ISOLASI, KLONING, DAN KARAKTERISASI GEN TOLERAN ALUMINIUM DARI TANAMAN PADI. Abstrak

Transkripsi

1 ISOLASI, KLONING, DAN KARAKTERISASI GEN TOLERAN ALUMINIUM DARI TANAMAN PADI (Isolation, Cloning, and Characterization of Rice Aluminum Tolerance Gene) Abstrak Toleransi cekaman Aluminium (Al) pada tanaman padi merupakan sifat kuantitatif yang dikendalikan oleh banyak gen. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengklon, dan mengkarakterisasi gen toleran Al dari genotipe padi Hawara Bunar yang toleran Al. Bahan tanaman yang digunakan adalah padi Hawara Bunar (genotipe padi toleran Al) dan IR64 (varietas padi sensitif Al). Isolasi gen dilakukan berdasarkan kombinasi pendekatan hubungan sintenik antara padi dan rye, dan reverse transcription-polymerase chain reaction menggunakan cetakan berupa mrna dari Hawara Bunar yang telah mendapat cekaman 15 ppm Al pada ph 4.0 selama 24 jam. Karakterisasi dilakukan dengan pendekatan sekuensing, analisis bioinformatika, dan tembakau transgenik yang diintroduksi gen toleran Al. Hasil penelitian mendapatkan gen toleran Al yang ekspresinya diinduksi oleh Al, yang disebut gen B11. Ekspresi gen B11 pada Hawara Bunar lebih tinggi daripada IR64. DNA genomik dari gen B11 berukuran 2021 pb, terdiri dari 3 ekson dan 2 intron, dengan transkrip mrna berukuran 573 pb, daerah sekuen penyandi asam amino sebesar 573 pb, dan menyandikan 113 asam amino deduksi. Gen B11 dapat meningkatkan toleransi tanaman tembakau transgenik terhadap cekaman Al. Protein B11 yang disandikannya mirip dengan protein L32 ribosomal bakteri dan diprediksi berperan sebagai faktor transkripsi dengan domain bzip dan motif seperti C2H2-zinc finger. Kata kunci: Aluminium, gen toleran Al, Nicotiana tabacum, tembakau transgenik. Abstract Aluminum tolerance trait in rice is a quantitative trait controlled by many genes. The objective of this study was to isolate, cloning, and characterize aluminum tolerance gene of local rice genotype Hawara Bunar (Al tolerant). The plant material were rice genotype Hawara Bunar (Al tolerant) and rice variety IR64 (Al sensitive). The gene was isolated based on combination of syntenic relationship between rice and rye, and reverse transcription-polymerase chain reaction approaches using mrna of Hawara Bunar after 15 ppm Al treatment at ph 4.0 for 24 hours. Characterization of the gene was conducted with sequencing, bioinformatic analysis, and trangenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) introducing Al tolerance gene. This research successfully isolated Al tolerance gene, called B11 gene, that its expression was induced by Al. The B11 gene expression in Hawara Bunar (Al tolerant genotype) was higher than that of IR64 (Al sensitive variety). Genomic DNA of the B11 gene had 2021 bp composed of 3 exons and 2 introns with 573 bp of mrna transcript, 342 bp of open reading frame, and 113 deduced amino acid sequence. Transgenic tobacco plants of T0 and T1 generation were constantly more tolerance than non-transgenic tobacco plants. The B11 protein was similar to bacterial like L32 protein and was

2 36 predicted as a transcription factor with bzip domain and C2H2-zinc finger like motif. Key words: Aluminum, Al tolerance gene, Nicotiana tabacum, transgenic. Pendahuluan Padi menjadi tumpuan untuk mengisolasi dan mengklon gen toleran Al karena padi merupakan spesies tanaman pertanian serealia yang paling toleran terhadap cekaman Al (Kim et al. 2001), yang memiliki ukuran genom paling kecil, yaitu 389 Mb nukleotida dibandingkan anggota tanaman serealia lainnya, dan memiliki informasi urutan nukleotida genom paling lengkap (IRSGP 2005). Namun spesies tanaman pertanian yang sering diteliti secara intensif sampai saat ini adalah tanaman gandum (Triticum aestivum L.) (Delhaize et al. 2004; Sasaki et al. 2004). Beberapa studi fisiologi mengidentifikasikan bahwa toleransi tanaman gandum terhadap cekaman Al melibatkan pelepasan asam organik ke rizosfer. Asam organik tersebut mengkelat dan mendetoksifikasi Al di rizosfer sehingga mencegahnya masuk ke akar tanaman gandum. Asam organik di sitoplasma juga berfungsi mengkelat Al membentuk kompleks Al-asam organik yang selanjutnya kompleks tersebut dikeluarkan dari sel-sel akar sehingga sel-sel akar terhindar dari kerusakan akibat Al dan tanaman gandum menjadi toleran Al (Delhaize et al. 1993a, 1993b; Sasaki et al. 2004). Toleransi tanaman gandum terhadap cekaman Al yang meliputi mekanisme ekslusi Al dengan bantuan asam malat tersebut rupanya terkait dengan suatu protein transporter yang ada di membran plasma dari sel akar tanaman gandum (Yamaguchi et al. 2005). Gen penyandi protein tersebut, yaitu gen ALMT1 (Aluminum-activated Malate Transporter) sudah berhasil diisolasi dari tanaman gandum (Sasaki et al. 2004) dan juga sudah diintroduksikan ke tanaman padi sub spesies japonica genotipe Nipponbare. Analisis padi transgenik tersebut menunjukkan bahwa meskipun ekspresi gen ALMT1 di padi berasosiasi dengan sekresi asam malat dari akar tanaman padi transgenik setelah diberi cekaman Al, namun toleransi padi transgenik terhadap cekaman Al tidak meningkat. Kemungkinan jumlah asam malat yang disekresikan tidak cukup untuk meningkatkan toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al melebihi level

3 37 toleransi cekaman Al endogenus yang dimiliki oleh Nipponbare transgenik. Selain itu, kemungkinan gen ortholog ALMT1 di tanaman padi memiliki fungsi lain. Oleh karena itu isolasi gen toleran Al dari tanaman padi merupakan sesuatu yang penting dilakukan untuk dapat mempelajari mekanisme fisiologi dan molekuler yang mendasari toleransi cekaman Al pada tanaman padi. Untuk mengisolasi gen toleran Al diperlukan genotipe padi yang toleran Al. Identifikasi menggunakan larutan hara minimal dan verifikasi pada tanah asam berkelarutan Al tinggi pada penelitian ini telah berhasil mengidentifikasikan bahwa salah satu padi gogo lokal Indonesia bersifat toleran Al, yaitu Hawara Bunar. Oleh karena itu Hawara Bunar berpotensi sebagai sumber gen toleran Al. Toleransi tanaman padi terhadap cekaman Al dikendalikan oleh banyak gen atau berasosiasi dengan QTL (Quantitative Trait Loci). Salah satu QTL toleransi cekaman Al pada tanaman padi yang utama terletak pada kromosom 3 (Nguyen et al. 2001). Analisis pemetaan komparatif mengindikasikan bahwa daerah QTL toleransi cekaman Al padi tersebut ortholog dengan lokus gen toleran Al pada kromosom homoeologous grup 4 dari anggota Triticeae, yaitu lokus gen Alp pada barley (Hordeum vulgare L.), Alt BH pada gandum (Triticum aestivum L.), dan Alt3 pada rye (Secale cereale L.) (Miftahudin et al. 2002; Nguyen et al. 2003). Informasi urutan nukleotida dari DNA genom padi dan data hubungan sintenik dapat menjadi dasar untuk mengembangkan penanda molekuler terkait gen toleran Al. Miftahudin et al. (2004, 2005) telah mengembangkan beberapa penanda molekuler berdasarkan informasi urutan nukleotida dari DNA genom padi untuk membuat pemetaan resolusi tinggi dan mengisolasi gen Alt3. Salah satu penanda molekuler yang telah dibuat adalah B11 (Miftahudin et al. 2005) yang diturunkan dari sekuen mrna unknown gene pada klon BAC kromosom 3 padi. Analisis keterpautan pada populasi rye F2 menunjukkan bahwa produk PCR dari penanda molekuler B11 (disebut gen B11) ko-segregasi dengan lokus gen Alt3. Oleh karena itu mungkin saja Alt3 berlokasi sangat dekat dengan gen B11 atau bisa jadi gen B11 adalah gen Alt3. Namun upaya saat itu untuk mengisolasi dan mengklon gen Alt3 dari tanaman rye belum berhasil (Miftahudin et al. 2005). Pada kromosom 3 dari tanaman padi, wilayah yang menunjukkan hubungan sintenik dengan daerah lokus Alt3 merupakan daerah yang kaya gen dengan

4 38 kerapatan 4.3 kb per gen. Apabila berhasil diketahui bahwa gen Alt3 tersebut atau heterolognya juga ada di segmen kromosom 3 padi dan dapat diidentifikasi peran dari protein yang disandikannya, maka langkah menuju isolasi gen toleran Al dari tanaman padi semakin dekat. Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengklon, dan mengkarakterisasi gen toleran Al dari genotipe padi yang toleran Al, kemudian mengintroduksi dan menguji ekspresinya pada tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.). Bahan dan Metode Bahan Tanaman. Bahan tanaman yang digunakan adalah varietas padi IR64 (sensitif Al) dan genotipe padi Hawara Bunar (toleran Al). Benih padi diperoleh dari Kebun Percobaan Muara, Balai Besar Penelitian Tanaman Padi, Bogor, Jawa Barat. Tanaman model yang dipakai adalah tembakau (Nicotiana tabacum L.). Strain Bakteri dan Plasmid. Bakteri yang digunakan adalah Escherichia coli DH5α dan Agrobacterium tumefaciens AGL-O. Vektor klon berupa pgem- T-Easy. Vektor entri adalah pentr/d-topo (Invitrogen) yang berukuran 2580 pb dan mengandung gen penanda resistensi kanamisin (NPTIII). Vektor ekspresi berupa pgwb5 (Nakagawa et al. 2007) dengan ukuran pb dan mengandung gen penanda seleksi higromisin (HPT), NPTII, dan NPTIII di bawah kendali promotor 35S dari CaMV (Cauliflowers Mozaic Virus) (Gambar 7). Gambar 7. Diagram skematik vektor ekspresi pgwb5 yang telah disisipi gen toleran Al (gen B11). Isolasi DNA Genom Padi. Daun muda dan segar seberat 1.5 gram dari tanaman padi IR64 dan Hawara Bunar yang telah berumur 4 minggu digerus dalam N 2 -cair dan DNA diisolasi menggunakan metode CTAB (Saghai-Maroof et al. 1984). Kualitas dan kuantitas DNA diukur menggunakan spektrofotometer dan elektroforesis pada 1% gel agarose dalam 1x buffer TBE (Tris-Borate-EDTA ph 8.0), tegangan 65 volt selama 30 menit. Larutan DNA total disimpan pada

5 39 suhu -20 C sedangkan larutan DNA kerja dengan konsentrasi 100 ng/μl disimpan di suhu 4 C. Polymerase Chain Reaction (PCR). Sembilan belas penanda molekuler STS (Sequence Tag Site) yang terkait toleransi tanaman rye terhadap cekaman Al diseleksi pada tanaman padi menggunakan teknik PCR pada mesin PCR Swift TM Maxi Thermal Cycler (Esco). Sebagai cetakan digunakan DNA total dari IR64 dan Hawara Bunar. Komposisi reaksi PCR sebagai berikut: 100 ng DNA padi, 1X buffer PCR (+Mg 2+ ), 0.2 mm dntps, 0.4 μm masing-masing primer STS, dan 1 Unit Taq DNA Polymerase dalam 20 μl total reaksi PCR. Kondisi PCR sebagai berikut: pre-pcr selama 5 menit pada suhu 94 C, dan dilanjutkan 35 siklus. Setiap siklus PCR terdiri dari tahapan: denaturasi DNA cetakan selama 45 detik pada suhu 94 C; penempelan primer selama 45 detik pada suhu annealing (tergantung primernya); dan pemanjangan primer selama 1 menit 30 detik pada suhu 72 C. Pasca PCR selama 10 menit pada suhu 72 C. Hasil amplifikasi lalu dimigrasikan pada 1% gel agarose dalam 1x buffer TBE, pada 65 volt selama 1 jam. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan 5 µg/ml etidium bromida, visualisasi di atas lampu UV (WiseUv WUV-M20, Daihan Scientific) dan direkam/foto menggunakan foto gel WiseDoc Gel Documentation System. Amplifikasi dari pasangan primer yang menampilkan satu pita pada salah satu tetua atau satu pita pada kedua tetua akan diseleksi selanjutnya dengan teknik RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) untuk analisis ekspresi. Tahapannya meliputi isolasi RNA total dan RT-PCR. Isolasi RNA Total. Sebanyak 100 kecambah dari masing-masing IR64 dan Hawara Bunar diberi perlakuan cekaman Al sebesar 0 dan 15 ppm pada ph 4.00±0.02 selama 24 jam. Sepanjang cm ujung akar dari setiap kecambah kemudian dipotong, dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 2 ml bebas RNase (tabung baru yang sudah disterilisasi) dan digerus menggunakan stik kaca bebas RNase sambil sesekali dicelupkan ke dalam nitrogen cair. Isolasi RNA selanjutnya dilakukan menggunakan reagen Trizol mengikuti instruksi pabrik (Invitrogen, Molecular Research Center, Inc., USA).

6 40 Total RNA diberi perlakuan enzim DNaseI untuk menghilangkan DNA yang mungkin mengkontaminasi. Komposisi reaksi sebagai berikut: 1x buffer DNaseI, ng RNA total, dan 0.01% air DEPC (diethyl pyrocarbonate) hingga total volume 10 μl, lalu ditambahkan 0.4 unit enzim DNaseI. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 10 menit. Untuk menginaktifasi enzim DNaseI, ditambahkan 5 mm EDTA ph 8.0 ke dalam campuran lalu diinkubasi pada suhu 75 C selama 10 menit. Tabung segera ditempatkan di atas es selama 30 menit lalu diambil 1 ul untuk elektroforesis pada 1% gel agarose, pada 65 volt selama 1 jam. Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Tahap ini meliputi proses transkripsi balik (RT) untuk sintesis cdna dan amplifikasi (PCR). Sintesis cdna menggunakan kit Superscript First-Strand Synthesis System (Invitrogen, USA) dan primer oligo d(t) 21. Komposisi reaksi sebagai berikut: 5000 ng RNA, 1x first strand buffer, 1 μm primer Oligo d(t) 21, 0.5 mm dntps, 10 mm DTT, 40 unit enzim RTase, 0.01% air DEPC hingga total reaksi 20 μl. Campuran tersebut diinkubasi pada mesin PCR dengan program sebagai berikut: 30 C selama 10 menit, 42 C selama 50 menit, 95 C selama 5 menit, dan 20 C selama 5 menit. Skrining penanda molekuler STS rye dengan pendekatan PCR memperoleh 5 penanda molekuler. Kelima penanda molekuler tersebut selanjutnya diskrining dengan pendekatan RT-PCR yaitu PCR menggunakan cetakan berupa cdna IR64 dan Hawara Bunar yang telah mendapat cekaman Al sebesar 0 dan 15 ppm pada ph 4.00±0.02 selama 24 jam. Sebagai kontrol positif, cdna IR64 dan Hawara Bunar tersebut juga diamplifikasi menggunakan primer ubiquitin padi (forward: 5 -CCAGGACAAGATGATCTGCC-3 dan reverse: 5 -AAGAAG CTGAAGCATCCAGC-3 ). Produk PCR dari primer ubiquitin berukuran 245 pb (Lampiran 4). Penanda molekuler yang menghasilkan produk amplifikasi dengan intensitas ekspresi yang berbeda antara IR64 dan Hawara Bunar akan dipilih untuk mengisolasi gen toleran Al. Isolasi Gen Toleran Aluminium dari Tanaman Padi. Pendekatan RT- PCR memperoleh penanda molekuler B11 yang berpotensi digunakan sebagai

7 41 primer untuk mengisolasi gen toleran Al dari tanaman padi. Pita hasil amplifikasi menggunakan primer B11 dengan cetakan berupa cdna Hawara Bunar (selanjutnya disebut gen B11 sebagai gen toleran Al) dipurifikasi dan diligasikan ke dalam vektor pgem-t-easy dengan prosedur sesuai instruksi pabrik (Promega, Madison, WI, USA). Hasil ligasi ditransformasikan ke dalam Escherichia coli DH5α untuk diperbanyak dan juga diisolasi plasmidnya untuk dilakukan pengurutan DNA. Transformasi ke dalam sel E. coli DH5α mengikuti metode heat shock (Hanahan et al. 1995) dengan sedikit modifikasi. Seleksi transforman dilakukan dengan seleksi koloni biru putih menggunakan 20 μl dari 50 mg/ml X-gal, 100 μl dari 100 mm IPTG, dan 100 μg/ml ampisilin. Polymerase Chain Reaction (PCR) Koloni. Beberapa koloni putih yang tumbuh diambil untuk PCR koloni mengikuti prosedur yang dilakukan Suharsono et al. (2008) menggunakan primer B11 forward: 5 -GTTCCCTTTTTCTCCG CTACAG-3 dan reverse: 5 -TCACAGAGGCCCAATCGTTC-3. Berdasarkan PCR koloni maka koloni yang positif membawa gen B11 diisolasi plasmidnya dengan cara mengiinokulasikan pada 10 ml media LB+10μg/ml ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 18 jam. Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit Wizard Plus SV (plasmid) minipreps dengan prosedur sesuai instruksi pabrik (Promega, Madison, WI, USA). Analisis urutan nukleotida dari gen B11 dilakukan menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ( BLAST) (Altschul et al. 1997). Berdasarkan hasil analisis BLAST lalu dirancang sepasang primer untuk memperoleh fragmen gen B11 yang lebih panjang meliputi open reading frame (ORF). Sepasang primer yang telah dirancang yaitu B11_FL forward: 5 -TTCCCCGTAACCCCACGG-3 dan reverse: 5 -GTCACGAGTG GCATTTGAG-3. Plasmid Rekombinan. Primer B11_FL digunakan untuk mengamplifikasi cdna total Hawara Bunar yang telah diberi perlakuan 15 ppm Al pada ph 4.0 selama 24 jam. Produk amplifikasi kemudian diklon ke vektor pgem-t-easy. Plasmid rekombinan pgem-t-easy-b11 yang terbentuk lalu diamplifikasi

8 42 menggunakan primer B11_ORF (forward: 5 - CACCATGGCGGCGGCGGC GGGTTGGCT-3 dan reverse: 5 -TTATGAGCTTGAGTCGCCGGGGTTC CCT-3 ) untuk analisis over ekspresi. Produk PCR kemudian disisipkan ke dalam vektor klon pentr/d-topo menggunakan kit kloning pentr/d-topo (Invitrogen, USA) untuk menghasilkan vektor entri. Reaksi ligasi sebagai berikut: 2 μl (8 ng) produk PCR dari B11_ORF, 1 μl salt solution, 2 μl air steril, dan 1 μl vektor pentr/d-topo. Campuran diinkubasi pada suhu 22.5 C selama 5-30 menit, lalu segera tempatkan di atas es. Sebanyak 3 μl vektor entri dimasukkan ke dalam sel E. coli DH5α kompeten, sisanya disimpan pada suhu -20 C. Media seleksi yang digunakan adalah 50 μg/ml kanamisin. Untuk mengkonfirmasi keberadaan dan orientasi dari gen B11 di dalam vektor entri, dilakukan PCR koloni, isolasi plasmid dari koloni terseleksi, dan pengurutan DNA. Proses PCR dilakukan menggunakan primer B11_ORF forward/t7, dan reverse/t7. Amplifikasi hanya terjadi pada PCR menggunakan pasangan primer B11_ORF forward/t7. Vektor entri direaksikan dengan vektor biner ekspresi pgwb5 menggunakan kit The Gateway LR Clonase enzyme mix (Invitrogen, USA) untuk menghasilkan plasmid ekspresi rekombinan. Komposisi reaksi sebagai berikut: 1 μl vektor entri pentr/d-topo-b11, 1 μl vektor ekspresi pgwb5, 2 μl TE ph 8, dan 1 μl LR reaction. Campuran diinkubasi pada suhu 25 C selama 1-18 jam, lalu reaksi diinaktivasi dengan menambahkan 0.5 μl proteinase-k, inkubasi pada suhu 37 C selama 10 menit, lalu segera ditaruh di atas es untuk transformasi ke dalam sel E.coli DH5α kompeten. Seleksi koloni E.coli DH5α yang membawa plasmid ekspresi rekombinan dilakukan pada media LA+50 μg/ml kanamisin+30 μg/ml higromisin. Transformasi ke dalam Sel Agrobacterium tumefaciens. Plasmid ekspresi rekombinan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens AGL-O dengan metode freeze-thaw mengikuti prosedur yang dilakukan Xu & Li (2008) dan diseleksi pada media LA+50 μg/ml kanamisin+30 μg/ml higromisin. Introduksi ke Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum L.). Satu koloni A. tumefaciens yang positif membawa plasmid ekspresi rekombinan ditumbuhkan

9 43 pada media LB+25 μg/ml rifampisin+50 μg/ml kanamisin+30 μg/ml higromisin, suhu 28 C selama 48 jam. Kultur bakteri disentrifus pada 4000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensikan dengan 10 ml larutan MS+vitamin B5 (Lampiran 5) mengandung 200 μm asetosiringone lalu diinkubasi goyang dengan kecepatan 150 rpm selama 2-3 jam atau sampai OD 600 = 0.3. Sumber eksplan tembakau yang digunakan adalah daun tembakau hasil perbanyakan kultur in-vitro. Daun yang dipakai untuk infeksi adalah daun ke-2 dan 3 dari pucuk. Lembaran daun dipotong dengan ukuran 1cmx1cm, dimasukkan ke dalam suspensi A. tumefaciens, lalu diinkubasikan pada kondisi tanpa cahaya (gelap), suhu 28 C, penggoyangan dengan kecepatan 75 rpm selama 15 menit. Potongan daun dikeringkan menggunakan tissue steril lalu ditanam pada media ko-kultivasi (Lampiran 6) yang di atasnya telah diberi kertas saring steril. Inkubasi dilakukan di ruangan gelap pada suhu 28 C selama 1 hari. Potongan daun dicuci dengan larutan MS sebanyak 2 kali dan larutan MS+250 μg/ml cefotaksim sebanyak 2 kali. Potongan daun yang sudah bersih ditanam di media eliminasi (Lampiran 6) dan diinkubasi selama 5 hari di ruang kultur jaringan. Potongan daun dipindah ke media seleksi transforman (Lampiran 6) dan diinkubasi selama 6 minggu. Eksplan yang tumbuh dipindah ke media regenerasi (Lampiran 6) dan ditumbuhkan selama 3 bulan atau sampai cukup besar untuk diaklimatisasi selama 4 minggu di dalam pot gelas, lalu ditanam di rumah kaca pada media tanah:arang sekam:pupuk kasting (3.5:0.5:1). Karakterisasi Tanaman Tembakau Transgenik. Karakterisasi tanaman tembakau transgenik dilakukan untuk mengetahui fungsi gen B11 dalam mengendalikan toleransi cekaman Al. Karakterisasi dilakukan pada tembakau transgenik generasi T0 dan T1. Karakterisasi tembakau transgenik generasi T0. Karakterisasi tembakau transgenik generasi T0 dilakukan dengan analisis PCR dan uji toleransi cekaman Al. Analisis PCR dilakukan menggunakan cetakan berupa DNA total tembakau transgenik generasi T0 yang diisolasi dengan prosedur mengikuti Miftahudin et al. (2004) serta primer B11_ORF dan HPT (forward: 5 -CTTGATAAACTA AAGGAAAGCCTC-3 dan reverse: 5 -TCACGACGTCATCTATTACC-3 ).

10 44 Lima nomor tembakau transgenik yang positif membawa gen B11 dan HPT diambil secara acak lalu daunnya disterilisasi dan sub kultur pada media sub kultur (Lampiran 6) mengandung 100 μg/ml kanamisin pada ph 5.7. Tunas-tunas yang muncul dan telah memiliki lembaran daun yang sempurna (sekitar 3 minggu setelah tanam) dipisahkan dan ditanam pada media regenerasi (Lampiran 6) ph 5.7. Setelah itu dipilih eksplan yang memiliki minimal 3-4 helai daun sempurna untuk analisis toleransi cekaman Al. Uji toleransi cekaman Al dilakukan pada media regenerasi tembakau (Lampiran 6) mengandung 8.1 ppm Al (300 μm Al) (Fuente et al. 1997) pada ph 4.0. Percobaan terdiri dari 3 ulangan, setiap ulangan terdiri dari 3 botol dan setiap botol ditanami 2 eksplan. Sebagai kontrol, eksplan tembakau transgenik dan nontransgenik ditanam pada media regenerasi, ph 5.7 dengan satu ulangan (karena keterbatasan eksplan). Pengamatan uji toleransi cekaman Al dilakukan pada minggu ke-5 setelah tanam. Variasi morfologi dan habitus tanaman transgenik dan non-transgenik yang ditanam di rumah kaca diamati saat tanaman berbunga (sekitar 3 bulan setelah ditanam di rumah kaca). Karakterisasi tembakau transgenik generasi T1. Karakterisasi tembakau transgenik generasi T1 dilakukan dengan terlebih dahulu menyeleksi biji generasi T1, lalu uji toleransi cekaman Al dan PCR. Seleksi biji dengan teknik kultur jaringan menggunakan 100 μg/ml antibiotik kanamisin (Lampiran 6) pada ph 5.7 selama hari (Delhaize et al. 2001). Uji toleransi cekaman Al dilakukan dengan teknik kultur hara menggunakan 1/6 larutan MS dan konsentrasi Al sebesar 8.1 ppm pada ph 4.2 selama 3 dan 8 hari. Uji toleransi cekaman Al diwakili oleh 37 tanaman untuk setiap nomor tembakau transgenik dan nontransgenik. Sebagai kontrol, tembakau non-transgenik ditanam di larutan 1/6 MS, ph 4.2. Respon toleransi cekaman Al pada tembakau transgenik generasi T1 diukur dengan menghitung pertambahan panjang akar selama tercekam Al. Biji yang akan diseleksi terlebih dahulu disterilisasi. Proses sterilisasi biji mengikuti prosedur yang dilakukan Bovet et al. (2006) dengan sedikit modifikasi. Biji tembakau yang sudah steril dikeringudarakan di atas kertas serap steril selama sekitar 15 menit kemudian satu persatu biji ditanam pada media seleksi biji

11 (Lampiran 6) dan diinkubasi pada ruang gelap, suhu 25 C-28 C selama 3 hari. Setelah 3 hari, dipindah ke rak kultur dengan pencahayaan 16 jam terang/8 jam gelap. Analisis Data. Segregasi sifat resistensi kanamisin pada tembakau transgenik generasi T1 dihitung menggunakan rumus Khi-Kuadrat. Data pertambahan panjang akar tembakau dianalisis secara statistik menggunakan uji-t student. Urutan asam amino deduksi dari gen B11 ditentukan menggunakan program ExPASy-Translate tools ( (Gasteiger et al. 2003). Urutan asam amino deduksi selanjutnya dianalisis menggunakan program BLASTp ( (Altschul et al. 1997), PredictProtein ( (Rost et al. 2004) dengan bank data Prosite, Scansite ( mit.edu/cgibin/motifscan_seq.phtml) (Obenauer et al. 2003) dengan bank data Swiss-Prot, dan MotifScan ( dengan bank data pfam_ls dan hamap. Hasil dan Pembahasan Penggunaan Penanda Molekuler Sequence Tag Site (STS) Rye terkait Toleransi Cekaman Aluminium pada Padi Padi memiliki ukuran genom paling kecil di antara spesies tanaman serealia lainnya dan sudah tersedia bank data dari urutan nukleotida pustaka DNA maupun cdna berukuran besar seperti klon BAC (Bacterial Artificial Chromosome) beserta anotasinya. Kelebihan tersebut menjadikan padi mulai digunakan untuk mengisolasi dan mengklon gen termasuk gen penyandi toleransi cekaman Al melalui pendekatan analisis pemetaan komparatif. Miftahudin et al. (2005) telah melakukan analisis pemetaan komparatif antara rye dan padi dan telah mengembangkan penanda molekuler yang terpaut lokus gen toleran Al rye, Alt3, berdasarkan urutan nukleotida dari klon BAC padi di kromosom 3 yang memiliki hubungan sintenik dengan dengan lokus gen Alt3 tersebut. Empat penanda molekuler telah diaplikasikan pada populasi rye F2 (Miftahudin et al. 2005), dan dua diantaranya yaitu B11 dan B26 bersegregasi bersama-sama dengan lokus gen Alt3, yang berarti keduanya berada pada jarak yang sangat dekat dengan lokus gen 45

12 46 Alt3 berdasarkan peta genetik. Diharapkan bahwa salah satu dari kedua penanda molekuler tersebut sangat dekat baik secara genetik maupun fisik dengan gen Alt3 atau bisa jadi gen Alt3 adalah B11 atau B26. Namun hingga saat ini gen Alt3 dari rye belum dapat diisolasi. Oleh karena penanda molekuler yang dikembangkan oleh Miftahudin et al. (2005) dibuat berdasarkan sekuen klon BAC padi di kromosom 3 yang terpaut dengan lokus gen Alt3, maka kini penanda molekuler tersebut beserta turunannya yang berjumlah 19 diseleksi pada genotipe padi yang toleran Al (Hawara Bunar) dan sensitif Al (IR64). Hasil seleksi ke-19 penanda molekuler STS rye menggunakan teknik PCR dengan cetakan berupa DNA genom Hawara Bunar dan IR64 memperoleh 5 penanda molekuler yang menghasilkan 1 pita pada ke-2 genotipe, yakni B11, B31, 22B6, 24B7, dan 26B8. Seleksi selanjutnya menggunakan teknik RT-PCR dilakukan pada ke-5 penanda molekuler tersebut menggunakan cdna total dari Hawara Bunar dan IR64 yang telah diberi perlakuan cekaman Al sebesar 0 dan 15 ppm selama 24 jam. Analisis RT-PCR menunjukkan bahwa 2 penanda molekuler tidak menghasilkan pita (22B6 dan 26B8) dan 3 penanda molekuler menghasilkan 1 pita (24B7, B31, dan B11). Penanda molekuler 24B7 dan B31 menghasilkan 1 pita namun ekspresinya pada tanaman yang toleran Al maupun sensitif Al sama, baik pada kontrol maupun perlakuan Al. Penanda molekuler B11 menghasilkan 1 pita dan ekspresinya lebih tinggi pada tanaman yang toleran Al ketika tercekam 15 ppm Al dibandingkan ekspresinya pada kontrol (0 ppm Al) dan pada tanaman yang sensitif Al, baik pada kontrol (0 ppm Al) maupun perlakuan (15 ppm Al) (Gambar 8). Berdasarkan hasil analisis ekspresi tersebut, penanda molekuler B11 berpotensi digunakan sebagai primer untuk mengisolasi gen toleran Al dari tanaman padi dan selanjutnya disebut gen B11.

13 47 (A) (B) Gambar 8. (A) Ekspresi gen B11 pada genotipe padi yang sensitif Al (IR64) dan toleran Al (Hawara Bunar) setelah diberi perlakuan 0 dan 15 ppm Al pada ph 4.0±0.02 selama 24 jam. (B) Ekspresi relatif gen B11 terhadap gen Ubiquitin. Analisis Fragmen cdna dari Gen B11 Fragmen cdna dari Gen B11 yang berhasil diisolasi dari Hawara Bunar berukuran 573 pb (Gambar 9). Fragmen cdna tersebut ditranskripsikan dari 3 buah ekson yang terkandung di dalam fragmen DNA dari gen B11 yang berukuran 2021 pb (Gambar 10). Gambar 9. Fragmen cdna dari gen B11 (573 pb). 1: 100 bp DNA Ladder (Fermentas); 2: fragmen cdna dari gen B11; pb: pasang basa. Gambar 10. Struktur DNA dari gen B11 yang terdiri dari 3 ekson dan 2 intron. Hasil pengurutan dan analisis fragmen cdna dari gen B11 menunjukkan bahwa fragmen cdna dari gen B11 yang diklon merupakan bagian dari wilayah

14 48 klon BAC padi pada kromosom 3 dan menyandikan 113 asam amino deduksi (Gambar 11). Analisis BLASTn menggunakan bank data EST (Expressed Sequence Tags) menunjukkan bahwa urutan nukleotida cdna dari gen B11 Hawara Bunar memiliki kesamaan dengan beberapa klon cdna padi yang telah diberi perlakuan 6 ppm CdCl 2 (Tabel 3). Gambar 11. Urutan nukleotida cdna dan asam amino deduksi dari gen B11. Tabel 3. Analisis BLASTn pada urutan nukleotida fragmen cdna dari gen B11. Query: urutan nukleotida cdna Hawara Bunar setelah perlakuan 15 ppm Al selama 24 jam; Bank data: EST (Expressed Sequence Tags). Asesi Deskripsi Skor CI Oryza sativa (japonica cultivar-group) CI root of seedling 6ppm CdCl2 for 3 days CI Oryza sativa (japonica cultivar-group) CI root of seedling 6ppm CdCl2 for 3 days CI Oryza sativa (japonica cultivar-group) CI root of seedling 6ppm CdCl2 for 3 days CI Oryza sativa (japonica cultivar-group) CI root of seedling 6ppm CdCl2 for 3 days Query coverage Nilai E Identitas maks % % % 8e % % 7e % % 3e % Kadmium (Cd) merupakan logam berat yang mencemari tanah sebagai akibat dari kegiatan pertanian dan industri. Kadmium berpotensi sebagai racun bagi tumbuhan dan juga manusia. Kadmium mudah larut di air dan mudah diserap oleh tanaman. Efek kerusakan yang ditimbulkan oleh cekaman Cd mirip

15 dengan cekaman Al dan logam berat lainnya seperti Cu, Ni, dan Pb, yaitu menjadikan akar tanaman sebagai target utama kerusakan. Cekaman Cd pada tanaman dapat menyebabkan klorosis, ketidakseimbangan penyerapan air, penutupan stomata, kerusakan pada aparatus fotosintesis, menurunkan jumlah kloroplas, menghambat kerja enzim fiksasi karbondioksida, sampai dengan mutasi (DalCorso et al. 2010). Oleh karena itu kemungkinan cekaman Al memiliki mekanisme yang mirip dengan cekaman Cd dalam hal penyerapan, transpor, keracunan, dan detoksifikasinya. Analisis BLASTp dengan bank data non-redundant protein sequence (nr) menunjukkan bahwa urutan asam amino deduksi yang disandikan oleh gen B11 (selanjutnya disebut protein B11) memiliki kesamaan 100% dengan protein Os03g (EMBL BAF ) (Tabel 4). Protein Os03g merupakan protein yang mengandung protein L32 ribosomal (EMBL ABF ) dari gen OSJNBa0091P11.11 (EMBL AAL ) yang diklon dari Oryza sativa subspesies japonica genotipe Nipponbare (klon cdna: J033106A15). Bank data embl memberi nama sinonim gen OSJNBa0091P11.11 yaitu Q8S7V4_ORYSJ dengan nama lokus LOC_Os03g Sampai saat ini, semua bank data yang tersedia belum dapat mengungkapkan fungsi protein yang disandikan oleh gen B11. Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan transformasi gen B11 ke tanaman tembakau untuk analisis fungsinya terkait toleransi cekaman Al. Tabel 4. Analisis BLASTp pada urutan asam amino deduksi dari protein B11. Query: urutan asam amino deduksi dari protein B11; Bank data: nonredundant protein sequence (nr). Asesi Deskripsi Skor NP_ EAY NP_ XP_ Os03g [Oryza sativa Japonica Group] ABF ribosomal protein L32 containing protein hypothetical protein OsI_10179 [Oryza sativa Indica Group] >gb ACG ribosomal protein L32 containing protein [Zea mays] hypothetical protein SORBIDRAFT_01g [Sorghum bicolor] Query coverage 49 Nilai E Identitas maks % 8e % % 5e-74 99% % 2e-42 75% % 2e-39 84%

16 50 Konstruksi Vektor Ekspresi Rekombinan pgwb5-b11 Ketika suatu gen telah berhasil diisolasi, tantangan berikutnya yang harus dihadapi adalah menetukan fungsinya. Analisis fungsi gen dapat dilakukan menggunakan tanaman transgenik yang membawa gen target. Studi fenotipe pada analisis fungsi gen dapat dengan cara mengekspresikan atau menghentikan/ menurunkan ekspresi gen target pada tanaman transgenik. Kedua cara tersebut saling melengkapi dan idealnya dilakukan secara paralel. Analisis pada tanaman transgenik untuk mengekspresikan gen target dibedakan atas promotor yang digunakan. Gen yang ditempatkan pada vektor ekspresi di bawah kendali promotor kuat yang konstitutif seperti promotor 35S CaMV (Cauliflower Mozaic Virus) ditujukan agar gen diekspresikan pada semua jaringan secara terusmenerus, sehingga dapat dipelajari fungsi gen tersebut terkait fenotipe yang diinginkan. Metode pengekspresian gen target lainnya adalah mengendalikan ekspresi gen target secara temporal yang dapat diatasi menggunakan promotor khusus yang spesifik jaringan, spefisik stadia pertumbuhan, dan indusibel, misalnya promotor kejut panas. Sebaliknya, analisis tanaman transgenik untuk menghentikan atau menurunkan ekspresi gen target ditujukan untuk melihat dampak yang ditimbulkan jika gen target tidak diekspresikan terkait fenotipe yang diinginkan. Analisis fungsi gen lebih jauh dilakukan untuk menentukan lokalisasi subseluler dari protein yang disandikannya dan fungsi spesifik gen regulator, yaitu dengan cara mengkonstruksi vektor fusi gen target dengan gen reporter (Curtis & Grossniklaus 2003; Yamaji et al. 2009). Pada penelitian ini, gen B11 disisipkan ke dalam vektor ekspresi di bawah kendali promotor 35S CaMV lalu ditransformasi ke tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.), dengan harapan bahwa tembakau transgenik yang diperoleh lebih toleran terhadap cekaman Al dibandingkan tembakau nontransgenik. Pertama-tama fragmen ORF dari gen B11 yang berukuran 342 pb disisipkan ke dalam vektor entri pentr/d-topo dengan teknologi TOPO (Curtis & Grossniklaus 2003; Xu & Li 2008). Vektor entri pentr/d-topo memiliki kelebihan yaitu fragmen DNA atau gen dapat disisipkan secara langsung dan hampir 100% dengan orientasi yang benar ke dalam vektor hanya dengan

17 51 menambahkan 4 nukleotida (5 -CACC-3 ) pada unjung 5 dari primer gen target (Invitrogen). Penyisipan gen B11 ke dalam vektor entri dengan orientasi yang benar telah diverifikasi dengan PCR koloni dan pengurutan nukleotida plasmid pentr/d- TOPO yang membawa gen B11. Orientasi yang benar secara PCR ditandai dengan adanya pita berukuran 499 pb (346 pb insert B daerah attl2 sampai T7) jika plasmid rekombinan diamplifikasi dengan pasangan primer B11_ORF forward dan T7, dan tidak ada pita jika diamplifikasi menggunakan pasangan primer B11_ORF reverse dan T7 (invitrogen, USA). Hasil verifikasi dengan PCR koloni pada 4 koloni yang diambil secara acak mendapatkan 3 koloni yang positif membawa gen B11 dan memiliki orientasi yang benar. Satu koloni yang positif membawa gen B11 dengan orientasi yang benar lalu di sub kultur untuk isolasi plasmid dan pengurutan nukleotida. Hasil pengurutan nukleotida membuktikan bahwa daerah ORF dari gen B11 sudah tersisipi di dalam vektor entri dengan orientasi yang benar (Gambar 12). (A) (B) Gambar 12. (A) Peta vektor entri rekombinan pentr/d-topo-b11 (sumber: Invitrogen). (B) Orientasi dan urutan nukleotida ORF (huruf berwarna merah) dari gen B11 di dalam vektor entri rekombinan pentr/d-topo-b11. Konstruksi vektor ekspresi rekombinan yang membawa gen B11 (pgwb5- B11) dilakukan dengan teknik Gateway, yaitu merekombinasikan vektor entri rekombinan pentr/d-topo-b11 dengan vektor ekspresi pgwb5 menggunakan enzim klonase (Curtis & Grossniklaus 2003). Rekombinasi dapat terjadi karena enzim klonase mengandung protein integrase (Int) dan protein Ekscisionase (Xis)

18 52 dari bakteriofage λ, dan E. coli-encoded protein Integration Host Factor (IHF) (Invitrogen). Plasmid ekspresi rekombinan pgwb5-b11 (Gambar 13) selanjutnya ditransformasikan ke dalam sel kompeten E. coli DH5α dan juga Agrobacterium tumefaciens. Dua koloni A. tumefaciens positif mengandung plasmid rekombinan pgwb5-b11 setelah diverifikasi dengan PCR koloni, isolasi plasmid, dan PCR plasmid. Plasmid dari salah satu koloni yang akan digunakan untuk menginfeksi potongan daun tembakau diverifikasi lebih lanjut dengan mengurutkan nukelotidanya. Hasil pengurutan nukleotida menunjukkan bahwa plasmid mengandung urutan nukleotida dari fragmen ORF gen B11. pgwb5-b11 Gambar 13. Vektor ekspresi rekombinan pgwb5-b11. Tembakau Transgenik Pembawa Gen B11 Gen B11 sebagai gen toleran Al dari tanaman padi telah berhasil disisipkan ke dalam vektor ekspresi pgwb5 dengan promotor kuat 35SCaMV dan telah diintroduksikan ke dalam A. tumefaciens. Koloni A. tumefaciens yang positif mengandung gen B11 selanjutnya diinfeksikan ke potongan daun tembakau. Dari 50 potongan daun tembakau yang diinfeksi, 23 potongan daun menghasilkan tunas. Tunas yang berhasil tumbuh menjadi eksplan berjumlah 65. Pada potongan daun tembakau yang tidak diinfeksi dan ditumbuhkan di media seleksi transforman (kontrol negatif) juga muncul tunas, tetapi tunas tersebut akhirnya mati sekitar sebulan kemudian karena tidak resisten terhadap antibiotik seleksi. Hasil ini menunjukkan bahwa konsentrasi antibiotik seleksi transforman sebesar 50 μg/ml kanamisin+10 μg/ml higromisin sudah cukup untuk dapat menyeleksi tunas yang muncul.

19 53 Keberhasilan introduksi gen atau fragmen DNA asing ke dalam tanaman dapat dideteksi baik secara morfologi maupun molekuler dengan PCR dan RT- PCR (Chaidamsari et al. 2006). Oleh karena itu, satu bulan setelah aklimatisasi, 34 tanaman tembakau yang berhasil tumbuh lalu diisolasi DNA-nya dan digunakan sebagai cetakan pada proses PCR. Hasil PCR menunjukkan bahwa 15 tanaman positif membawa pita B11_ORF (346 pb) dan HPT (570 pb). Vektor ekspresi pgwb5 menghasilkan pita HPT tetapi tidak menghasilkan pita B11_ORF. Tembakau non-transgenik tidak menghasilkan pita B11_ORF maupun HPT. Vektor ekspresi rekombinan pgwb5-b11 diamplifikasi sebagai kontrol positif dan menghasilkan pita B11_ORF dan HPT (gambar pita HPT tidak ditampilkan) (Gambar 14). Hasil ini menunjukkan bahwa gen B11 telah terintegrasi ke dalam genom pada ke-15 tanaman tembakau transgenik. Selain itu gen B11 tidak ada di tembakau dan ini menandakan bahwa tanaman tembakau layak dijadikan tanaman model untuk analisis fungsi gen B11 terkait toleransinya terhadap cekaman Al. Semua tanaman tembakau hasil transformasi selanjutnya ditanam di rumah kaca sampai dewasa untuk menghasilkan biji generasi T1. Gambar 14. Hasil PCR menggunakan primer B11_ORF (346 pb). M: 100 bp DNA Ladder, 1: pgwb5, 2: plasmid pgwb5-b11, 3: tembakau nontransgenik, 4 s/d 18: 15 nomor tembakau transgenik (T0-1, T0-2, T0-3, T0-4, T0-5, T0-6, T0-7, T0-8, T0-9, T0-11, T0-13, T0-15, T0-20, T0-22, T0-23). Hasil PCR DNA genom tembakau transgenik (Gambar 14) menunjukkan bahwa gen B11 telah terintegrasi ke dalam genom tembakau transgenik. Pemeriksaan selanjutnya pada penelitian ini adalah mengamati morfologi tembakau transgenik. Secara morfologi, daun yang terletak di sekitar bunga pada tembakau transgenik memiliki variasi tepian daun (Gambar 15). Selain itu, tanaman tembakau transgenik memiliki variasi dalam hal ukuran dan jumlah bunga di dalam satu karangan bunga. Tanaman tembakau transgenik cenderung lebih tinggi, yaitu berkisar cm, dibandingkan non-transgenik yang

20 54 memiliki tinggi kurang dari 150 cm. Adanya variasi tersebut menunjukkan bahwa proses introduksi gen B11 ke dalam genom tembakau berlangsung dengan baik. Masuknya gen B11 menyebabkan perubahan morfologi yang sebelumnya tidak dijumpai pada tembakau non-transgenik atau tembakau tipe liar. (A) (B) Gambar 15. Variasi bentuk dan tepian daun yang terletak di sekitar bunga. (A): tembakau non-transgenik; (B): tembakau transgenik. Pada perbanyakan secara kultur jaringan seringkali dijumpai variasi morfologi atau disebut juga variasi somaklonal (Taji et al. 2002; Jayasangkar 2005). Beberapa faktor yang dapat menyebabkan variasi somaklonal adalah faktor fisiologi berupa penambahan zat pengatur tumbuh, kondisi kultur seperti suhu, durasi kultur yang panjang, dan lamanya fase pertumbuhan kalus; faktor genetik berupa tipe kultur yang digunakan dan keragaman sitologi di antara sel-sel dalam satu jaringan; dan faktor biokimia berupa penambahan dan komposisi bahan kimia yang digunakan dalam media kultur jaringan (Taji et al. 2002; Jayasangkar 2005). Analisis Toleransi Cekaman Aluminium pada Tembakau Transgenik Generasi T0 Lima nomor tanaman tembakau transgenik generasi T0 lalu diambil secara acak untuk analisis toleransi cekaman Al. Hasil analisis menunjukkan bahwa pada media tanpa Al (-Al), pertumbuhan tajuk dari tembakau non-transgenik dan transgenik berkembang dengan baik. Pertumbuhan akar pada tembakau

21 transgenik lebih pendek dibandingkan non-transgenik, tetapi akar cabang pada tembakau transgenik lebih banyak daripada non-transgenik (Gambar 16). 55 -Al +Al Nt T0-1 T0-2 T0-6 T0-13 T0-15 Gambar 16. Respon tembakau non-transgenik (Nt) dan 5 nomor tembakau transgenik generasi T0 (T0-1, T0-2, T0-6, T0-13, dan T0-15) terhadap cekaman Al sebesar 0 (-Al) dan 8.1 ppm (+Al) pada ph 4.0 selama 5 minggu. Bar: 10 cm.

22 56 Pertumbuhan akar dari tembakau non-transgenik pada media dengan perlakuan Al (+Al) hampir sama dengan pertumbuhannya di media -Al, tetapi pada media +Al pertumbuhan tajuknya sangat tertekan, menguning, dan mati. Sebaliknya, pertumbuhan akar dari tembakau transgenik pada media +Al lebih panjang dibandingkan pertumbuhannya pada media -Al, dan pertumbuhan tajuknya sedikit tertekan tetapi tetap berwarna hijau (Gambar 16). Cekaman Al dapat menyebabkan laju fotosintesis menurun dan tidak berlangsung normal karena kloroplas, klorofil, dan perangkat fotosistem II di tajuk rusak oleh Al (Panda et al. 2009). Penurunan laju fotosintesis menyebabkan karbohidrat sebagai fotosintat berkurang. Karbohidrat sangat dibutuhkan oleh tanaman untuk sintesis energi ATP, protein, dan lipid yang diperlukan untuk metabolisme dan pertumbuhan tanaman. Pada penelitian ini, cekaman Al yang berlangsung selama 5 minggu telah menyebabkan rusaknya klorofil dan perangkat fotosintesis lainnya, yang ditunjukkan oleh tajuk yang menguning, layu, dan mati pada tembakau non-transgenik. Keadaan tersebut menyebabkan proses fotosintesis terhambat dan kerusakan akar akibat cekaman Al tidak dapat ditekan. Kerusakan klorofil, kloroplas, dan perangkat fotosistem II pada tembakau transgenik tidak sebesar seperti kerusakan yang terjadi pada tembakau nontransgenik. Hal itu ditunjukkan oleh tajuk yang berwarna hijau dan dengan demikian fotosintesis tetap dapat berlangsung baik, kerusakan akar berkurang, dan tanaman tembakau transgenik dapat hidup sampai akhir perlakuan cekaman Al. Fenomena ini mungkin merupakan hasil dari ekspresi gen B11 yang tidak dijumpai pada tembakau non-transgenik. Klorosis atau kerusakan kloroplas dan penurunan jumlah klorofil akibat cekaman Al juga ditemukan pada tanaman jagung. Cekaman Al sebesar ppm (556 μm) selama 2 hari dapat menimbulkan klorosis dan defisiensi mangan, sedangkan cekaman selama 6 hari dapat menurunkan bobot kering akar dan tajuk berturut-turut sebesar 61.1% dan 34.8% (Prasetyo 2007). Cekaman Al dapat menyebabkan peningkatan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan peroksidasi lipid, lalu sel kehilangan fungsinya, dan nekrosis. Cekaman Al pada tanaman tomat telah menginduksi protein antioksidan dan pendetoksifikasi Al yang berguna untuk melindungi sel dari kerusakan akibat peningkatan produksi

23 57 ROS. Cekaman Al juga dapat menghambat kerja mesin fotosintesis dan fiksasi karbon (Zhou et al. 2009). Seleksi Biji Tembakau Transgenik Generasi T1 Analisis toleransi cekaman Al juga telah dilakukan pada biji tembakau transgenik generasi T1 untuk melihat stabilitas ekspresi gen B11 terkait toleransinya terhadap cekaman Al. Sebelum analisis toleransi cekaman Al dilakukan, biji generasi T1 terlebih dahulu diseleksi untuk memilih tanaman T1 yang konsisten membawa gen B11. Seleksi dapat dilakukan menggunakan antibiotik higromisin dan kanamisin. Pada penelitian ini seleksi dilakukan menggunakan antibiotik kanamisin karena harganya lebih murah daripada higromisin. Pemakaian antibiotik kanamisin mengikuti Delhaize et al. (2001) yaitu sebesar 100 μg/ml selama hari. Pada penelitian ini pertama-tama diuji dosis kanamisin tersebut pada tembakau non-transgenik untuk menentukan ciriciri kecambah yang sensitif kanamisin. Biji tembakau non-transgenik ditumbuhkan pada media seleksi mengandung 100 μg/ml kanamisin dan non-seleksi (MS, kontrol positif). Hasil aplikasi 100 μg/ml kanamisin selama hari menunjukkan bahwa 100% tembakau nontransgenik sensitif kanamisin dan pertumbuhannya ditekan pada media seleksi tersebut. Sensitifitas tembakau non-transgenik terhadap kanamisin terdeteksi mulai umur 21 hari setelah tanam, yaitu biji yang berkecambah hanya memiliki dua helai daun yang berwarna hijau, sedangkan primordia daun ke-3 dan 4 (jika ada) berwarna putih dan mempunyai akar yang tetap pendek (tidak lebih dari 1 cm). Pada minggu selanjutnya daun menguning lalu seluruh bagian tanaman memutih dan akhirnya kecambah mati pada umur 8 minggu. Sebaliknya biji nontransgenik yang ditumbuhkan pada media non-seleksi dapat berkecambah, jumlah daun bertambah banyak (lebih dari 4 helai) dan berwarna hijau serta akar bertambah panjang (lebih dari 1 cm). Disimpulkan bahwa seleksi tembakau transgenik dapat dilakukan menggunakan antibiotik kanamisin dengan konsentrasi sebesar 100 μg/ml selama hari. Kecambah yang sensitif kanamisin diindikasikan oleh jumlah daun tetap dua helai, bakal daun ketiga berwarna putih dan tidak berkembang menjadi helaian daun sempurna (Gambar 17).

24 58 Gambar 17. Respon tembakau non-transgenik pada media seleksi biji (MS+100 μg/ml kanamisin) dan non-seleksi (MS). Bar: 1 cm. Berdasarkan hasil tersebut maka biji tembakau transgenik generasi T1 diseleksi menggunakan dosis kanamisin sebesar 100 μg/ml selama hari. Beberapa biji generasi T1 memperlihatkan resistensinya terhadap kanamisin dan berkecambah dengan baik. Kecambah yang resisten kanamisin memiliki daun lebih dari 4 helai dan berwarna hijau serta akar bertambah panjang, yakni lebih dari 1 cm. Kecambah T1 yang sensitif kanamisin memiliki daun yang berwarna hijau hanya 2 helai. Primordia daun ke-3 dan 4 (jika ada) berwarna putih dan tidak ada pembentukkan daun baru. Panjang akar tidak lebih dari 1 cm (Gambar 18). Jika dibiarkan di media seleksi sampai umur 8 minggu, maka seluruh bagian tanaman dari kecambah transgenik T1 yang sensitif kanamisin ini akan memutih dan akhirnya kecambah mati seperti halnya kecambah non-transgenik yang ditumbuhkan di media seleksi. Beberapa biji tembakau transgenik generasi T1 terbukti menunjukkan resistensinya terhadap kanamisin. Uji Khi-Kuadrat mengindikasikan bahwa sifat resistensi kanamisin diwariskan dari generasi T0 ke T1, dan rasio pewarisannya pada ke-5 nomor tembakau transgenik yang diuji adalah 3:1 (resisten:sensitif). Hasil ini menunjukkan bahwa gen resistensi kanamisin telah terintegrasi ke dalam genom tembakau transgenik dan pewarisannya diasumsikan mengikuti pola pewarisan gen tunggal (Tabel 5). Hal ini mengindikasikan bahwa kelima nomor

25 59 tembakau transgenik yang diuji mengandung satu kopi gen B11. Dua hal yang menjadi pertimbangan adalah bahwa (1) rasio segregasi sifat resistensi:sensitif kanamisin mengikuti pewarisan gen tunggal yaitu 3:1; dan (2) gen B11 berada pada jarak yang sangat dekat dengan gen penyandi resistensi kanamisin yang tidak memungkinkan terjadinya pindah silang di antara keduanya, sehingga diasumsikan keduanya selalu bersegregasi bersama-sama. Gambar 18. Respon kecambah tembakau transgenik generasi T1 (T1-1, T1-2, T1-6, T1-13 dan T1-15) pada media seleksi biji mengandung 100 μg/ml kanamisin selama 21 hari. Tanda panah lurus menunjukkan kecambah sensitif kanamisin dan panah berbelok resisten kanamisin. Bar: 1 cm. Tabel 5. Rasio pewarisan sifat resistensi kanamisin pada generasi T1 dari 5 nomor tembakau transgenik. Nomor tanaman Total biji yang dianalisis Jumlah biji yang resisten kanamisin Jumlah biji yang sensitif kanamisin χ 2 (3:1) (db=1; α=0.05) hitung χ 2 (3:1) (db=1; α=0.05) tabel T T T T T Nt Hasil serupa dijumpai ketika Ezaki et al. (2000) menyeleksi biji Arabidopsis generasi T1 menggunakan antibiotik seleksi kanamisin, dan mendapatkan bahwa rasio pewarisan sifat resisten:sensitif kanamisin mengikuti rasio segregasi kopi gen tunggal 3:1. Hasil tersebut mengindikasikan insersi lokus tunggal gen target di dalam genom Arabidopsis transgenik generasi T1. Dian-jun et al. (2008) berhasil membuktikan bahwa rasio segregasi sifat resistensi antibiotik seleksi higromisin sejalan dengan hasil analisis Southern blot yang biasa digunakan untuk menentukan jumlah kopi gen target di dalam tanaman transgenik. Biji padi

26 60 transgenik generasi T1 diseleksi menggunakan antibiotik higromisin dan menghasilkan rasio pewarisan sifat resistensi higromisin mengikuti rasio segregasi kopi gen tunggal 3:1. Analisis Southern blot memberikan hasil yang sejalan dengan rasio segregasi sifat resistensi higromisin, yaitu jika padi transgenik membawa lebih dari 1 kopi gen target maka rasio segregasi dari sifat resistensinya terhadap higromisin tidak mengikuti rasio kopi gen tunggal 3:1. Sebaliknya, jika hanya terdeteksi 1 kopi gen target maka segregasi dari sifat resistensinya terhadap antibiotik higromisin mengikuti rasio segregasi kopi gen tunggal 3:1. Analisis Toleransi Cekaman Aluminium pada Tembakau Transgenik Generasi T1 Kecambah tembakau transgenik generasi T1 yang resisten kanamisin selanjutnya ditumbuhkan pada larutan 1/6 MS+8.1 ppm Al pada ph 4.2 selama 3 dan 8 hari untuk analisis toleransi cekaman Al. Hasil analisis menunjukkan tidak terdapat perbedaan nyata pada pertambahan panjang akar antara tembakau transgenik T1-2, T1-6, dan T1-13 yang diberi perlakuan Al selama 3 hari dengan tembakau Nt (non-transgenik) yang tidak diberi perlakuan Al. Sebaliknya, tembakau transgenik T1-1 dan T1-15 serta Nt yang diberi perlakuan Al selama 3 hari memiliki pertambahan panjang akar yang secara nyata (P<0.002) lebih pendek dibandingkan tembakau Nt yang tidak diberi perlakuan Al. Hasil tersebut menunjukkan bahwa pada cekaman Al selama 3 hari menyebabkan pertumbuhan akar dari tanaman T1-2, T1-6, dan T1-13 tidak terlalu terhambat, sebaliknya tanaman T1-1, T1-15, dan Nt sangat terhambat. Walaupun demikian, terdapat perbedaan nyata pertambahan panjang akar antara tembakau Nt dibandingkan dengan T1-1, T1-2, T1-6, dan T1-13 (P<0.000) serta T1-15 (P<0.028) ketika tercekam Al selama 3 hari. Hasil tersebut menunjukkan bahwa kelima nomor tembakau transgenik menghasilkan pertambahan panjang akar yang lebih panjang dibandingkan Nt ketika diberi cekaman Al selama 3 hari (Gambar 19). Pertambahan panjang akar pada Nt dan kelima nomor transgenik pada perlakuan Al selama 8 hari secara nyata lebih pendek (P<0.000) dibandingkan Nt yang tidak diberi perlakuan Al, yang mengindikasikan terdapat penghambatan pertumbuhan akar baik pada Nt maupun kelima nomor transgenik. Akan tetapi,

27 61 Nt memiliki pertambahan panjang akar paling pendek dibandingkan dengan T1-2, T1-6, dan T1-13 (P<0.000), T1-1 (P<0.001), serta T1-15 (P<0.024) ketika diberi cekaman Al selama 8 hari (Gambar 19). Gambar 19. Respon tembakau non-transgenik (Nt) dan lima nomor tembakau transgenik generasi T1 (T1-1, T1-2, T1-6, T1-13, dan T1-15) terhadap cekaman Al sebesar 8.1 ppm pada ph 4.2 selama 3 dan 8 hari, dengan nilai rata-rata standar eror (SE mean ). (-Al): tanpa perlakuan Al, (+Al): dengan perlakuan Al. Hasil analisis toleransi cekaman Al selama 3 dan 8 hari tersebut mengindikasikan bahwa kelima nomor tembakau transgenik lebih toleran terhadap cekaman Al daripada Nt. Toleransi cekaman Al yang lebih tinggi pada tembakau transgenik disebabkan adanya ekspresi dari gen B11 yang tidak dijumpai pada Nt atau tembakau tipe liar. Toleransi cekaman Al tertinggi dijumpai pada tembakau transgenik T1-13 dan T1-2. Cekaman Al dilaporkan dapat menyebabkan pemanjangan akar terhambat dengan cara Al menghambat mekanisme pembelahan sel (Ma et al. 2004; Panda et al. 2009). Daerah ujung akar yang mudah rusak oleh cekaman Al adalah tudung akar, meristem, dan zona pemanjangan akar. Di tingkat seluler, Al sangat mudah merusak dinding sel-sel epidermis dan korteks, permukaan membran plasma, sitoskeleton, dan inti sel. Ion Al 3+ yang berinteraksi dengan gugus lipid

28 62 dari membran plasma sel memicu terjadinya peroksidasi lipid. Serangkaian mekanisme yang terjadi selanjutnya menyebabkan penurunan aktifitas mitokondria dan penurunan respirasi sel sehingga sel kehabisan ATP, lalu menginduksi terbentuknya ROS. Kerusakan struktur dan fungsi membran plasma akibat peroksidasi lipid dan depolarisasi membran plasma yang diinduksi oleh Al sangat mempengaruhi kapasitas tukar kation, salah satunya penyerapan ion Ca 2+ (Panda et al. 2009). Gangguan keseimbangan konsentrasi ion Ca 2+ sitoplasmik di sel-sel akar merupakan pemicu utama keracunan Al (Kochian 1995) karena Ca 2+ sitoplasmik berperan mengatur berbagai proses pertumbuhan sel dan metabolisme di dalam sel (Panda et al. 2009). Cekaman Al sebesar 1.35 ppm (50 μm) selama 5 jam atau 2.70 ppm (100 μm) selama 2 jam dapat mengganggu proses metabolik yang bergantung Ca 2+ sitoplasmik, salah satunya adalah proses pembelahan dan pemanjangan sel. Cekaman Al meningkatkan konsentrasi Ca 2+ sitoplasmik di sel-sel ujung akar dan menginduksi sintesis kalosa (1,3-β-glukan) yang lalu menumpuk di plasmodesmata sehingga menghambat pemanjangan akar (Ma et al. 2002). Cekaman Al menyebabkan perubahan dinding sel karena Al terikat ke dinding sel, kemudian terjadi lignifikasi dan pembentukkan kalosa sehingga permeabilitas dinding dan membran sel menurun. Kondisi tersebut menginduksi cekaman kekeringan dan penurunan tekanan turgor. Tekanan turgor sangat dibutuhkan pada proses pemanjangan sel. Pada sel-sel yang sedang mengalami pemanjangan, dinding selnya menipis yang memungkinkan terjadinya penyisipan massa pada dinding sel agar sel mencapai ukuran yang siap untuk membelah. Namun saat cekaman Al, yang menyisip bukan massa sel tetapi Al, sehingga mengakibatkan dinding sel menjadi kaku, pemanjangan dan pembelahan sel terhambat (Milla et al. 2002). Pada penelitian ini, ekspresi gen B11 dapat meningkatkan toleransi tembakau transgenik generasi T0 dan T1 terhadap cekaman Al. Gen B11 kemungkinan berperan dengan cara mencegah kerusakan perangkat fotosintesis seperti klorofil sehingga fotosintesis dapat terus berlangsung dengan baik walaupun tanaman sedang mengalami cekaman Al. Fenomena tersebut dapat

29 63 dilihat pada tajuk tembakau transgenik yang tetap hijau ketika tercekam Al, sedangkan tajuk tembakau non-transgenik menguning dan mati. Akar, dengan demikian, menerima fotosintat dan energi dalam jumlah yang cukup untuk mendukung pemanjangan dan pembelahan sel-sel akar. Selain itu, ekspresi gen B11 kemungkinan dapat menekan efek penghambatan mekanisme pemanjangan dan pembelahan sel yang ditimbulkan oleh Al, sehingga akar dapat terus tumbuh dan memanjang. Pada penelitian ini juga diperoleh hasil bahwa analisis toleransi cekaman Al pada tanaman tembakau dapat dilakukan pada konsentrasi Al sebesar 8.1 ppm (Fuente et al. 1997) dengan larutan hara 1/6 MS pada ph 4.2 selama 3 atau 8 hari. Karakter yang diukur adalah pertambahan panjang akar selama tercekam Al. Stabilitas Transgen pada Generasi T1 Stabilitas transgen yang dideteksi dengan teknik PCR menunjukkan bahwa semua tanaman tembakau transgenik generasi T1 yang diuji menghasilkan pita B11_ORF (346 pb) dan HPT (570 pb). Tanaman tembakau non-transgenik tidak menghasilkan pita B11_ORF maupun HPT (kontrol negatif). Vektor ekspresi pgwb5 menghasilkan pita HPT (kontrol positif) tetapi tidak menghasilkan pita B11_ORF (kontrol negatif). Vektor ekspresi rekombinan pgwb5-b11 sebagai kontrol positif menghasilkan pita B11_ORF dan HPT (Gambar 20). Hasil PCR tersebut menunjukkan stabilitas introgresi gen B11 pada generasi T1. Gambar 20. Elektroforegram pita HPT (A) dan B11_ORF (B). M: 100 bp DNA Ladder, 1: kontrol PCR, 2: pgwb5, 3: pgwb5-b11, 4: tembakau non-transgenik, 5: tembakau transgenik generasi T1 (T1-1-5, T1-1-12, T1-1-19; T1-2-7, T1-2-26, T1-2-32; T1-6-7, T1-6-12, T1-6-27; T , T , T ; T1-15-4, T , T ).