IV. Hasil dan Pembahasan

Transkripsi

1 IV. Hasil dan Pembahasan A. Sampling dan Isolasi Bakteri Bakteri dalam penelitian ini diisolasi dari Acropora nasuta (Gambar 2) hasil sampling di Taka Cemara, Karimunjawa, Jepara yang secara geografis berada pada 0, ,6 lintang selatan dan ,9 bujur timur. Pigmen berwarna kuning dihasilkan setelah 24 jam masa inkubasi pada suhu 35 C di media Zobell 2216E Agar (Gambar 3). Gambar 2. Acropora nasuta hasil sampling di Taka Cemara, Karimunjawa, Jepara. 22

2 A B Gambar 3. Koloni bakteri hasil kultur pada Media Zobell 2216E Agar (a) dan Zobell 2216E cair (b). Sedangkan hasil pengamatan menggunakan mikroskop binokuler dengan perbesaran 1000 ditunjukkan pada Gambar 4. Pengamatan mikroskopis menunjukkan bahwa bakteri tersebut berbentuk coccus. Setelah dilakukan pengecatan gram dengan metode gram staining, terjadi perubahan warna koloni menjadi merah, sehingga diketahui bahwa bakteri berjenis gram negatif. Gambar 4. Hasil pengamatan koloni bakteri menggunakan mikroskop binokuler. 23

3 B. Polymerase Chain Reaction 16S rdna Hasil pengecekan terhadap PCR 16S rdna menunjukkan hasil positif dengan terdapatnya berkas DNA isolat bakteri dengan panjang basa yang sesuai yaitu sekitar bp (Gambar 5). M (+) (KJ5) Gambar 5. Elektroforesis PCR 16s rdna. M: Marker ; (+): positif kontrol; KJ5: Berkas DNA bakteri yang diisolasi dari Acropora nasuta dengan panjang basa bp. C. Analisis Data BLAST Homologi Dari analisis sekuensing didapatkan susunan basa parsial 16S rdna isolat bakteri dan kemudian dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (data base) DNA (Altschul dkk., 1997). Hasil análisis BLAST menunjukkan bahwa bakteri yang berasosiasi dengan 24

4 Acropora nasuta memiliki homologi sebesar 96% dengan Erythrobacter flavus Tabel 1. Hasil penelusuran BLAST isolat bakteri KJ5 Kode Bakteri KJ5 Length Closest Relative Homology Accession Erythrobacter NR_ bp 100 % flavus 5.1 Erythrobacter flavus strain LAMA S ribosomal RNA gene, partial sequence. Sequence ID: gb KC Length: 1338Number of Matches: 1 Score Expect Identities Gaps Strand 558 bits(302) 9e /326(96%) 0/326(0%) Plus/Plus Query 2 GCCCTTAGGTTCGGAATAACTCAGAGAAATTTGAGCTAATACCGGATAATGTCTTCGGAC 61 Sbjct 46 GCCCTTAGGTTCGGAATAACTCAGAGAAATTTGAGCTAATACCGGATAATGTCTTCGGAC 105 Query 62 CAAAGATTTATCGCCTTTGGATGGGCCCGCGTAGGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGC 121 Sbjct 106 CAAAGATTTATCGCCTTTGGATGGGCCCGCGTAGGATTAGATAGTTGGTGGGGTAATGGC 165 Query 122 CTACCAAGTCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGA 181 Sbjct 166 CTACCAAGTCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGA 225 Query 182 CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCT 241 Sbjct 226 CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCT 285 Query 242 GATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGNCTNANGGTTGTAAANNNCTTTTACCNNGG 301 Sbjct 286 GATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCAGGG 345 Query 302 ATGATANNGACAGTACNNGGAGAATA 327 Sbjct 346 ATGATAATGACAGTACCTGGAGAATA

5 KB5 KJ5 Isolate Erythrobacter flavus strain SW-46 16S ribosomal RNA, partial sequence Alpha proteobacterium B36 gene for 16S rrna, partial sequence Sphingomonas phyllosphaerae strain FA2 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Erythrobacter sp. MBIC4118 gene for 16S rrna, partial sequence Erythrobacter flavus strain 2PR S ribosomal RNA gene, partial sequence Erythrobacter citreus strain RKHC-1 16S ribosomal RNA gene, complete sequence Erythrobacter gaetbuli partial 16S rrna gene, isolate AMV17 Gambar 6. Pohon filogenetik antara isolat KJ5 dengan bakteri laut lainnya. Genus Erythrobacter ditemukan pertama oleh Shiba & Simidu (1982) yang pada awal penulisannya terdapat 8 spesies : Erythrobacter longus (Shiba dan Simidu, 1982), Erythrobacter litoralis (Yurkov dkk., 1994), Erythrobacter citreus (Denner dkk., 2002), Erythrobacter flavus (dkk., 2003), Erythrobacter aquimaris (Yoon dkk., 2004), Erythrobacter seohaensis (Yoon dkk., 2005), Erythrobacter gaetbuli (Yoon dkk., 2005) dan Erythrobacter vulgaris (Ivanova dkk., 2005). Erythrobacter negatif dengan koloni flavus merupakan bakteri gram berwarna kuning, motil, halus, mengkilap, bulat, tidak berspora dan berbentuk cembung dengan diameter mm setelah 3 hari kultivasi pada 26

6 suhu 30 C. Bakteri ini tumbuh optimal pada suhu C dengan ph optimal 6-7 (Yoon dkk., 2003) Hampir semua spesies yang termasuk ke dalam genus Erythrobacter mampu memproduksi pigmen dan beberapa diantaranya mampu memproduksi bakterioklorofil (BChl) a. Erb. longus dan Erb. litoralis dilaporkan mengandung bakterioklorofil (BChl) a dan karotenoid (Shiba dan Simidu, 1982; Yurkov dkk., 1994), namun pada spesies Erythrobacter lain tidak ditemukan BChl a (Denner dkk., 2002; Yoon dkk., 2003, 2004, 2005; Ivanova dkk., 2005). Spesies Erythrobacter mensintesis pigmen fotosintetik dalam kondisi aerob, namun mereka tidak mampu tumbuh anaerob meskipun dengan kondisi pencahayaan yang sama dengan bakteri fotosintesik lainnya (Shiba dan Simidu 1982). D. Isolasi β-karoten bakteri dengan ekstraksi Ekstraksi β-karoten bakteri dilakukan menggunakan pelarut aseton murni (Khalil dan Varananis, 1996). Ekstraksi bakteri dilakukan dengan menumbuhkan sampel bakteri ke dalam media padat Zobell sebanyak 10 petri. Dari hasil ektraksi pigmen bakteri dengan aseton diperoleh pigmen berwarna kuning dengan serapan ekstrak kasarnya pada gelombang nm (Gambar 7). Berat basah sampel β-karoten 27

7 diperoleh 0,42 gram dengan kadar air 47,10%. Selanjutnya dilakukan identifikasi pigmen bakteri dan analisis kandungan pigmen dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Absorbansi (mau) A Panjang gelombang (nm) B Gambar 7. Pigmen bakteri berwarna kuning hasil ekstraksi dengan aseton (A) ; Spektrum serapan ekstrak kasar pigmen dalam pelarut aseton (B). E. Analisis β Karoten dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dan Photo Diode Array (PDA) Analisis ekstrak aseton Erb. flavus dengan KCKT berhasil mengidentifikasi beberapa pita yang diketahui tergolong ke dalam pigmen fotosintetik dominan. Diantara beberapa puncak yang muncul tersebut terdapat 1 puncak yang muncul pada menit-menit terakhir (60,24 28

8 menit) yang diidentifikasi sebagai β-karoten dengan puncak serapan (427),449,477 nm A Absorbansi (mau) Waktu Tambat (menit) Absorbansi (mau) Panjang Gelombang (nm) B C Gambar 8. Kromatogram KCKT ekstrak pigmen Erb. flavus yang dideteksi pada panjang gelombang 450 nm (A); Gambar 2 dimensi ekstrak pigmen Erb. flavus (B); Spektrum serapan dari puncak pada waktu tambat 60,24 min (C). 29

9 Untuk memperkuat hasil analisa, pigmen pada waktu tambat 60,24 yang diduga sebagai pigmen β karoten ditampung dan dikeringkan kemudian diukur spektrum serapannya menggunakan spektrofotometer UV-Tampak pada panjang gelombang nm dengan beberapa pelarut yang berbeda (Gambar 9) Absorbansi (mau) Panjang Gelombang (nm) Gambar 9. Pola spektra β-karoten pada panjang gelombang nm dengan pelarut aseton (..); etanol (--) dan heksana (-). Dari hasil analisa UV-Tampak dengan 4 jenis pelarut yang berbeda, terlihat bahwa pola serapan dan puncak maksimum spektra yang muncul hampir sama. Pola serapan dan puncak I, II, III, pigmen murni tersebut merupakan pola serapan β-karoten (Britton dkk., 1995; Hegazi dkk., 1998; Jeffrey dkk., 1997). 30

10 Tabel 2. Perbandingan panjang gelombang maksimum β- karoten pada beberapa pelarut Pelarut Aseton Etanol n-heksana Eluent Britton dkk., (1995) Jeffrey dkk., (1997) Hegazi dkk., (1998) Hasil pengukuran - 425,450, ,453, ,449, ,450, , 453, 476 (III/II=21%) (III/II=36%) (III/II=22%) ,449, ,452, ,451, ,454, ,450, ,449, 477 (III/II=20%) (III/II=11%) (III/II=33%) (III/II=13%) Hingga saat ini belum ditemukan penelitian yang berhasil mengidentifikasi β-karoten pada Erb. flavus, namun Koblizek dkk. (2003) telah berhasil mengidentifikasi β-karoten dari genus Erythrobacter yaitu Erb.longus yang diisolasi dari Samudera Atlantik, Samudera Pasifik, Laut Mediterania dan Samudera Hindia. Kurang lebih 18 jenis pigmen berhasil diidentifikasi dari Erb. longus pada beberapa kondisi kultur yang berbeda. Karotenoid tersebut memiliki 3 struktur yang sangat berbeda, yaitu bisiklik, monosiklik dan asiklik, dimana karotenoid golongan polar merupakan karotenoid dominan pada spesies tersebut (70% dari total karotenoidnya). Dibandingkan dengan bakteri fotosintetik lainnya, Erb. longus memiliki jumlah karotenoid yang 31

11 lebih variatif (Takaichi dkk., 1990). Erb. longus memiliki Reaction Centers (RCs) dan B865 complexes (dimana tidak ada komplek pemanen cahaya lain pada spesies ini) (Shimada dkk., 1985). Oleh karenanya Erb. longus memiliki komposisi pigmen yang spesifik, yang tidak ditemukan pada bakteri fotosintetik lainnya. Total karotenoidnya jauh lebih banyak daripada bakterioklorofilnya, berbeda dengan bakteri fotosintetik lainnya yang perbandingan karotenoid dan bakterioklorofilnya sebanding (Takaichi dkk, 1990). β- karoten dan turunannya merupakan komponen karotenoid dominan pada mikroorganisme ini. Jenis pigmen tersebut sangat jarang ditemukan pada bakteri fotosintetik lainnya kecuali pada Rhodomicrobium vannielii dalam jumlah yang relatif sedikit (Ryvarden dan Liaaen- Jensen, 1964). Selain Erb. longus, Baskar dkk. (2010) juga berhasil mengidentifikasi β-karoten dari Streptomyces sp. yang diisolasi dari sponge. Kruqel dkk, (1999) juga melaporkan bahwa karotenoid golongan aromatik telah berhasil ditemukan pada spesies Streptomyces sp. yang lain. Pada Streptomyces sp. produksi karotenoid terjadi secara konstitutif dan tergantung pada cahaya (Koyama dkk., 1976). 32

12 Informasi mengenai jalur sintesis maupun beberapa gen yang terlibat dalam proses sintesis β-karoten pada genus Erythrobacter dapat kita temukan dalam genome database. Diantaranya adalah β carotene ketolase dan β carotene hydroxylase yang telah berhasil disekuen Oh dkk. (2009) dari spesies Erythrobacter litoralis HTCC2594. F. Kuantifikasi Kandungan β-karoten Untuk menghitung kandungan pigmen β-karoten pada bakteri Erb. flavus, fokus area yang diambil yaitu pada tr 59,73 60,65 sesuai hasil analisa KCKT sebelumnya (Indrawati dkk., 2013). Tabel 3. Luas puncak, yield dan berat kering kandungan β- karoten Luas puncak rata-rata Y (µg/ml) C (µg/g berat kering) 1166, Dengan persamaan, Y = X Dimana : X = Luas puncak serapan Y = Konsentrasi (mikrogram/ml) Maka, Y = (0,0108 x 1166,1688) + 12,677 Y = 12, ,64 Y = 25,27 µg/0,5 ml Y = 12,64 µg/ml (2x pengenceran) Berat sampel basah adalah 0,421 gr, 33

13 Jadi, Yield = 12,64 µg/0,42 gr atau 30,01 g/g Jika kadar air sampel 47,10% maka : Yield = 30,01 µg/0,53 g berat kering = 56,74 µg/1 g berat kering Jadi berat kering β-karoten Erb. flavus adalah 56,74 µg/ g berat kering Jumlah kandungan β-karoten yang dihasilkan Erb. flavus ini masih dibawah kandungan β-karoten yang mampu diproduksi oleh Dunaliella salina yang berkisar 10% dari berat keringnya (Prieto dkk., 2011). Selain dari golongan mikroalga, fungi dari jenis wild type Phycomyces blakesleeanus juga dilaporkan mampu mensintesis β- karoten sekitar 0.05 mg/g berat kering dalam kondisi normal, dan bahkan mencapai 10 mg untuk tipe mutantnya (Murillo dkk., 1978). Sedangkan untuk fungi jenis Blakeslea trispora, dengan stimulasi seksual pada jalur biosintesis karotenoidnya, mampu meningkatkan produksi β-karoten hingga 35 mg/g (Mehta dkk., 1997). Namun demikian, kandungan karotenoid pada Erb. flavus ini masih lebih tinggi jika dibandingkan dengan Streptomyces sp. yang hanya mampu memproduksi β- karoten 4,88 µg per 100 gram (Baskar dkk., 2010). Meskipun jumlah kandungan β-karoten yang dihasilkan Erb. flavus masih relatif sedikit, bakteri tersebut sangat berpotensi dalam menghasilkan β- 34

14 karoten. Optimasi pada kondisi kultur dan lingkungannya bisa dilakukan untuk mengoptimalisasi produksi β- karoten pada Erb. flavus. Choudhari dan Singhal (2008) berhasil mengoptimalisasi produksi β-karoten pada Blakeslea trispora hingga 1,209 μg/ml dengan menambahkan laktosa sebagai sumber karbon. Laktosa dapat dengan mudah diasimilasi pada jalur metabolis β- karoten, begitupula dengan glukosa. Beberapa teknologi juga telah digunakan untuk kultivasi Dunaliella sp. secara komersial (Ben-Amotz, 1993). Ketika Dunaliella sp ditumbuhkan pada kondisi terbatas, β-karoten dalam jumlah besar berhasil disintesis dan diakumulasi (Borowitzka dkk., 1984). Muthukannan dkk. (2010) juga berhasil mengoptimalisasi produksi β-karoten Dunaliella sp dengan mengoptimasi parameter kondisi kulturnya seperti ph dan intensitas cahaya. Parameter tersebut sangat bermanfaat untuk megetahui kadar nutrisi yang digunakan pada medium pertumbuhannya (De walne s medium) (Oreset dan Young, 1999). Selain itu, dengan rekayasa genetika, Sacharomyces cerevisiae juga dilaporkan mampu meningkatkan produksi β-karotennya hingga 200% dengan optimasi spesifik gen crti dan crty (Li dkk., 2013). Misawa dkk. (1991) juga berhasil menyisipkan gen crtb, crte, crti, crty dari Erwinia uredovora yang mengkode sitesis β-karoten 35

15 ke dalam Zymomonas mobilis dan Agrobacterium tumefaciens. Dari penelitian tersebut diperoleh bahwa Z.mobilis dan A.tumefaciens memiliki koloni berwarna kuning dan mampu memproduksi β-karoten hingga 220 µg untuk Z. mobilis mutan dan 350 µg untuk mutan A. tumefaciens per gram berat kering pada fase stationer di medium cair. Dengan menambahkan mineral atau sumber karbon lain pada medium kultivasi, mengoptimasi parameter pertumbuhan seperti ph, intensitas cahaya dan suhu optimal pertumbuhan kultur maupun melakukan rekayasa genetika pada jalur biosintesis β- karoten diharapkan bisa menjadi solusi untuk meningkatkan produksi β-karoten pada Erb. flavus. 36