UNIVERSITAS GADJAH MADA LABORATORIUM GENETIKA DAN PEMULIAAN

Transkripsi

1 Halaman : 1 dari 5 METODE PREPARASI KROMOSOM DENGAN METODE SQUASH 1. RUANG LINGKUP Metode ini digunakan untuk penentuan jam pembelahan sel dan jumlah kromosom. 2. ACUAN NORMATIF Aristya, G.R., Daryono, B.S., Handayani, N.S.N., dan Arisuryanti, T Karakterisasi Kromosom Tumbuhan dan Hewan. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Ostergren, G., and Heneen, W.K A Squash Technique For Chromosome Morphological Studies. Insitute of Genetics,University of Lund, Sweden. Suryo Sitogenetika. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta 3. ISTILAH DAN DEFINISI A. larutan asam asetat glasial 45% (AAG 45%) Larutan yang mempunyai kadar Asam Asetat Glasial (AAG) sebanyak 45% dalam akuades. Larutan AAG 45% ini berfungsi sebagai larutan fiksatif sel. B. larutan HCL 1N Larutan yang mempunyai kadar normalitas HCl 1 N dalam akuades. Larutan HCl ini berfungsi dalam membantu pemutusan lamela tengah sel tanaman sehingga sel dapat terpisah-pisahkan secara sempurna. C. larutan Aceto Orcein 1% Larutan yang mempunyai kadar Orcein 1% dalam larutan asam asetat. Larutan Aceto Orcein 1% berfungsi sebagai senyawa yang dapat berikatan dengan kromosom sehingga akan meningkatkan visualisasi kromosom pada saat pengamatan menggunakan mikroskop. D. indeks sentromer (IS) Panjang lengan pendek kromosom (p) dibagi panjang kromosom (p+q) dikali 100. Perhitungan IS ini bertujuan dalam klasifikasi bentuk-bentuk kromosom.

2 Halaman : 2 dari 5 E. karyogram Suatu gambar pengaturan dari set kromosom somatis individu (e.g. Tanaman normal= 2n) berdasarkan jumlah dan disusun berdasarkan IS (letak sentromer) kromosom. 4. CARA UJI 4.1.Prinsip Sampel tanaman (e.g. ujung akar ± 1 cm) difiksasi menggunakan larutan AAG 45% selama 15 menit pasa suhu 4 o C, selanjutnya dilakukan pembilasan akar menggunakan akuades sebanyak 3 kali, kemudian dimaserasi menggunakan larutan HCl 1N selama 3 menit pada suhu 55 o C (hingga akar transparan), ; lalu dilakukan pembilasan akar menggunakan akuades sebanyak 3 kali, dan setelahnya diwarnai dengan larutan aceto orcein 1% selama 1-3 jam pada suhu ruang, selanjutnya di squash Bahan a) aceto orcein 45%, AAG 45%; b) asam klorida, HCl 1 N; c) aceto orcein 1%; d) akuades; e) gliserin; f) kutek 4.3. Peralatan a) labu ukur 100 ml; b) gelas ukur 50 ml; c) gelas ukur 100 ml; d) tabung gelap; e) gelas benda; f) gelas penutup; g) silet; h) botolflakon;

3 Halaman : 3 dari 5 i) kuas; j) pipet tetes; k) pipet penghisap; l) kulkas; m) oven; n) mikroskop; o) pensil; p) software AutocadMap; q) kertas tissue; r) cawan petri 4.4. Persiapan Pengujian Biji tanaman dikecambahkan pada cawan petri yang telah dilapisi dengan kapas basah hingga menghasilkan akar Prosedur Pengujian 1. Akar yang telah tumbuh dipotong pada bagian ujung (±1 cm) lalu dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan fiksatif (asam asetat glasial 45 %), inkubasi pada suhu 4 o C selama 15 menit. 2. Setelah difiksasi, cuplikan dicuci dengan akuades hingga bersih (3 kali) lalu sampel akar dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan maserasi (HCl 1 N), inkubasi pada suhu 55 o C selama 2-5 menit 3. Cuplikan dicuci dengan akuades (3 kali) dan kemudian sampel akar dimasukkan ke dalam botol flakon yang berisi larutan pewarna kromosom (aceto-orcein 1 %), inkubasi pada suhu ruang (RT) selama 45 menit. 4. Sampel akar diambil dan dilektaan pada obyek gelas dan aceto orcein yang masih menempel pada bagian pinggir sampel diserap dengan tissue, kemudian dipotong sekitar 1-2 mm pada bagian ujung yang paling pekat menyerap warna aceto orcein. 5. Selanjutnya sampel ditetesi dengan gliserin dan ditutup dengan gelas penutup, selanjutnya squashing sampel menggunakan ujung kuas. 6. Pada pinggir gelas penutup, diberi kutek untuk mensegel gelas objek dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop.

4 LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU Halaman : 4 dari Pengamatan dan Pemotretan 1. Setelah preparasi selesai, preparat diamati dibawah mikroskop cahaya di Laboratorium Genetika Fakultas Biologi UGM dengan perbesaran 10x, 40x, dan 100x untuk mengamati fase mitosis yang terjadi 2. Pemotretan dilakukan ketika perbesaran 40x menggunakan kamera digital 3. Berdasarkan gambar tersebut kemudian diamati dan ditentukan jenis fase mitosis yang tampak 4. Selanjutnya, preparat juga diamati menggunakan mikroskop milik LPPT UGM dengan perbesaran 100x, agar kromosom pada fase prometafase terlihat jelas 5. Dari sekian foto, diambil foto yang menunjukkan fase prometafase yang paling jelas untuk dijadikan dasar dalam menghitung jumlah kromosom stroberi. 5. PENGENDALIAN MUTU a) Gunakan silet berkarat untuk memotong ujung akar yang telah tumbuh b) Gunakan mikroskop dengan perbesaran tinggi agar kromosom yang diamati tampak jelas saat dipotret. c) Lakukan preparasi triplo untuk kontrol presisi analisis.

5 LABORATORIUM PENELITIAN DAN PENGUJIAN TERPADU Halaman : 5 dari 5 Disiapkan Oleh Diperiksa Oleh Disahkan Oleh Nama Subakir Ganies Riza Aristya, S.Si., M.Sc. Dr. Niken Satuti Nur Handayani, M.Sc. Tanggal 26 Oktober Oktober Oktober 2015