BAHAN DAN METODE. Hrp -, IAA +, BPF Hrp -, IAA + + , BPF Hrp. , BPF Hrp -, IAA +, BPF + Hrp. , BPF Hrp. , BPF Hrp. Penambat Nitrogen Penambat Nitrogen

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB dan lahan pertanian Kampung Bongkor, Desa Situgede, Karang Pawitan-Wanaraja, Kabupaten Garut, Jawa Barat mulai bulan Agustus 2011 sampai Juni Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian terdiri dari 8 isolat PGPR pelarut fosfat yang diisolasi dari Cirebon, Jawa Barat dari galur Bacillus sp. Cr dan Pseudomonas sp. Crb yang dikoinokulasi dengan bakteri penambat nitrogen Bradyrhizobium japonicum yaitu Bj 11 wt dan Bj 11 (19) (Tabel 1). Mutan Bj 11 (19) diperoleh melalui mutagenesis transposon dengan marker seleksi antibiotik rifampisin dan kanamisin. Media pertumbuhan bakteri yang digunakan terdiri dari Nutrient Agar (NA) (NB, nutrient broth 8 g l -1 dan agar 20 g l -1 ), King s B agar (Bactopeptone 20 g l -1, K 2 HPO g l -1, MgSO 4.7H 2 O 1.5 g l -1, gliserol 1.5 ml l - 1, dan agar 20 g l -1 ), dan Yeast Manitol Agar (YMA) (manitol 10 g l -1, K 2 HPO g l -1, MgSO 4.7H 2 O 0.2 g l -1, NaCl 0.2 g l -1, yeast extract 1 g l -1, dan agar 20 g l -1 ). Tabel 1 Galur bakteri yang digunakan dalam penelitian Galur bakteri Karakteristik Sumber atau referensi Bacillus sp. Cr 22 Cr 28 Cr 68 Cr 69 Pseudomonas sp. Crb 1 Crb 16 Crb 93 Crb 94 Bradyrhizobium japonicum Bj 11 wt Bj 11 (19) -, IAA + -, IAA + + -, IAA + -, IAA + + Penambat Nitrogen Penambat Nitrogen + + Wahyudi et al Wahyudi et al Keterangan: -, tidak menginduksi reaksi hipersensitif; IAA +, menghasilkan asam indol asetat; BPF +, memiliki kemampuan melarutkan fosfat

2 10 Media Pikovskaya (glukosa 10 g l -1, (NH 4 ) 2 SO g l -1, NaCl 0.2 g l -1, MgSO 4.7H 2 O 0.1 g l -1, KCl 0.2 g l -1, ekstrak khamir 0.5 g l -1, MnSO 4.H 2 O g l -1, dan FeSO 4.7H 2 O g l -1 pada ph 7 dengan penambahan sumber fosfat tri-kalsium fosfat [Ca 3 (PO 4 ) 2 ] pada konsentrasi 0.5%) digunakan untuk menguji bakteri pelarut fosfat. Pengkulturan bakteri dilakukan menggunakan media susu skim dan molase (susu skim 20 g l -1, MgSO g l -1, K 2 HPO g l -1, molase 15 g l -1 ) dan diformulasi ke dalam bahan pembawa (gambut 85%, kapur pertanian 5%, dan fosfat alam 10%). Kedelai varietas Anjasmoro digunakan sebagai tanaman model untuk aplikasi inokulan bakteri. Metode Peremajaan Bakteri Peremajaan galur-galur bakteri yang digunakan dilakukan dengan menggoreskan bakteri pada media padat yang sesuai yaitu King s B agar, nutrien agar (NA), dan yeast manitol agar (YMA) masing-masing untuk Pseudomonas sp., Bacillus sp., dan B. japonicum. Pada media YMA untuk Bj 11 ditambahkan antibiotik rifampisin (50 µg ml -1 ) dan pada media YMA untuk Bj 11 (19) yang merupakan mutannya hasil mutagenesis transposon, ditambahkan antibiotik rifampisin (50 µg ml -1 ) dan kanamisin (50 µg ml -1 ). Uji Kemampuan Bakteri PGPR dalam Melarutkan Fosfat Bakteri PGPR dari galur Bacillus sp. Cr dan Pseudomonas sp. Crb diuji kemampuannya dalam melarutkan fosfat dengan cara menumbuhkan bakteri tersebut pada media agar cawan Pikovskaya dengan penambahan Ca 3 (PO 4 ) 2 0.5%. Bakteri tersebut kemudian diinkubasi selama 2-3 hari untuk dilihat penampakan zona beningnya. Keberadaan zona bening menunjukkan bakteri positif dapat melarutkan fosfat. Selanjutnya dilakukan pengukuran indeks pelarutan (solubilizing index, SI) yaitu nisbah diameter zona bening terhadap diameter koloni bakteri (Premono 1998) atau menurut persamaan sebagai berikut:

3 11 Kuantifikasi Jumlah Fosfat Terlarut pada Media Cair Kuantifikasi jumlah fosfat yang dilarutkan oleh bakteri dilakukan dengan bantuan spektrofotometer menggunakan metode asam askorbat seperti dijelaskan oleh Alam et al. (2002). Kultur starter bakteri uji berusia 24 jam dipindahkan sebanyak 2.5% volume ke dalam media Pikovskaya cair. Selanjutnya diinkubasi pada inkubator bergoyang. Untuk mengukur konsentrasi fosfat dalam media pertumbuhan tersebut, kultur bakteri disentrifugasi pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit hingga dihasilkan supernatan. Sebanyak 1 ml supernatan ditambahkan dengan 9 ml air destilata dan 2.5 ml reagen. Reagen tersebut terdiri dari larutan A yaitu 12 g ammonium molybdate dalam 250 ml air destilata dan mg antimony potassium tartrate dalam 1000 ml asam sulfat 5 N (kedua larutan ini dicampurkan dan volumenya dijadikan 2000 ml) serta larutan B yaitu 0.74 g asam askorbat dalam 140 ml larutan A. Campuran supernatan dan reagen didiamkan selama 15 menit untuk membentuk warna biru yang sempurna kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 880 nm. Sebagai standar untuk menentukan konsentrasi fosfat pada larutan digunakan larutan H 3 PO 4 (Titrisol) dari Merck yang diencerkan serial hingga didapatkan konsentrasi fosfat sebesar 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, dan 2.25 ppm. Larutan standar kemudian direaksikan dengan reagen yang sama selama 15 menit dan diukur pada panjang gelombang 880 nm. Pengukuran kadar fosfat pada supernatan dilakukan dengan interval waktu 0, 6, 12, 24, 48, dan 72 jam setelah inokulasi. Perubahan ph pada media juga diukur menggunakan ph meter dengan interval waktu yang sama. Media yang tidak diinokulasikan bakteri digunakan sebagai kontrol. Sumber P yang diuji yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 sebanyak 0.5%. Formulasi Inokulan Bakteri Pelarut Fosfat Bakteri PGPR yang digunakan ditumbuhkan dalam media alternatif susu skim molase cair sebanyak 100 ml dan diinkubasi menggunakan inkubator bergoyang. Waktu inkubasi bakteri disesuaikan dengan jenis bakterinya. Waktu inkubasi untuk isolat Crb yaitu selama 24 jam, isolat Cr berkisar antar jam, dan untuk isolat Bj lama inkubasinya 120 jam. Bakteri yang tumbuh dan telah mencapai kepekatan antara cfu ml -1 kemudian dicampurkan menjadi satu dengan perbandingan 1:1:1. Kultur kombinasi bakteri tersebut kemudian

4 12 disuntikkan sebanyak 15 ml menggunakan syringe steril kedalam 50 g media pembawa berupa campuran gambut 85%, fosfat alam 10%, dan kapur pertanian 5% yang telah disterilkan. Selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang. Pemilihan komposisi bakteri penyusun paket inokulan disesuaikan dengan hasil penelitian sebelumnya dimana keempat komposisi tersebut paling efektif dalam memacu pertumbuhan tanaman kedelai pada percobaan rumah kaca (Sari 2011). Komposisi paket inokulan disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Formulasi bakteri dan komposisinya yang digunakan dalam penelitian Formulasi F1 F2 F3 F4 Isolat bakteri Bacillus sp. Pseudomonas sp. B. japonicum Cr 22 Crb 1 Bj 11 wt Cr 28 Crb 16 Bj 11 (19) Cr 68 Crb 93 Bj 11 wt Cr 69 Crb 94 Bj 11 (19) Uji Viabilitas Inokulan Bakteri Uji viabilitas inokulan dilakukan untuk mengamati daya tahan bakteri tersebut di dalam bahan pembawa berupa gambut selama masa inkubasi pada suhu ruang. Pengamatan dilakukan selama 9 bulan dengan mencawankan bakteri secara berkala. Sebanyak 10 gram paket inokulan yang terdiri dari Bacillus sp. Cr, Pseudomonas sp. Crb, dan B. japonicum dilarutkan dalam 90 ml larutan NaCl 0.85% steril selanjutnya dilakukan pengenceran serial dengan memindahkan 1 ml larutan ke dalam 9 ml NaCl 0.85% hingga kepekatannya menjadi 10-8 sel ml -1. Sebanyak 100 µl suspensi dari tiga pengenceran terakhir yaitu 10-6, 10-7, dan 10-8 disebar pada tiga media agar cawan yang berbeda yaitu NA untuk isolat Bacillus sp. Cr, King s B agar untuk Pseudomonas sp. Crb, dan YMA untuk B. japonicum. Media tersebut dibuat selektif dengan menambahkan antibiotik dengan dosis tertentu untuk beberapa galur (Tabel 3) (Sari 2011), kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 1-2 hari untuk isolat Bacillus sp. Cr dan Pseudomonas sp. Crb serta 5-7 hari untuk B. japonicum.

5 13 Tabel 3 Antibiotik yang ditambahkan ke dalam media agar untuk menumbuhkan masing-masing bakteri Isolat bakteri Antibiotik Cr 22 - Cr 28 - Cr 68 Ampisilin (20 µg ml -1 ) Cr 69 - Crb 1 Ampisilin (20 µg ml -1 ) Crb 16 Ampisilin (20 µg ml -1 ) Crb 93 - Crb 94 Streptomisin (20 µg ml -1 ) Bj 11 (wt) Rifampisin (50 µg ml -1 ) Bj 11 (19) Rifampisin (50 µg ml -1 ), Kanamisin (50 µg ml -1 ) Uji Keefektivan Inokulan terhadap Tanaman Kedelai Sampel tanah yang digunakan untuk aplikasi pupuk hayati juga dihitung jumlah bakteri totalnya melalui metode total plate count (TPC) menggunakan media Standard Methods Agar (SMA). Sedangkan jumlah bakteri kelompok rhizobium yang terdapat pada sampel tanah dihitung dengan menyebar hasil pengenceran serial sampel tanah pada media YMA dengan penambahan antibiotik rifampisin 20 µg/ml dan Kongo red 0.25%. Kandungan nitrogen, fosfor, dan kalium (NPK) tersedia dalam tanah sebelum tanam dianalisis melalui jasa laboratorium Balai Penelitian Tanah, Bogor, Indonesia. Uji keefektivan inokulan terhadap tanaman kedelai dilakukan ditanah pertanian Desa Situgede, Kabupaten Garut, Jawa Barat. Tanah tersebut telah digemburkan sebelum digunakan untuk menanam benih kedelai. Biji kedelai varietas Anjasmoro diseleksi untuk mendapatkan biji dengan kualitas yang baik. Biji yang telah diseleksi tersebut selanjutnya dibasahi dengan air lalu dicampurkan dengan paket inokulan bakteri hingga merata pada permukaan biji. Biji yang telah dilumuri dengan inokulan tersebut kemudian ditanam dengan jarak tanam 40 x 15 cm pada plot tanaman sebesar sebesar 3.9 x 4 m 2. Masing-masing lubang diisi dengan 2 buah biji kedelai. Untuk perlakuan tertentu, tanah yang digunakan sebelumnya diberi pupuk NPK dengan dosis yang telah ditentukan yaitu urea 50 kg ha -1, SP kg ha -1, dan KCl 60 kg ha -1 (Purwono & Purnamawati 2007). Hasil konversi dosis pupuk setiap plot disajikan pada Tabel 4.

6 14 Rancangan Percobaan dan Analisis Data Aplikasi pupuk hayati terhadap tanaman kedelai dalam penelitian ini mengikuti pola rancangan acak kelompok (RAK) menggunakan 15 perlakuan (Tabel 4) dengan 3 ulangan dalam tiap blok. Respon pertumbuhan vegetatif tanaman kedelai terhadap pemberian inokulan diamati pada 45 hari setelah tanam. Parameter pertumbuhan yang diamati meliputi berat basah dan berat kering tajuk, berat basah dan berat kering akar/bintil akar, jumlah bintil akar, dan jumlah serapan hara mineral N, P, dan K pada tanaman. Kemudian dilanjutkan hingga tahap produksi biji kedelai yang total masa tanamnya mencapai 3 bulan. Setelah 3 bulan, tanaman kedelai dipanen untuk selanjutnya dihitung jumlah polong isi dan polong kosong, berat polong, berat biji total, dan berat 100 biji. Pengukuran serapan NPK oleh tanaman dan kadar NPK pada tanah setelah tanam dilakukan menggunakan jasa laboratorium Balai Penelitian Tanah, Bogor, Indonesia. Data hasil penelitian dianalisis menggunakan analisis ragam (uji F) dengan taraf 5% yang kemudian jika hasilnya nyata akan dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf nyata α = 0.05 menggunakan program software SPSS Tabel 4 Perlakuan tanam untuk uji keefektivan inokulan terhadap pertumbuhan tanaman kedelai Perlakuan Formulasi Dosis pupuk (g/plot) Urea SP36 KCl F1 + NPK F1 + ½ NPK F1 F2 +NPK F2 + ½ NPK F2 F3 +NPK F3 + ½ NPK F3 F4 +NPK F4 + ½ NPK F4 NPK ½ NPK Kontrol Keterangan: menggunakan paket inokulan; - tidak menggunakan paket inokulan; luas 1 plot ukurannya 3.9 x 4 m 2