BAB III METODE PENELITIAN. pemberian ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana) terhadap

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen dengan perlakuan pemberian ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana) terhadap gambaran histologik trakea dan paru-paru mencit (Mus musculus) yang terpapar asap rokok. B. Pelaksanaan Penelitian 1. Waktu penelitian Penelitian telah dilaksanakan pada bulan Maret - Juni Lokasi penelitian Lokasi penelitian ini dilakukan di Animal House (kebun biologi FMIPA UNY) pada saat pemeliharaan dan perlakuan mencit, sedangkan untuk pembuatan ekstrak kulit manggis dan pembuatan preparat (awetan) histologik trakea dan paru-paru mencit di Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta. C. Objek Penelitian 1. Populasi penelitian Populasi penelitian ini adalah mencit putih (Mus musculus) jantan galur Swiss yang berumur 2 bulan dengan berat tubuh rata-rata 29,18 gram. 41

2 2. Sampel penelitian Teknik pemilihan sampel yang dilakukan untuk dimasukkan ke dalam masing-masing kandang mencit adalah secara acak dengan pemberian tanda berupa warna menggunakan spidol permanen di bagian kepala mencit. Potongan kertas berbentuk kotak berukuran 10 x 10 cm yang juga diberi warna dengan spidol untuk melakukan pemilihan sampel secara acak. Kertas dilipat kemudian dimasukkan ke dalam toples kecil. kertas dipilih dan diambil dengan mata terpejam secara acak. Kertas yang terpilih disesuaikan dengan mencit yang sama warnanya, kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing kandang sebanyak 5 ekor sampai keempat kandang terisi rata. Adapun pemberian warna mencit adalah sebagai berikut: Tabel 2. Pembagian Warna Pada Mencit Sebagai Teknik Melakukan Pemilihan Sampel Mencit Warna Mencit Warna 1 Merah 11 merah kuning 2 Kuning 12 merah hijau 3 Hijau 13 merah biru 4 Ungu 14 merah hitam 5 biru tua 15 merah merah 6 biru muda 16 merah coklat 7 Hitam 17 merah ungu 8 Pink 18 hitam hitam 9 Orange 19 hitam hijau 10 Coklat 20 hitam ungu D. Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian ekstrak kulit manggis dengan variasi dosis sebagai berikut : 42

3 a. KI : kontrol negatif (tanpa ekstrak dan asap rokok) b. KII : kontrol positif (terpapar asap rokok) c. KIII : ekstrak 280mg/KgBB perhari dan terpapar asap rokok d. KIV : ekstrak 560 mg/kgbb perhari dan terpapar asap rokok e. KV : ekstrak 840mg/KgBB perhari dan terpapar asap rokok f. Variable tergayut 1) Gambaran histologik trakea mencit yang diamati secara mikroskopis meliputi pengurangan jumlah kerusakan sel epitel. 2) Gambaran histologik paru-paru mencit meliputi susunan sel normal (bronkus, bronkiolus, alveoli). E. Alat dan Bahan 1. Alat Alat yang digunakan pada penelitian meliputi: sarung tangan yang terbuat dari kain tebal untuk melindungi tangan dari gigitan mencit, spuit ukuran 1 ml untuk pemberian ekstrak, korek api, botol kecil (flakon) sebagai wadah organ, baki lilin untuk meletakkan mencit saat pembedahan, alat bedah, sarung tangan lateks, masker, kamera, kandang pemeliharaan dan kandang perlakuan. 1) Kandang pemeliharaan : baki berbentuk kotak dengan tutup strimin agar mencit tidak lepas dan tetap bisa mendapat udara untuk bernafas, sekam, wadah pakan dan minum. 43

4 2) Kandang perlakuan : toples besar yang diberi lubang pada beberapa bagian tepi agar dapat memasukkan rokok dengan tutup toples terpasang, spuit ukuran 5 ml sebagai pompa rokok, selang bening untuk membuat pompa lebih panjang, wadah spidol untuk penjepit rokok. 2. Bahan Bahan yang digunakan untuk penelitian antara lain mencit, pakan mencit, air minum, kulit buah manggis sebagai bahan utama pembuatan ekstrak kulit buah manggis, rokok kretek merk D, kapas, sekam, formalin, cloroform untuk membius mencit yang akan dibedah, dan kertas label untuk memberi label/tanda pada botol flakon. F. Prosedur Kerja 1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis. a. Menyiapkan buah manggis sebanyak 10 kilogram b. Memisahkan buah, tangkai dan lapisan kulit terluar dari buah manggis. c. Memotong kulit manggis tipis-tipis agar proses pengeringan semakin cepat. d. Menggiling kulit manggis yang telah kering hingga berbentuk serbuk. e. Serbuk ditimbang sebanyak 1 kg. lalu ditempatkan dalam maserator, selanjutnya dimasukkan pelarut ethanol 96% hingga semua terbasahi, maserasi dilakukan selama 48 jam. 44

5 f. Diambil ekstraknya, ampas dimaserasi kembali hingga 2 kali agar ekstrak yang didapatkan maksimal. 1 kg bubuk kulit buah manggis membutuhkan 8 liter ethanol 96%. g. Hasil maserasi dipekatkan dengan rotary evaporator hingga didapatkan ekstrak kulit buah manggis berbentuk pasta berwarna cokelat. h. Menimbang ektrak kulit buah manggis sebanyak dosis yang diperlukan, melarutkan kedalam aquadesh dengan suspensor Tween dan PGA sebanyak 1-2% dari berat ekstrak. i. Diperoleh ektrak kulit buah manggis dalam bentuk cair sehingga memudahkan dalam proses pemberian ke hewan coba. 2. Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Buah Manggis dan Asap Rokok Pemberian dosis ekstrak kulit buah manggis untuk mencit adalah 280 mg/kgbb, 560mg/KgBB dan 860 mg/kgbb. Pemberian dosis rokok yaitu sebanyak 2 batang rokok selama 15 menit untuk kelompok yang diberi perlakuan yaitu kelompok KII, KIII, KIVdan KV. Rokok yang digunakan adalah rokok nonfilter/ rokok kretek merk D secara inhalasi. 3. Perlakuan pada Mencit Pembagian kelompok perlakuan mencit adalah sebagai berikut : 45

6 a. KI : kelompok kontrol negatif yang terdiri dari 5 ekor mencit dengan dipelihara tanpa diberi perlakuan (tanpa paparan asap rokok dan tanpa ekstrak kulit buah manggis). b. K II : kelompok kontrol positif yang terdiri dari 5 ekor mencit dengan dipelihara + paparan asap rokok dari 2 batang rokok/hari selama 15 menit. c. KIII : kelompok perlakuan yang terdiri dari 5 mencit yang dipelihara + paparan asap rokok dari 2 batang rokok/hari selama 15 menit + ekstrak kulit buah manggis dengan dosis 280 mg/kgbb perhari. d. K IV : kelompok perlakuan yang terdiri dari 5 mencit yang dipelihara + paparan asap rokok/hari selama 15 menit + ekstrak kulit buah manggis dengan dosis 560 mg/kgbb. e. KV : kelompok perlakuan yang terdiri dari 5 mencit yang dipelihara + paparan asap rokok/hari selama 15 menit + ekstrak kulit buah manggis dengan dosis 840 mg/kgbb. 4. Pembuatan Preparat Histologik Pembuatan preparat histologik trakea dan paru-paru mencit dilakukan di Fakultas Kedokteran UGM Yogyakarta. Proses pembuatan preparat histologik dilakukan melalui beberapa tahapan antara lain (Suntoro, 1983: 48-72): 46

7 a. Fiksasi Sampel organ trakea dan paru-paru yang diambil difiksasi dengan larutan formalin 10%. b. Trimming (pemotongan) Jaringan dipotong tipis ± 10x10x3 mm dengan menggunakan pisau skalpel No c. Dehydration (dehidrasi) Tahap ini dilakukan dengan menggunakan automatic histotechnician tisuue processor. Dehidrasi dimaksudkan untuk mengeluarkan air yang terkandung dalam jaringan dan diganti dengan ethanol/ alkohol. Caranya, memasukkan jaringan ke dalam alkohol 80% 2 jam, alkohol 95% (I) 2 jam, 95% (II) 1 jam dan alkohol absolut 3 kali masing-masing 1 jam. d. Clearing Clearing (penjernihan): larutan dehidran dibuang dan diganti dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing 1 jam, agar xylol mudah diusir oleh parafin. e. Infiltration (penyusupan) Dilakukan di dalam oven dengan suhu 55-60ºC, menggunakan parafin dengan titik cair ºC. Potongan organ dimasukkan dalam botol jam yang berisi : 1) parafin 1 selama 2 jam; 2) parafin 2 selama 2 jam; 3) parafin 3 selama 2 jam. 47

8 f. Embedding (penyelubungan) Kertas kalender dibuat kotak-kotak dengan ukuran 2 x 2 x 2 cm3 atau base mold untuk menanam jaringan. Parafin yang sudah dicairkan dituang dalam kotak-kotak tadi, lalu potongan jaringan ditanam dalam parafin tersebut dan jaringan diletakkan di dasar parafinkemudian didinginkan. g. Section (pengirisan) Blok-blok parafin dikeluarkan dari cetakannya,dibentuk dan diiris dengan skalpel berbentuk trapesium. Potongan inikemudian dipasang pada holder yang kemudian dipasang pada mikrotom, kemudian dilakukan pengirisan preparat sampai terbentuk pita coupes. h. Affixing (penempelan) Coupes ditempelkan di atas gelas benda yang sebelumnya telah diolesi dengan albumin meyer, lalu ditetesi aquades secukupnya. i. Deparafinisasi dan staining Gelas benda yang ditempeli coupes direndam dalam xylol (I) selama 5 menit, xylol (II) 5 menit dan xylol (III) 5 menit. Proses pewarnaan dimulai dengan pencelupan dalam alkohol absolut (I) 5 menit, absolut (II) 5 menit, akuades 1 menit, lalu dimasukkan dalam Hematoxyline-Eosin kemudian dicelupkan dan dibersihkan dalam akuades 1 menit. Lalu dimasukkan 48

9 dalam alkohol asam 2-3 celupan. Bahan lalu dimasukkan dalam akuades (I) 1 menit, akuades (II) 15 menit, Eosin 2 menit, alkohol 96% (I) 3 menit, alkohol 96% (II) 3 menit, alkohol absolut (III) 3 menit, alkohol absolut (IV) 3 menit, kemudian dimasukkan xylol (IV) 5 menit dan xylol (V) selama 5 menit. j. Mounting (penutupan) Coupes diambil dari larutan xylol kemudian dibersihkan dengan kertas penghisap, lalu ditetesi dengan permount dan ditutup dengan gelas penutup.selanjutnya preparat dikeringkan di atas termostat. G. Teknik Pengumpulan Data Teknik pengumpulan data adalah gambaran histologik trakea mencit dilihat dari jumlah sel epitel yang mengalami kerusakan. Gambaran histologik paru-paru mencit dilihat dari kerusakan pada susunan sel normal. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 10 kali yang dihubungkan langsung pada monitor (TV). H. Teknik Analisis Data Data yang diperoleh dari penghitungan ukuran kerusakan epitel trakea menggunakan Kruskal Wallis untuk mengetahui pengaruh dari pemberian ekstrak kulit buah manggis yang berbeda dosisnya pada taraf signifikan (p 0,05). Data diuji menggunakan bantuan programn Statistical Product and Service Solution (SPSS). Gambaran histologik paru-paru dianalisis secara deskriptif. 49