PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK

Transkripsi

1 PENUNTUN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK Disusun Oleh: Taruni Sri Prawasti Yohana C. Sulistyaningsih Dorly Berry Juliandi Juliarni JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN IPA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2 Kata Pengantar Buku penuntun praktikum Mikroteknik ini merupakan tulisan yang disusun untuk memenuhi kebutuhan para mahasiswa yang mengikuti praktikum mata ajaran Mikroteknik di Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Buku penuntun ini diharapkan dapat memberi bekal teori dan petunjuk-petunjuk kelancaran pelaksanaan praktikum. Materi yang terkandung dalam buku ini merupakan kumpulan dari acara-acara praktikum yang disusun berdasarkan topik perkuliahan meliputi penyiapan sediaan mikroskopis jaringan hewan dan tumbuhan, pengenalan mikroskop elektron dan fotomikroskop. Penyusun mengucapkan terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan buku penuntun praktikum ini. Bogor, Agustus 2014 Penyusun iii

3 iv

4 Daftar Isi Kata Pengantar iii Daftar Isi v Materi Hewan: SEDIAAN APUS (SMEAR) 1 SEDIAAN UTUH 2 MASERASI HEWAN 3 SEDIAAN SAYATAN 4 PEWARNAAN NISSL 5 HISTOKIMIA 6 SEDIAAN UTUH (WHOLE MOUNT) HEWAN 7 Materi Tumbuhan: WHOLE MOUNT TUMBUHAN 9 SEDIAAN SEGAR MITOSIS TUMBUHAN 10 SEDIAAN SEGAR MIOSIS TUMBUHAN 11 SEDIAAN PERMANEN MITOSIS & MEIOSIS TUMBUHAN 12 MASERASI TUMBUHAN 13 HISTOKIMIA TUMBUHAN 14 SEDIAAN IRISAN TUMBUHAN 15 PENGENALAN MIKROSKOP ELEKTRON PAYARAN (Scanning Electron Microscope) 17 PENGENALAN FOTOMIKROSKOP (Optiphot-2) 18 v

5 vi

6 SEDIAAN APUS (SMEAR) Tujuan : Membuat sediaan olesan dari substansi berupa cairan. Bahan : Darah, ikan, katak, cicak, burung, dan tikus; Protozoa dalam kultur, protozoa komensal. Metode : Smear (apus) tipis. A. Darah 1. Ambil darah dengan spuit yang berisi heparin. 2. Teteskan pada gelas obyek bersih. 3. Buat apus tipis dengan bantuan gelas obyek yang lain, kemudian kering anginkan. a. Teteskan darah pada gelas obyek A, pasang gelas obyek B di kiri tetes darah membentuk sudut 45 dengan A. b. Tarik gelas obyek B ke kanan sampai menyentuh tetesan darah. c. Setelah terbentuk kapiler, dorong gelas obyek B dengan cepat ke kiri. d. Apus darah pada gelas obyek A. 4. Fiksasi dengan metanol 5 menit. 5. Kering anginkan. 6. Warnai dengan pewarna Giemsa 3% selama 30 menit (Giemsa stock = 30%, encerkan pada saat akan dipakai). 7. Cuci dengan akuades. 8. Kering anginkan. 9. Periksa dengan mikroskop perbesaran 1000x. B. Protozoa dalam kultur atau Protozoa dalam garam fisiologis 1. Teteskan cairan yang mengandung Protozoa pada gelas obyek. 2. Periksa dengan mikroskop apakah Protozoa yang dimaksud ada. 3. Goyangkan agar terbentuk lapisan tipis pada gelas obyek. 4. Kering anginkan. 5. Celupkan pada akuades. 6. Fiksasi dengan alkohol 70% 2-3 menit. 7. Warnai dengan pewarna hemaktosilin 1% dalam air 1-2 menit. 8. Cuci dengan air. 9. Dehidrasi dengan etanol bertingkat. 10. Penjernihan dengan xilol. 11. Tutup dengan perekat entellan. 1

7 SEDIAAN UTUH Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh. Bahan : a. Cacing pipih b. Kutu c. Bentos Pewarna : Carmine alum. Eosin 1% dalam air. A. Cacing pipih 1. Cacing dijepit di antara 2 gelas obyek, ikat dengan karet. 2. Masukkan ke fiksatif (etanol 70% atau formalin 4%) 2 x 24 jam. 3. Lepaskan cacing dari gelas benda, fiksir lagi beberapa jam. 4. Cuci. Jika fiksatifnya etanol 10%, cuci dengan etanol 50%, lalu dengan akuades. Jika fiksatifnya formalin 4%, cuci dengan akuades. 5. Warnai dengan eosin 1% akuosa 24 jam atau carmine alum 3-4 jam. 6. Cuci dengan air. 7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat. Etanol 30%, 50%, 70%. 95%, 100%, masing-masing 15 menit. 8. Penjernihan dengan lactophenol 30 menit dan xilol 2 x 15 menit. 9. Tempel pada gelas obyek dengan perekat entellan. B. Kutu, pinjal 1. Kutu, pinjal, difiksasi dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam. 2. Pindahkan ke KOH 10%. Lama penyimpanan dalam KOH tergantung ketebalan kutin dari spesimen (pinjal ±6 hari, kutu ±1 hari). 3. Cuci dengan akuades. 4. Dehidrasi dengan etanol 50%, 70%, 95%, 100% masing-masing 10 menit. 5. Pindahkan ke minyak cengkeh sampai tampak jernih (±15-30 menit). 6. Pindahkan ke xilol 110 menit, lalu xilol II10 menit. 7. Atur di atas gelas obyek, tutup dengan perekat entellan. C. Bentos 1. Bentos yang sudah bersih difiksasi dengan etanol 70% minimal 24 jam. 2. Cuci dengan akuades. 3. Warnai dengan eosin 1% dalam air 24 jam. 4. Cuci dengan air. 5. Dehidrasi dengan etanol bertingkat, masing-masing 10 menit. 6. Penjenuhan dengan xilol 2x15 menit. 7. Letakkan pada gelas benda dan ditutup dengan entellan. 2

8 MASERASI HEWAN Bahan : Tulang ayam Sediaan : Penampang bujur tulang ayam. Metode : Maserasi - gosok. 1. Potongan tulang dimaserasi (direndam) dalam air 2 x 24 jam. 2. Keringkan dalam oven. 3. Potong dengan gergaji halus (membujur). 4. Tempelkan pada kayu. 5. Gosok pada batu pengasah atau amplas halus sampai tipis. 6. Tempel pada gelas obyek. 3

9 SEDIAAN SAYATAN Tujuan : Membuat sediaan sayatan organ hewan. Bahan : Organ hewan (jantung, usus, ovarium, dan sebagainya). Metode : Parafin 1. Hewan dibius dengan kloroform atau eter, bedah dan ambil organ yang diperlukan. 2. Organ yang akan diproses dicuci dengan garam fisiologis. 3. Potong dengan pisau tajam dengan ukuran kira-kira ½ cm. 4. Fiksasi dengan larutan FAAAC atau Bouine minimal 24 jam (tergantung jenis organ dan ukurannya). Komposisi FAAAC Komposisi Bouine Formalin 40% 100 ml Formalin 15 ml Asam asetat glasial 50 ml Asam pikrat jenuh 5 ml Akuades 850 ml Asam asetat glasial 1 ml CaCI 2.2H gram 5. Pencucian: larutan fiksatif dibuang dan dicuci beberapa kali dengan akuades. 6. Dehidrasi: dengan etanol bertingkat 30%, 50%, 70%, 95%, 100% masingmasing menit tergantung organ yang diproses. 7. Penjernihan: dengan xilol 30 menit. Apabila belum transparan, waktu penjernihan ditambah. 8. Infiltrasi: jaringan dimasukkan ke dalam infiltran Parafin:xilol (1:1) 30 menit Parafin I 30 menit Parafin II 30 menit Parafin III 30 menit Semua langkah infiltrasi dikerjakan di dalam oven. Parafin yang dipakai harus sama dengan titik lebur parafin untuk embedding. 9. Embedding: cetak blok parafin dalam kotak-kotak dan atur letak/posisi organ sesuai dengan tujuan. 10. Penyayatan: Blok dipasang pada holder, rapikan, sisi atas sejajar dengan sisi bawah. Holder dipasang pada tempatnya di mikrotom putar. Sayat dengan ketebalan 6 μm. 11. Penempelan: Tempelkan sayatan pada gelas obyek dengan perekat entellan. 12. Pewarnaan: pewarnaan ganda hemaktosilin - eosin. Deparafinasi dengan xilol 3x5 menit. Masukkan ke etanol 95%, 80%, 70%, 50% masing-masing beberapa celupan. Masukkan ke zat warna hemaktosilin aquosa ±2 menit. Cuci dengan air. Masukkan ke etanol 30%, 50%, 70%. Warnai dengan eosin 1% dalam etanol 70% 1-2 menit. Dehidrasi dengan etanol bertingkat 70%. 80%, 95%, 100% beberapa celupan. Penjernihan dengan xilol 2x5 menit. Tutup dengan gelas penutup dengan perekat entellan. 4

10 PEWARNAAN NISSL Tujuan : Melakukan pewarnaan Nissl dengan thionine, yang secara spesifik mewarnai DNA dan substansi Nissl (RNA) untuk mempelajari struktur umum otak mencit. Dasar : Pewarnaan Nissl dikembangkan oleh Franz Nissl ( ) saat ia mempelajari patologi sel-sel di otak. Dengan metode ini, DNA dan RNA yang bermuatan negatif akan berwarna biru, sehingga dapat memberikan gambaran umum struktur suatu organ secara cepat. Oleh sebab itu, pewarnaan Nissl menjadi terkenal dan digunakan secara luas di kalangan peneliti yang memerlukan kajian histologi dalam penelitiannya. Pewarnaan ini pun memiliki beragam zat warna yang dapat digunakan seperti zat warna aniline, cresyl violet, dan thionine. Bahan : Awetan otak mencit (irisan koronal tebal 50 μm). Metode : Nissl. 1. Awetan otak mencit yang telah diiris dengan mikrotom, disusun pada gelas objek. Letakkan sekitar 4-6 irisan per gelas objek. Gunakan PBS atau larutan buffer lainnya untuk mempermudah penyusunan. Biarkan mengering di suhu ruang atau di dalam inkubator 37 C. (Pastikan preparat benar-benar kering dan menempel pada gelas objek!) 2. Cuci preparat dengan akuades selama 1 menit. 3. Untuk dehidrasi dan pengektraksian lipid dari preparat, lakukan perendaman dalam etanol bertingkat secara berurutan: 50% (3 menit), 70% (3 menit), 95% (3 menit), 95% (3 menit), 100% (3 menit), dan 100% (3 menit). 4. Rendam dalam xylene 2 3 menit. 5. Untuk persiapan pewarnaan dan rehidrasi preparat, lakukan kembali perendaman dalam etanol bertingkat secara berurutan: 100% (1 menit), 100% (1 menit), 95% (1 menit), 95% (1 menit), 70% (1 menit), dan 50% (1 menit). 6. Cuci kembali preparat dengan akuades selama 1 menit. 7. Warnai dengan thionine 0.1% (w/v) ph 4.0 selama 2-5 menit. Amati dengan seksama perkembangan warna preparat! Segera lanjut ke langkah 8 bila warna preparat telah dianggap cukup gelap. 8. Cuci preparat dengan air mengalir hingga sisa aliran sudah tidak mengandung pewarna. 9. Cuci kembali preparat dengan akuades selama 1 menit. 10. Untuk re-dehidrasi preparat, lakukan kembali perendaman dalam etanol bertingkat secara berurutan: 50% (1 menit), 70% (1 menit), 95% (1 menit), 95% (1 menit), 100% (1 menit), dan 100% (1 menit). 11. Rendam kembali dalam xylene 2 3 menit. 12. Tutup preparat dengan gelas penutup yang telah diberi Permount. 13. Amati preparat dengan mikroskop cahaya. Catatan : 1. Gunakan pipet untuk meletakkan larutan ke atas preparat secara perlahan. 2. Gunakan suction pump untuk membersihkan larutan yang telah selesai digunakan dari atas preparat. 5

11 HISTOKIMIA Tujuan : Melihat adanya glikogen dalam sediaan melintang hati mamalia. Bahan : Sayatan hati. Metode : Parafin dengan pewarnaan khusus best carmine 1. Siapkan larutan yang akan dipakai. Hemaktosilin Harris Hemaktosilin Alkohol absolut Ammonium (potassium) alum Akuades Merkuri oksida Best carmine (stock) Carmine Kalium karbonat Kalium klorida Akuades Amoniak 1 gram 10 ml 20 gram 200 ml 0,5 gram 2 gram 1 gram 5 gram 60 ml 20 ml Semua (kecuali ammonia) dimasak jadi satu selama 5 menit. Dinginkan, kemudian tambahkan ammonia. Selanjutnya simpan dalam botol berwarna gelap di dalam lemari es. Hemaktosilin Harris Larutan baku Amoniak Metil alkohol Best carmine (stock) Metil alkohol absolut Etil alkohol absolut Akuades 2 bagian 2 bagian 3 bagian 40 ml 80 ml 100 ml 2. Deparafinasi. 3. Sediaan dibawa ke kondisi akuades. 4. Warnai dengan hemaktosilin Harris 2 menit. 5. Cuci dengan air ledeng. 6. Selama preparat masih dalam air ledeng, buatlah larutan pewarna best carmine tepat sebelum digunakan. Masukkan larutan best carmine tersebut ke dalam staining jar yang tertutup agar amoniak dan metil alkohol yang terdapat di dalamnya tidak menguap. Tinggalkan preparat dalam larutan ini selama 5-10 menit. 7. Masukkan segera dalam larutan pendiferensiasi. Selama diferensiasi, tebal/tipisnya zat warna harus diperhatikan. 8. Selanjutnya masukkan ke dalam alkohol absolut, diganti-ganti sampai 2-3 kali. Tinggalkan dalam alkohol absolut yang ketiga selama 2 menit. 9. Jernihkan dalam xilol atau toluene, kemudian mounting dengan kanada balsam. 6

12 SEDIAAN UTUH [WHOLE MOUNT) HEWAN Tujuan : Membuat sediaan organisme atau bagian dari organisme hewan secara utuh. Bahan : Semut, cacing pipih (Sagitta), embrio ayam. A. Semut 1. Fiksasi semut dengan etanol 70% minimal 2 x 24 jam. 2. Dehidrasi dengan etanol bertingkat 80%, 95%, dan 100% masing masing selama 10 menit. 3. Jernihkan dengan minyak cengkeh selama 5 menit. 4. Pindahkan ke xilol selama 2x5 menit. Xilol berfungsi sebagai penjernih dan sebagai medium pelarut entellan. 5. Atur di atas gelas obyek, tetesi dengan entellan sebagai perekat. 6. Tutup dengan gelas penutup, biarkan sampai kering. B. Cacing pipih (Sagitta) 1. Cacing yang bergelombang (tidak lurus) harus dijepit di antara gelas objek kemudian difiksasi dengan etanol 70% atau formalin 4% minimal 2 x 24 jam. 2. Lepaskan cacing dari gelas benda dan fiksasi lagi selama beberapa jam. 3. Apabila fiksatifnya adalah etanol 70%, cuci dengan etanol 50% kemudian bilas dengan akuades. Apabila fiksatifnya adalah formalin 4%, cuci dengan akuades. 4. Warnai dengan eosin 1% dalam air selama beberapa jam, tergantung kepada hewannya. 5. Cuci dengan air. 6. Dehidrasi dengan etanol bertingkat 30%, 50%, 70%, 95%, dan etanol absolut masing-masing selama tiga sampai lima menit. 7. Jernihkan dengan laktofenol selama 30 menit dan silol selama 2 x 10 menit. 8. Letakkan di atas gelas obyek. 9. Tutup dengan gelas penutup dengan perekat entellan. C. Embrio ayam 1. Telur diteropong untuk melihat posisi titik embrio. 2. Tandai bagian yang berembrio dengan pensil. 3. Telur diinkubasi di dalam inkubator pada suhu 36 C selama 24 jam, 36 jam, dan 48 jam. 4. Teropong telur untuk melihat apakah embrio berkembang. 5. Gunting cangkang pada bagian yang telah ditandai. 6. Tempelkan cincin kertas saring mengelilingi embrio. 7. Gunting selaput embrio di sekeliling luar cincin kertas saring. 8. Angkat embrio dengan pinset. 9. Cuci dengan garam fisiologis. 10. Fiksasi dengan larutan Bouine selama 30 menit. 11. Cuci dengan etanol 70%. 12. Warnai dengan eosin 1% dalam etanol 70% selama lima menit. 13. Cuci dengan etanol 70%, dehidrasi dengan etanol 80%, 95%, dan 100% selama masing-masing 10 menit. 14. Jernihkan dengan xilol selama 2 x 10 menit. 7

13 15. Letakkan embrio pada gelas benda cekung dan tutup dengan gelas penutup dengan perekat entellan. D. Whole mount tungau dengan perekat polyvinil laktofenol Larutan laktofenol: Larutan polyvinil laktofenol: Aquades 1 bagian Larutan polyvinil alkohol 15% dalam air 2 bagian Asam laktat 1 bagian Asam laktat 1 bagian Phenol jenuh 1 bagian Larutan fenol jenuh 1 bagian Gliserin 2 bagian 1. Tungau difiksasi dengan etanol 70% minimal 24 jam. 2. Jernihkan dengan laktofenol (± 24 jam, tergantung besar kecilnya tungau). 3. Letakkan tungau pada gelas obyek. 4. Ditutup dengan gelas penutup dengan perekat polyvinil laktofenol. 5. Biarkan mengering. 8

14 WHOLE MOUNT TUMBUHAN Tujuan : Membuat sediaan organisme/bagian tumbuhan secara utuh. Bahan : Daun dari suatu spesies tanaman (sayatan paradermal) dan alga. Metode : Gliserin-xilol 1. Fiksasi: daun di fiksasi dalam alkohol 70% selama 24 jam Sedangkan algae difiksasi selama 24 jam di dalam komposisi larutan berikut ini: Formaldehid Asam asetat glasial Akuades 5 bagian 2 bagian 93 bagian 2. Pencucian: larutan fiksatif dibuang, diganti dengan akuades beberapa kali. 3. Daun dilunakkan dengan merendamnya di dalam larutan HN03 25% selama, menit. 4. Sebelum dibuat sayatan paradermal, daun dicuci terlebih dahulu dengan akuades. 5. Pewarnaan: sayatan epidermis daun diwarnai dengan pewarna tunggal yaitu safranin 1% (aquosa) selama 24 jam, sedangkan alga diberi pewarna ganda yaitu safranin 1% (aquosa) selama 24 jam dan fast-green 0.5% (dalam etanol 95%) selama 10 menit. 6. Dehidrasi: bahan direndam di gliserin bertahap yaitu gliserin 10% dan 25% (ditaruh pada wadah terbuka selama beberapa hari hingga gliserin menjadi murni). Untuk mempercepat proses ini, bahan dapat disimpan di dalam oven (suhu C) dijaga bahan jangan sampai kering. Kemudian bahan dicuci dan gliserin dengan etanol 95% 2 kali masing-masing selama 15 menit. Untuk alga diwarnai dengan pewarna fast-green 10 menit. Selanjutnya kedua bahan tersebut direndam dalam etanol absolut selama 10 menit. 7. Dealkoholisasi: bahan direndam dalam campuran etanol absolut dan xilol dengan perbandingan berturut-turut 1:1 dan 1:3 masing-masing selama 5 menit Selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan xilol murni sebanyak 2 kali, masing-masing tahap selama 10 menit. 8. Penutupan: bahan diberi media entellan atau canada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. 9. Pemberian label: label ditempel pada sisi kiri gelas obyek. 9

15 SEDIAAN SEGAR MITOSIS TUMBUHAN Bahan : Ujung akar bawang merah dan bawang bombai. Metode : Remasan (squash). 1. Persiapan material: umbi bawang merah ditumbuhkan di kapas lembap dan bawang bombai ditumbuhkan di dalam wadah botol yang berisis air sampai bawang mengeluarkan akar. 2. Pra-perlakuan: Ujung akar terpilih (ujung akar utuh dan berwarna putih susu) dipotong sepanjang 1-2 cm, dicuci bersih dan dimasukkan ke dalam botol /tabung film hitam yang berisi larutan 0,002 M 8-hydroxyquinolin( lalu disimpan pada suhu 20 C (lemari es) selama 3-5 jam. 3. Pencucian: akar dicuci dalam air mengalir beberapa kali. 4. Fiksasi: akar setelah dicuci bersih direndam dalam larutan asam asetat 45% selama 10 menit. 5. Maserasi: akar dimasukkan ke dalam larutan maserasi berupa campuran HC1 1 N dan asam asetat 45% dengan perbandingan 3:1 kemudian diletakkan pada penangas (waterbath) pada suhu 60 C selama 1 menit. 6. Pewarnaan: akar diletakkan pada gelas arloji dengan posisi konsentris yaitu bagian ujung akar diletakkan di pusat gelas arloji, kemudian ditetesi aceto orcein dan dibiarkan selama 30 menit sambil ditutup dengan cawan petri agar pewarna tidak menguap. 7. Pemencetan (squash): ujung akar dipotong ±1-2 mm, diletakkan pada gelas obyek lalu ditetesi 1-2 tetes aceto orcein baru. Kemudian spesimen diberi gelas penutup dan dilewatkan di atas lampu spiritus sambil dirasakan hangat kuku di kulit tangan. Gelas obyek diletakkan di atas kertas tissu, lalu dipukul-pukul halus dengan pensil berkaret hingga sel-sel pecah dan menyebar rata. Terakhir bahan ditekan halus dengan ibu jari lalu dihangatkan lagi. 8. Pengamatan: spesimen diamati di mikroskop pertama-tama dengan pembesaran obyetif lemah (10x) guna melihat keseluruhan sel. Setelah diperoleh sel-sel terpilih diamati dengan perbesaran kuat (40x). Preparat yang bagus akan dijadikan preparat permanen. 10

16 SEDIAAN SEGAR MIOSIS TUMBUHAN Bahan : Kepala sari bunga lili (Lilium sp.) dan bunga Rhoeo discolor. Metode : Remasan (squash). 1. Fiksasi: sejumlah kuncup bunga lili dan Rhoeo discolor dikumpulkan, kemudian segera ke dalam larutan fiksatif Carnoy/Farmer selama ± 24 jam atau disimpan di dalam lemari es jika lebih dari 24 jam. Komposisi fiksatif Carnoy dan Farmer masing-masing sebagai berikut: Fiksatif Carnoy: Fiksatif Farmer: Etanol absolut 6 bagian Etanol absolut 3 bagian Kloroform 3 bagian Asam asetat glasial 1 bagian Asam asetat glasial 1 bagian 2. Salah satu kuncup bunga dari botol penyimpanan dipilih. 3. Diseksi dan pelunakan: selama diseksi, kuncup bunga diletakkan di gelas arloji yang berisi larutan fiksatif yang baru. Anter bunga lili dan Rhoeo discolor diambil lalu direndam dalam larutan HCI 1 N selama 5-10 menit. 4. Pewarnaan: anter bunga lili dan Rhoeo discolor diletakkan pada gelas arloji, kemudian ditetesi aceto orcein dan dibiarkan selama 30 menit sambil ditutup dengan cawan petri agar pewarna tidak menguap. 5. Pemencetan (squash): PMC bunga lili dan anter bunga Rhoeo discolor diletakkan pada gelas obyek lalu ditetesi 1-2 tetes aceto-orcein baru, dihaluskan dengan skalpel/jarum kemudian ditutup dengan gelas penutup dan dilewatkan di atas lampu spiritus sambil dirasakan hangat kuku di kulit tangan. Gelas obyek di letakkan di atas kertas tissu, lalu dipukul-pukul halus dengan pensil berkaret hingga sel-sel pecah dan menyebar rata. Terakhir bahan ditekan halus dengan ibu jari lalu dihangatkan lagi. 6. Pengamatan: preparat diamati di mikroskop dengan pembesaran lensa obyektif 10x, 45x, dan 100x. Pinggiran gelas penutup diberi kutek (cat kuku) supaya tidak kering. Preparat yang menunjukkan hasil yang memuaskan akan dibuat preparat permanennya. 11

17 SEDIAAN PERMANEN MITOSIS & MIOSIS TUMBUHAN Bahan : Preparat segar mitosis akar dan miosis bunga. Metode : Mc-Clintock 1. Pelepasan gelas penutup: gelas obyek yang berisi preparat mitosis dan miosis direndam dalam petridish yang berisi larutan asam asetat 45%. Dengan bantuan pinset gelas obyek dipisahkan dari gelas penutupnya. Obyek (preparat) yang melekat baik pada gelas obyek maupun gelas penutup dibuat preparat permanennya. 2. Dehidrasi: gelas obyek/gelas penutup direndam dalam seri campuran asam asetat glasial dan etanol absolut dengan perbandingan 1:3 dan 1:9 masingmasing selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan dengan merendam dalam etanol absolut selama 3 menit. 3. Dealkoholisasi: preparat direndam dalam campuran larutan etanol absolut dan xilol dengan perbandingan 1:1 selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan perendaman sebanyak 2 kali dalam xilol murni masing-masing selama 3 menit. 4. Perekatan (mounting): sediaan berupa gelas obyek yang berisi preparat ditetesi entellan, ditutup dengan gelas penutup secara hati-hati. Sedangkan sediaan berupa gelas penutup yang berisi preparat ditempelkan pada gelas obyek baru yang telah ditetesi entellan. Selanjutnya dikeringkan pada pemanas (hotplate) suhu 40 C. 5. Pemberian label: pada sisi kiri gelas obyek direkatkan label. 12

18 MASERASI TUMBUHAN Tujuan : Membuat sediaan dengan cara menghancurkan lamela tengah yang menghubungkan antara satu sel dengan sel lainnya sehingga diperoleh gambaran bentuk utuh dari sel-sel tersebut. Bahan : Batang kayu tanaman: Bauhinia sp. dan Pinus sp. Metode : Schultze. 1. Potongan kayu dipotong kecil sebesar korek api. 2. Potongan-potongan tersebut direbus dalam larutan asam nitrat (HNO 3 ) pekat yang ditambah sedikit kristal kalium klorat (KCI03) sampai bahan berwarna putih dan lunak. 3. Material di cuci dengan air mengalir. 4. Material dihancurkan dengan gelas pengaduk hingga sel-sel terlepas. 5. Warnai dengan safranin 1% selama 24 jam. 6. Cuci dengan air (material diendapkan dengan cara sentrifugasi). 7. Dehidrasi dengan etanol bertingkat: etanol 30%, 50%, 70%, 95%, 100%, masing-masing selama 10 menit (dibantu dengan sentrifugasi). 8. Dealkoholisasi menggunakan campuran etanol dan xilol bertingkat dengan perbandingan 3:1,1:1,1:3 dan larutan xilol murni masing-masing selama 5 menit (disentrifugasi). 9. Mounting dengan media entellan atau canada balsam lalu ditutup dengan gelas penutup. 10. Pemberian label: pada sisi kiri gelas obyek diberi label. 13

19 HISTOKIMIA TUMBUHAN Tujuan : Mengenali kandungan suatu jaringan dengan uji warna atau pembentukan kristal. Bahan : Bunga papaitan (Thitonia sp.), daun alang-alang (Imperata cylindrica), dan braktea Heliconia sp., kencur dan beberapa spesies tumbuhan obat. Metode : 1. Pigmen xantofil. Petal bunga papahitan (Tithonia sp.) disayat secara paradermal pada permukaan atasnya. Sayatan diletakkan di atas gelas objek, ditetesi dengan beberapa tetes kloroform selanjutnya segera ditetesi dengan petrolium eter dan ditutup dengan gelas penutup. Amati kristal yang terbentuk di bawah mikroskop. 2. Silika. Daun alang-alang (Imperata cylindrica) disayat atau dikerik pada permukaan atasnya dengan menggunakan pisau silet. Sayatan diletakkan di atas gelas objek, kemudian ditambahkan kristal fenol dan dipanaskan beberapa saat, selanjutnya tutup dengan gelas penutup. Amati di bawah mikroskop, kristal silika akan berwarna merah muda. 3. Lilin. Sayat secara melintang braktea bunga Heliconia sp dan letakkan di atas gelas obyek, tetesi dengan eter, kemudian tutup secepatnya dengan gelas penutup. Biarkan eter menguap secara perlahan. Amati kristal yang terbentuk di bawah mikroskop. 4. Minyak. Rimpang kencur disayat secara melintang dan diletakkan di gelas obyek yang telah ditetesi Sudan IV, kemudian ditutup dengan gelas penutup. Amati di bawah mikroskop, adanya kandungan senyawa minyak ditandai dengan warna kuning hingga jingga. 5. Terpenoid. Pengujian terpenoid pada sel/jaringan dilakukan menggunakan pereaksi tembaga asetat. Organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat diiris setipis mungkin dengan silet, kemudian ditetesi dengan tembaga asetat di atas gelas objek. Adanya kandungan senyawa terpenoid pada sel/jaringan ditandai dengan warna kuning kecokelatan. 6. Alkaloid. Pengujian alkaloid pada sel/jaringan dilakukan menggunakan pereaksi Wagner. Organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat diiris setipis mungkin dengan silet, kemudian ditetesi dengan larutan Wagner di atas gelas objek. Adanya kandungan senyawa alkaloid pada sel/jaringan ditandai dengan warna merah kecokelatan. Sebagai kontrol negatif, kandungan alkaloid pada sayatan segar dilarutkan dengan 5% asam tartaric (tartaric acid) dalam alkohol 95% selama 48 jam pada suhu kamar, selanjutnya direaksikan dengan reagen Wagner. 7. Fenol. Uji senyawa fenol menggunakan ferric trichloride. Sayatan segar organ daun, batang, akar/rimpang tumbuhan obat direndam dalam larutan 10% ferric trichloride dalam air dan ditambahkan sedikit natrium karbonat selama 15 menit pada suhu kamar. Senyawa fenol akan bereaksi dengan ion besi menghasilkan deposit berwarna hijau gelap atau hitam. 14

20 SEDIAAN IRISAN TUMBUHAN Bahan : Organ tumbuhan (akar, batang, daun). Metode : Parafin, menggunakan seri larutan Johansen dengan tertier butil alkohol (TBA) sebagai dehidran. 1. Fiksasi: bahan difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA dengan komposisi sebagai berikut: Etanol 50% atau 70% Asam asetat glasial Formaldehyde 90 bagian 5 bagian 5 bagian 2. Pencucian: larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50% sebanyak 4 x dengan waktu penggantian masing-masing selama 1 jam. 3. Dehidrasi dan penjernihan: dilakukan secara bertahap dengan merendam bahan dalam larutan seri Johansen l-vii dengan komposisi sebagai berikut: Komposisi larutan Larutan Johansen 1 II Ill IV V VI VII Air 50% 30% 15% Etanol 95% 40% 50% 50% 45% Etanol 100% % - Tertier butil alkohol 10% 20% 35% 55% 75% 100% 50% Minyak parafin % Waktu perendaman untuk masing-masing tahap adalah sebagai berikut: Johansen 1 2 jam Johansen VI semalam Johansen II semalam Johansen VI 2 jam Johansen III 2 jam Johansen VI 2 jam Johansen IV 2 jam Johansen VI 2 jam Johansen V 2 jam Johansen VII, dalam botol yang berisi ⅓ bagian parafin beku. 4. Infiltrasi: wadah berisi material dan campuran TBA, minyak parafin, serta A bagian parafin disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam (tutup di buka), kemudian dalam oven (58 C) selama 12 jam (tutup di buka). Tuang seluruh parafin, diganti dengan parafin cair baru (dilakukan 3 x penggantian setiap 6 jam) disimpan pada suhu 58 C. 5. Penanaman (blok): tuang semua cairan parafin ganti dengan parafin cair murni disimpan di oven suhu 58 C selama 1 jam. Selanjutnya material siap di blok. 6. Penyayatan: blok yang sudah dirapikan ditempel pada holder dan disayat dengan mikrotom putar setebal 10 μm. 7. Perekatan: sayatan direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumingliserin dan ditetesi air. Kemudian gelas berisi pita parafin dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45 C selama 3-5 jam. 8. Pewarnaan: dilakukan pewarnaan ganda safranin 2% dalam air dan fastgreen 0,5% dalam etanol 95%. Berturut-turut gelas obvek di rendam ke dalam larutan berikut: 15

21 Xilol menit Akuades 1-2 menit Xilol menit Etanol 30% 2-5 menit Etanol:xilol 3:1 2-5 menit Etanol 50% 2-5 menit Etanol:xilol 1:1 2-5 menit Etanol 70% 2-5 menit Etanokxilol 1:3 2-5 menit Etanol 90% 2-5 menit Etanol absolut 2-5 menit Fast-green 0,5% 5-30 detik Etanol 95% 2-5 menit Etanol absolut 2-5 menit Etanol 70% 2-5 menit Etanokxilol 3:1 2-5 menit Etanol 50% 2-5 menit Etanokxilol 1:1 2-5 menit Etanol 30% 2-5 menit Etanokxilol 1:3 2-5 menit Akuades 1-2 menit Xilol menit Safranin jam Xilol menit 9. Penutupan: bahan diberi media entellan atau canada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. 10. Pemberian label: label ditempel pada sisi kiri gelas obyek. 16

22 PENGENALAN MIKROSKOP ELEKTRON PAYARAN (Scanning Electron Microscope) Tujuan : Mengamati struktur eksternal suatu objek dalam bentuk stereo (3 dimensi) menggunakan mikroskop elektron payaran. Bahan : Polen tumbuhan. Metode : Tanpa perlakuan 1. Pembersihan dan pengeringan. Polen tumbuhan dibersihkan dari kotoran yang melekat. Selanjutnya dikeringkan secara alami. 2. Pelekatan polen pada specimen stub. Polen yang telah kering direkatkan pada specimen stub menggunakan selotape karbon 2 sisi. Guntinglah selotape sepanjang diameter specimen stub, kemudian lepaskan kertas pemisahnya dan rekatkan selotape pada specimen stub. Setelah merapikan sisi-sisi selotape lepaskan kertas pemisah ke dua dan selanjutnya taburkan secara merata polen di atasnya. Pastikan polen tidak terlepas dari selotape. 3. Pelapisan permukaan luar polen dengan emas. Logam emas diuapkan secara vakum sehingga melapisi permukaan polen. Proses ini dilakukan dengan bantuan vacuum evaporation device. 4. Pengamatan struktur eksternal polen menggunakan mikroskop elektron payaran. 5. Pengambilan foto polen. Mikroskop Elektron Payaran (Scanning Electron Microscope) 17

23 PENGENALAN FOTOMIKROSKOP (Optiphot-2) Tujuan : Pengamatan dan pengambilan foto spesimen menggunakan fotomikroskop. Bahan : Preparat semi permanen/permanen. 1. Persiapan. Nyalakan fotomikroskop dengan menekan ON tombol power yang terdapat di bagian belakang mikroskop dan juga menekan ON tombol power alat pengoperasian kamera. Isilah film ke dalam ruang film kamera dengan cara sebagai berikut. Bukalah penutup belakang kamera dengan menarik tuas penggulung film ke atas. Setelah terbuka, masukkan gulungan film ke dalam ruang film kamera, film ditarik sedikit sampai bagian ujungnya masuk ke dalam celah kumparan penerima. Setelah selesai memasukkan film, tutup penutup belakang kamera. Secara otomatis film akan tergulung pada kumparan penerima. Pada keadaan ini kamera siap digunakan. Siapkan preparat/spesimen yang akan difoto. Fotomikroskop (Optiphot-2) 2. Pengambilan foto spesimen. 2a. Pengamatan sebelum pengambilan foto Letakkan preparat/spesimen pada meja mikroskop. Pastikan objek yang diteliti terletak di tengah lubang mikroskop. Amati preparat menggunakan lensa objektif yang sesuai dengan kebutuhan (10 x atau 40 x). Melalui lensa okuler pada bagian mikroskop, aturlah ketajaman (focus) preparat dengan cara memutar pengatur kasar atau halus (tergantung pada besarnya lensa objektif yang digunakan). 18

24 Untuk mendapatkan daya pisah optimal aturlah pembukaan kondensor, sedangkan untuk mendapatkan tingkat kecerahan (kontras) yang optimal aturlah pencahayaan dengan menggerakkan tombol pengatur cahaya ke kanan untuk memperbesar atau ke kiri untuk memperkecil. Setelah didapatkan tampilan preparat yang fokus dengan tingkat kecerahan yang optimal, aturlah tampilan untuk pemotretan dengan mengikuti prosedur selanjutnya. 2b. Pengambilan foto Melalui jendela pengamat kamera (dilihat dari lensa okuler pada bagian kamera) aturlah ketajaman gambar dengan cara memutar gelang pengaturnya yang melekat pada lensa okuler. Pastikan delapan garis pendek yang terdapat pada jendela pengamat kamera terlihat dengan jelas. Jendela pengamat kamera Setelah objek yang akan difoto terfokuskan dengan jelas, tariklah keluar knob penerus cahaya ke kamera. Untuk memulai pemotretan, tekan tombol lampu untuk pemotretan (terdapat di sebelah kiri display panel pencahayaan). Lampu foto akan bergerak ke nomor 9. Setelah itu tekan tombol shutter release (pelepas rana). Setiap selesai menekan tombol, film akan maju secara otomatis. Untuk pengambilan objek lainnya, lakukan tahapan seperti di atas. Setelah selesai pemotretan, matikan lampu foto. 2c. Penggulungan film yang telah digunakan Tekanlah tombol kecil (berwarna hitam) yang terdapat pada sisi atas kamera. Film akan terlepas dari kumparan penerima. Tariklah ke atas tuas pemutar balik film (terdapat di bagian atas kumparan penerima), gulunglah film searah tanda anak panah yang terdapat pada tuas pemutar balik film. Teruskan menggulung sampai putaran terasa ringan (film sudah tergulung sempurna ke dalam tabungnya). Keluarkanlah film dari ruang film kamera dengan cara menarik ke atas tuas penggulung balik film. Pastikan sudah terdengar bunyi teeeek yang berarti pintu ruang kamera akan terbuka. Setelah tabung film dikeluarkan dari ruang film kamera, tutuplah kembali pintu ruang film kamera. 3. Penutupan Setelah selesai menggunakan fotomikroskop, keluarkan preparat dari meja mikroskop. Pada waktu mengeluarkan preparat, agar preparat tidak membentur lensa objektif, pindahkan lensa objektif yang dipakai dengan lensa objektif terkecil yang terdapat pada mikroskop dengan cara memutar revolver pengganti lensa objektif. Simpanlah preparat kembali. Matikan fotomikroskop dengan menekan tombol power utama dan tombol power kamera. Pastikan tidak ada sampah yang tercecer di sekeliling fotomikroskop. 19