduksi murni secara genetik, hanya 2.5% yang pola pitanya sama dengan tetua jantan (Mr-14) (Gambar 4). Hal ini diduga bahwa benih yang diuji terjadi percampuran dalam proses panen atau dalam kegiatan prosesing di gudang.

7 17 Gambar 4. Visualisasi pola pita DNA dengan marka SSR phi072 melalui elektroforesis vertikal 6% PAGE pada hibrida Bima-3. F= tetua betina, M= tetua jantan. F1=No. 1, 2, 3, 40 adalah hibrida Bima-3. Individu tanaman nomor 28, berdasarkan pengamatan morfologi (warna rambut tongkol) bukan merupakan hibrida Bima-3, namun pada pengujian dengan marka SSR teridentifikasi sebagai hibrida (Tabel 3). Sementara tanaman nomor 38 teridentifikasi bukan hibrida Bima-3 pada uji SSR, sebaliknya tidak terlihat pada pengamatan morfologi. Mulsanti (2013) melaporkan adanya perbedaan hasil pada uji kemurnian genetik hibrida padi dengan marka SSR dan secara morfologi. Tabel 3. Deteksi kemurnian genetik benih hibrida Bima-3 berdasarkan marka SSR dan marka morfologi Metode Uji kemurnian Jumlah sampel Tanaman campuran (%) Nomor sampel Marka SSR Marka morfologi Secara umum hasil pengamatan karakter morfologi hibrida Bima-3 dan Bima-4 berdasarkan deskripsi varietas (Tabel 4). Karakter morfologi yang secara visual dapat membedakan hibrida dan non hibrida adalah pada warna anter dan warna rambut tongkol, sementara untuk karakter lainnya relatif seragam sesuai dengan deskripsi varietas masing-masing hibrida yang diuji. Karakter morfologi lainnya banyak dipengaruhi lingkungan tumbuh tanaman, sehingga sulit untuk dijadikan dasar penentuan kemurnian benih hibrida. Penilaian varietas tanaman berdasarkan karakter morfologi sangat tergantung dari tingkat keahlian dan pengalaman petugas pemeriksa tanaman. Penilaian yang tidak tepat dalam uji kemurnian benih di lapang dapat menyebabkan kerugian besar pada produsen benih karena kemungkinan tanaman-tanaman yang dinilai sebagai tanaman campuran, secara visual berbeda karena dipengaruhi oleh pemupukan dan atau serangan hama penyakit.

8 18 Tabel 4. Karakter morfologi hibrida Bima-3 dan Bima-4 pada pengujian lapang Cikabayan. Bogor Karakter morfologi Bima-3 Bima-4 Jumlah sampel Tinggi tanaman (cm) % keluar rambut (hari) % keluar pollen (hari) Warna batang Hijau sedikit ungu Hijau Warna anther Krem (100%) Krem (95%) Warna rambut Krem (97.5%) Krem (100%) Bentuk tongkol Silindris Silindris Tinggi letak tongkol (cm) Tipe biji Semi Mutiara Mutiara Jumlah baris/tongkol Warna biji Jingga Jingga Bobot 1000 biji (g) Penampilan tanaman dikendalikan oleh sifat genetik yang sangat dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungan. Jika faktor lingkungan yang memberikan pengaruh yang lebih kuat, maka akan terjadi variasi terhadap morfologi tanaman. Oleh karena itu, karakter morfologi tidak dapat dijadikan dasar penentuan kemurnian genetik varietas tanaman. Penilaian secara morfologi bersifat subjektif dan sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, juga tergantung pada tingkat keahlian dan pengalaman dari petugas pemeriksa tanaman. Dengan demikian, untuk mengontrol kemurnian varietas jagung hibrida dan inbrida pembentuknya secara cepat dan akurat diperlukan alat bantu marka SSR. KESIMPULAN Terdapat 3 marka spesifik (phi96100, phi072, dan phi328175) yang dapat digunakan untuk identifikasi kemurnian genetik jagung hibrida Bima-3 dan Bima-4. Marka phi96100 spesifik untuk tetua jantan dan tetua betina hibrida Bima-4 (Mr-14 dan G180), marka phi072 spesifik untuk tetua jantan dan tetua betina Bima-3 (Mr-14 dan Nei9008), dan marka phi spesifik untuk tetua jantan dan tetua betina kedua hibrida Bima-3 dan Bima-4. Berdasarkan uji dengan marka SSR, benih jagung hibrida varietas Bima-3 dan Bima-4 memiliki kemurnian genetik masing-masing 97.5% dan 80%. Marka SSR dapat mendeteksi kemurnian genetik jagung hibrida secara cepat dan akurat, dimana secara morfologi sulit untuk dideteksi. Marka SSR efektif digunakan untuk uji kemurnian genetik benih jagung hibrida.