METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Peralatan Persiapan Kandang Penelitian

Transkripsi

1 14 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari sampai November Kegiatan pemeliharaan dan perlakuan hewan coba bertempat di fasilitas kandang hewan percobaan Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Pembuatan sediaan histopatologi dilakukan di Bagian Patologi, Departemen Klinik Reproduksi dan Patologi, FKH-IPB. Bahan dan Peralatan Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ayam pedaging strain Cobb sebanyak 25 ekor; ND live vaccine lassota, CAPRIVAC IBD-Inter live vaccine, AI killed vaccine medivac ; bahan pembuatan sediaan histopatologi seperti Buffer Neutral Formalin 10%, etanol (70%, 80% 90%, 95%, absolut), xylene, parafin, pewarna jaringan Hematoksilin, pewarna Eosin, dan aquades; kebutuhan harian ayam seperti air minum, pakan (Sinta ), lampu sebagai penghangat, dan sekam sebagai alas kandang; dan ekstrak Temulawak, Temu Ireng, Meniran, dan Sambiloto. Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah alat pemeliharaan dan perlakuan ayam, seperti 5 petak kandang, syring untuk vaksinasi, dan syringe 1 ml yang dibuang jarumnya untuk mencekok ekstrak; alat nekropsi seperti, scalpel, gunting, pinset, dan botol plastik; alat untuk pembuatan sediaan histopatologi seperti, gelas ukur, tissue cassete, tissue basket, tissue tang, Parrafin Embedding Console, object glass, cover glass, automatic tissue processor Sakura tek, microtome, staining system, electronic eyepiece, mikroskop Olympus 130X, dan software mbf_imagej. Persiapan Kandang Penelitian Kandang ayam dibuat menurut sistem litter dengan panjang 110 cm, lebar 40 cm dan tinggi 45 cm. Seluruh dinding dan lantai ruangan percobaan ditaburi dengan kapur tembok berwarna putih, didesinfeksi dengan desinfektan kelompok fenol sintetik dan difumigasi dengan gas formalin 5% v/v sehari sebelum ayam percobaan dimasukkan.

2 15 Penyediaan Ekstrak Ekstrak tanaman obat berasal dari empat tanaman, yaitu Temulawak, Sambiloto, dan Temu Ireng dengan pelarut etanol dan tanaman Meniran menggunakan pelarut air. Pembuatan ektraksi dan formula dari kombinasi tanaman obat dilakukan di Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini menggunakan ektraksi yang telah dipersiapkan terlebih dahulu. Pemberian Ekstrak Penyajian ekstrak untuk tiap kelompok perlakuan dilakukan dengan melarutkan ekstrak yang telah jadi dengan air. Dosis yang ditentukan dikali dengan bobot ayam rata-rata. Setiap hari, tiap kelompok ayam diminumkan dengan masing-masing formula tanaman obat dengan menggunakan syringe 1 ml yang jarumnya telah dilepas. Pencekokan dilakukan 1 kali sehari setiap pukul WIB selama 28 hari. Vaksinasi Setelah masa, semua kelompok ayam divaksinasi dengan ND live vaccine lassota pada hari ke-4, CAPRIVAC IBD-Inter live vaccine pada hari ke-11, AI killed vaccine medivac pada hari ke-15. Vaksin ND diberikan secara tetes hidung dan tetes mata dan CAPRIVAC IBD-Inter diberikan secara oral. Vaksin AI diberikan melalui injeksi di bawah kuit leher bagian belakang dengan dosis 0.2 ml. Perlakuan penelitian Penelitian ini menggunakan ayam broiler strain Cobb umur 1 hari dengan bobot badan seragam. Sebelum perlakuan dimulai, diadakan masa selama 4 hari untuk mengembalikan kondisi ayam dari stress karena pemindahan dan transportasi. Selama masa ini diberikan vitamin dan elektrolit pada air minum sesuai dengan rekomendasi pabrik pembuat. Sebanyak 25 ekor ayam pedaging dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan. Masing-masing perlakuan dapat dilihat pada Tabel 1.

3 16 Tabel 1 Kelompok perlakuan hewan coba Perlakuan Kontrol (-) F1 F2 F3 F4 Keterangan 5 ekor ayam divaksin ND live vaccine (lassota ), CAPRIVAC IBD-Inter live vaccine, AI killed vaccine medivac, dan diberi aquades 1 ml 5 ekor ayam divaksin ND live vaccine lassota, CAPRIVAC IBD-Inter live vaccine, AI medivac, dan diberi formula Temulawak, Meniran, Sambiloto, dan Temu Ireng 1 ml 5 ekor ayam divaksin ND live vaccine (lassota ), CAPRIVAC IBD-Inter live vaccine, AI killed vaccine medivac, dan diberi formula Temulawak, Meniran, dan Temu Ireng 1 ml 5 ekor ayam divaksin ND live vaccine lassota, CAPRIVAC IBD-Inter live vaccine, AI killed vaccine medivac, dan diberi formula Temulawak dan Temu Ireng 1 ml 5 ekor ayam divaksin divaksin ND aktif, CAPRIVAC IBD- Inter live vaccine, AI killed vaccine medivac, dan diberi formula Meniran dan Sambiloto 1 ml Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ Semua ayam dinekropsi pada akhir penelitian untuk diambil limpanya. Pertama-tama ayam dipotong dengan pisau tajam kemudian ayam ditelentangkan. Dilakukan penyayatan pada kedua selangkangan kemudian dikuakkan sampai jaringan subkutis dada dan perut terlihat. Setelah terkuak, dilakukan penyayatan pada otot perut sepanjang tulang rusuk terakhir untuk membuka rongga perut. Otot dada kedua sisi badan disayat sampai ke persendian axilla. Ujung tulang dada dikuakkan ke kepala sehingga rongga dada terbuka. Organ dalam dikuakkan dengan tangan dan diangkat. Masing-masing organ dipisahkan. Limpa diambil dan dimasukkan ke dalam botol plastik yang berisi Buffer Neutral Formalin 10%

4 17 selama kurang lebih 48 jam dan setelah itu diproses untuk pembuatan sediaan histopatologi. Jadwal kegiatan dijelaskan pada Gambar 7. Gambar 7 Jadwal perlakuan hewan coba Pembuatan Sediaan Histopatologi Limpa yang telah dikoleksi dipotong dengan ketebalan kurang lebih 3 mm, dimasukkan ke dalam tissue cassete kemudian dilakukan tindakan dehidrasi dengan merendam sediaan tersebut secara berurutan ke dalam etanol 70%, 80%, 90%, etanol 96%, etanol absolut I, etanol absolut II, xylene I, xylene II, xylene III parafin I, parafin II, dan parafin III selama masing-masing 2 jam. Proses perendaman dilakukan secara otomatis dalam automatic tissue processor Sakura Tek. Jaringan yang sudah mengalami dehidrasi dimasukkan ke dalam cetakan dan diisi parafin cair sampai cetakan penuh dan dibiarkan mengeras. Jaringan dipotong dengan mikrotom dengan ketebalan 5 µm. Hasil potongan dimasukkan ke dalam water bath (45 0 C) untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan. Sediaan diangkat dengan object glass kemudian dikeringkan dalam inkubator (60 0 C). Deparafinasi dilakukan dengan cara memasukkan jaringan ke dalam xylene sebanyak dua kali selama 2 menit. Proses dilanjutkan dengan rehidrasi jaringan, dimulai dari pencelupan jaringan ke dalam alkohol absolut, sampai ke alkohol 70% secara berurutan selama 2 menit, dibilas dengan air mengalir.

5 18 Pewarnaan dilakukan pertama-tama dengan perwarna Mayer s Hematoksilin selama 3-4 menit, dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan Lithium Karbonat selama detik, dibilas dengan air mengalir lagi. Selanjutnya jaringan dicelupkan ke dalam pewarna Eosin selama 5-6 menit. Sediaan dicuci dengan celupan alkohol 70%, 80%, 90%, 96% sebanyak 10 kali, alkohol absolut I 10 kali, alkohol absolut II 10 celupan, xylene I-IV selama 2 menit. Langkah berikutnya dilanjutkan dengan menenetesi sediaan dengan perekat Permount TM kemudian ditutup dengan cover glass dan didiamkan minimal 1 hari hingga perekat mengering. Sediaan yang telah jadi diperiksa menggunakan mikroskop untuk mengevaluasi gambaran histopatologinya. Pengamatan Sediaan Histopatologi Pengamatan histopatologi dilakukan dengan mikroskop cahaya dan software MacBiophotonic ImageJ (Rasban 2006). Masing-masing sediaan histopatologi difoto pada 10 pulpa putih secara acak di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400X. Luasan pulpa putih dan agregat sel pada pulpa putih dihitung dengan komputer menggunakan software MacBiophotonic ImageJ (mbf_imagej). Kepadatan sel pulpa putih diperoleh dengan cara membagikan jumlah sel dengan luas pulpa putih. Pengolahan Data Data yang disajikan berupa data deskriftif untuk perubahan histopatologi pada limpa dan data kuantitatif untuk kepadatan sel pada pulpa putih. Data diolah dengan program SPSS 16. OneWay ANOVA digunakan membandingkan setiap formula dan diuji lanjut menggunakan Duncan test. Diagram alir penelitian dideskripsikan pada pada Gambar 8.

6 19 PERSIAPAN KANDANG, PAKAN, EKSTRAK TANAMAN OBAT 25 DOC MASUK 5 ekor 5 ekor 5 ekor 5 ekor 5 ekor PERLAKUAN NEKROPSI DAN PENGAMBILAN SAMPEL ORGAN PEMBUATAN SEDIAAN HISTOPATOLOGI PEMBACAAN SEDIAAN HISTOPATOLOGI PENGOLAHAN DATA DAN PENULISAN SKRIPSI Gambar 8 Diagram alir penelitian Pengaruh Formula Ekstrak 4 Tanaman Obat Terhadap Gambaran Histopatologi Limpa Ayam Broiler.