INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO 4 )

Transkripsi

1 INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO 4 ) Oleh RHENI HAFIDIANA F FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2 Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO 4 ) Ringkasan Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Gula biasanya diartikan sebagai sukrosa untuk penggunaan komersial. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda, yaitu nira tebu mengandung 14-20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15-20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10-15% sukrosa. Degradasi sukrosa merupakan hal yang harus dihindari pada industri gula karena mempersulit proses kristalisasi. Hal ini disebabkan oleh hidrolisis sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) atau senyawa turunan lainnya pada produk-produk gula seperti sukrosa, merupakan penyebab menurunnya kualitas produk tersebut. Inhibisi aktivitas enzim telah dilakukan dengan mengkombinasikan suhu dan tekanan tinggi, namun mempengaruhi kualitas produk. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, ph, konsentrasi enzim konsentrasi substrat, serta adanya inhibitor. Inhibitor dapat berupa bahan alami, seperti kentang, tomat dan tembakau. Akan tetapi, selain mengandung inhibitor, bahan tersebut masih mengandung bahan lain, sehingga perlu pemurnian. Kation Cu (II) dalam bentuk garam logam CuCl 2 talah diteliti dapat menghambat aktivitas invertase. Terdapat garam Cu (II) lainnya, yaitu CuSO 4. Aktivitas invertase dengan penambahan garam logam CuSO 4 pada kondisi konsentrasi, konsentrasi substrat, ph, suhu dan lama pemanasan yang berbeda perlu diteliti, sehingga diketahui kemampuan inhibisi garam logam tersebut. Selain itu, dapat diketahui model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan hubungan perubahan ph, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO 4 terhadap degradasi sukrosa. Penelitian ini juga bertujuan untuk menentukan parameter kinetika laju degradasi (K M dan V maks ) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO 4. Keseluruhan pengujian menggunakan metode pengukuran gula pereduksi yang dihasilkan akibat hidrolisis sukrosa menggunakan DNS (dinitro salicylic acid). Pengaruh perubahan faktor pada setiap taraf ditentukan dengan menggunakan analisis sidik ragam (Anova) dan uji lanjut Duncan. Model dan parameter kinetika inhibisi yang paling sesuai ditentukan dengan menggunakan software SigmaPlot. Inhibisi oleh CuSO 4 terhadap invertase dipengaruhi oleh perubahan konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu dan lama pemanasan. Pada rasio konsentrasi invertase terhadap sukrosa 1 : 5000 dan ph larutan invertase 4.5, CuSO mm berperan sebagai aktivator invertase, sedangkan mulai konsentrasi 2.5 mm berperan sebagai inhibitor. Konsentrasi CuSO mm memberikan inhibisi tertinggi (95.1%) pada suhu 60 C, ph larutan invertase 4.5, rasio invertase terhadap sukrosa 1 : Aktivitas invertase sangat rendah pada 2

3 ph 3 dan ph 7 ke atas serta turun signifikan hingga 20 detik pemanasan. Inhibisi oleh CuSO mm terjadi pada lama pemanasan 0 10 detik. Kinetika inhibisi laju degradasi sukrosa oleh CuSO 4 yang dilakukan pada ph 7 dengan tiga titik suhu (40 C, 50 C, 60 C) menghasilkan nilai K M dan V maks yang berbeda. Kecepatan reaksi meningkat dengan kenaikan suhu. Model kinetika inhibisi invertase oleh CuSO 4 berbeda pada setiap suhu yang diujikan. Model inhibisi oleh CuSO 4 pada suhu 40 C adalah mixed (partial), dengan nilai K M 8.6 g/l, V maks µm/menit turun menjadi 64.1 µm/menit, Ki mm, α 75.1, β 3.1. Model inhibisi oleh CuSO 4 pada suhu 50 C juga mixed (partial) dengan nilai K M 21.1 g/l, V maks µm/menit turun menjadi µm/menit, Ki 2.873e-9 mm, α , β Model inhibisi pada suhu 60 C bersifat kompetitif (full), dengan nilai K M 3555e+6 g/l naik menjadi 4.622e+6 g/l, V maks 1.732e+7 µm/menit, Ki 11.4 mm. 3

4 Inhibition on Invertase Activity in Sucrose Using Copper Sulphate (CuSO 4 ) Summary Sucrose (glucose-1,2 fructose) is the most commonly used as sweetener for human consumption. In commercial usage, the term sugar usually refers to sucrose. There are a number of sugar s sources, such as sugarcane, coconut-palm juice, fan-palm juice and sugar beets which content of sucrose are different. Sugarcane contains 14-20% sucrose, coconut-palm juice contains 15-20% sucrose, while 10-15% in fan-palm juice. Sucrose is widely used in industry for various purpose, but the degradation of sucrose is easily occured. Sucrose is converted into invert sugar, called reducing sugar or other derived compounds in many sugar products can cause decreasing quality of sugar. Enzyme inhibition is done by combining the temperature and high pressure, but it s influence the quality of the product. Enzyme activity was influenced by temperature, ph value, enzyme concentration, substrate concentration, and presence of inhibitors. Inhibitors can be found natural sources, such as potato, tomato, and tobacco. Besides containing inhibitor, they still contain other ingredients, therefore purification is needed. Cu (II) cation as CuCl 2 metal salt is known as element which can inhibit the activity of invertase. There are another Cu (II) as metal salt, it is CuSO 4. The activity of invertase with addition of CuSO 4 in different enzyme concentration, substrate concentration, ph, temperature and heat treatment should be learn, in order to recognize the inhibition capability of CuSO 4. Besides that, the inhibition kinetic model can be figured out, which is needed for process engineering. The objective of this research is to obtain the influence of substrate concentration, enzyme concentration, ph value, incubation temperature and heat treatment with present of CuSO 4 concerning to sucrose degradation. Besides that, it was also to determine the inhibition kinetic parameter (K M and V maks ) of the rate of sucrose degradation with addition of CuSO 4. The whole research uses the reducing sugar measurement method, as a result of sucrose hydrolisis using DNS (dinitro salicylic acid). The influence of factor s changes in each level are determined by using analysis of variance (ANOVA) and Duncan test. The most suitable model and parameter of inhibition kinetic is determined by using SigmaPlot software. CuSO 4 concentration, substrate concentration, enzyme concentration, ph value, incubation temperature and heat treatment affect inhibition by CuSO 4. At the ratio of invertase to sucrose is 1 : 5000, CuSO mm can be used as an invertase activator, while as invertase inhibitor with the minimum concentration 2.5 mm. CuSO mm give maximum inhibition (95.1%) at 60 C, ph value of invertase is 4.5, ratio of invertase to sucrose is 1 : Invertase activity is very low at ph 3 and more than ph 7. The activity was also decreases significantly until 20 second of heat treatment. Inhibition was occured by 0 10 second of heat treatment. 4

5 The kinetic inhibition of of sucrose degradation rate by CuSO mm done at ph 7 with three temperature treatment (40 C, 50 C, 60 C) make K M and V maks value are vary. The reaction rate of it increases as well as the temperature. The inhibition kinetics model of invertase is different in each temperature. It is mixed (partial) when the temperature at 40 C. K M 8.6 g/l, V maks µm/min decrease to 64.1 µm/min, Ki mm, α 75.1, β 3.1. The inhibition kinetic model when the temperature at 50 C was also mixed (partial). K M 21.1 g/l, V maks µm/menit decrease to µm/menit, Ki 2.873e-9 mm, α , β 232.5, while competitive (full) at 60 C with K M 3555e+6 g/l increase to 4.622e+6 g/l, V maks 1.732e+7 µm/min, Ki 11.4 mm. 5

6 SURAT PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO 4 ) adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan dosen Pembimbing Akademik, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya. Bogor, 31 Agustus 2006 Yang membuat pernyataan, Rheni Hafidiana F

7 INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO 4 ) SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh RHENI HAFIDIANA F FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 7

8 INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INHIBISI AKTIVITAS INVERTASE PADA SUKROSA DENGAN MENGGUNAKAN TEMBAGA SULFAT (CuSO 4 ) SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN Pada Departemen TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh RHENI HAFIDIANA F Dilahirkan pada tanggal 18 Juni 1984 di Boyolali Tanggal lulus : 24 Agustus 2006 Menyetujui, Bogor, September 2006 Prayoga Suryadarma, STP, MT. Pembimbing Akademik 8

9 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Boyolali pada tanggal 18 Juni Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara dari pasangan Widodo (Alm) dan Muslichah. Pada tahun 1996, penulis menyelesaikan pendidikan sekolah dasar di SDN 3 Boyolali. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah di SLTPN 1 Boyolali pada tahun Kemudian penulis melanjutkan pendidikan di SMUN 1 Boyolali dan lulus pada tahun Penulis melanjutkan pendidikan di Perguruan Tinggi Negeri, Institut Pertanian Bogor tahun 2002 melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB) di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Selama kuliah di IPB, penulis pernah menjadi asisten praktikum pada mata kuliah Laboratorium Lingkungan periode 2005/2006 dan Teknologi Minyak Atsiri dan Kosmetika periode 2005/2006. Penulis melaksanakan praktek lapang pada tahun 2005 dengan topik Penerapan Aspek Pengawasan Mutu pada Proses Produksi Biskuit Bayi di PT. Arnott s Indonesia-Bekasi, Jawa Barat. Untuk menyelesaikan tugas akhir ini, penulis melakukan penelitian yang dituangkan dalam skripsi berjudul Inhibisi Aktivitas Invertase pada Sukrosa dengan Menggunakan Tembaga Sulfat (CuSO 4 ). 9

10 KATA PENGANTAR Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan berkat, rahmat, dan hidayah serta kemudahan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Skripsi ini dibuat sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Teknologi Pertanian pada Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian. Pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada: 1. Prayoga Suryadarma, STP, MT selaku dosen pembimbing akademik yang telah banyak memberikan arahan dan bimbingan, pada saat penelitian dan dalam penyusunan skripsi ini. 2. Dr. Ir. Erliza Noor selaku dosen penguji atas masukannya untuk penyempurnaan skripsi ini. 3. Drs. Purwoko, MSi selaku dosen penguji atas masukannya untuk penyempurnaan skripsi ini. 4. Ibu, kakak dan saudara kembarku yang selalu memberikan dukungan, semangat dan doa. 5. Teman sebimbingan (Rian, Annisa, Mba Fitri, dan Pak Ikhsan) atas bantuan dan kebersamaannya. 6. Teman-teman TIN 39 dan semua pihak yang telah memberikan bantuan kepada penulis baik selama penelitian maupun semenjak menjadi mahasiswa TIN yang tidak dapat disebutkan satu per satu. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang dapat membangun dan bermanfaat demi perbaikan skripsi ini. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi pembaca. Bogor, Agustus 2006 Penulis

11 DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR... x DAFTAR ISI... xi DAFTAR TABEL... xiii DAFTAR GAMBAR... xiv DAFTAR LAMPIRAN... xvii I. PENDAHULUAN... 1 A. LATAR BELAKANG... 1 B. TUJUAN... 2 II. TINJAUAN PUSTAKA... 3 A. SUKROSA... 3 B. INVERTASE... 3 C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM... 4 D. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA Pengaruh Suhu Pengaruh ph Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan Pengaruh Inhibitor... 7 E. KINETIKA ENZIMATIK III. METODOLOGI A. ALAT B. BAHAN C. METODE PENELITIAN Tahapan Penelitian Prosedur Percobaan xi

12 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Aktivitas Invertase B. Pengaruh Konsentrasi CuSO C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor Terhadap Degradasi Sukrosa Pengaruh Konsentrasi Substrat Pengaruh Konsentrasi Enzim Pengaruh ph Pengaruh Suhu Pengaruh Lama Pemanasan D. Kinetika Inhibisi Reaksi Invertase V. KESIMPULAN DAN SARAN A. KESIMPULAN B. SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xii

13 DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Pengaruh jenis logam dan bahan kimia pada konsentrasi M terhadap aktivitas invertase... 8 Tabel 2. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 40 C Tabel 3. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 50 C Tabel 4. Parameter kinetika inhibisi invertase pada suhu 60 C xiii

14 DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase... 3 Gambar 2. Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004)... 5 Pengaruh nilai ph terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004)... 6 Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M 2+ ) dan grup sulfhidril... 9 Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988) Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = x, r 2 = Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO 4 terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi substrat terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5mg/l, lama reaksi 5 menit xiv

15 Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO mm pada konsentrasi substrat yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, ph 7, lama reaksi 5 menit Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO mm pada konsentrasi enzim yang berbeda, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, ph 7, lama reaksi 5 menit Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan nilai ph terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO mm pada nilai ph yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertasi 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO 4 pada suhu yang berbeda, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 12.5 g/l, lama reaksi 5 menit Gambar 25. Inhibisi aktivitas invertase oleh CuSO 4 pada lama pemanasan yang berbeda dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 22.5 g/l, lama reaksi 5 menit Gambar 26. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 40 C Gambar 27. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 40 C Gambar 28. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 50 C Gambar 29. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 50 C Gambar 30. Kurva Michaelis Menten invertase suhu 60 C xv

16 Gambar 31. Plot Lineweaver-Burk invertase suhu 60 C xvi

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Prosedur penelitian Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan penentuan konsentrasi CuSO Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi substrat Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi substrat yang berbeda Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh konsentrasi enzim Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada konsentrasi enzim yang berbeda Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh ph Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada ph yang berbeda Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh suhu Lampiran 10. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada suhu yang berbeda Lampiran 11. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan pengaruh lama pemanasan Lampiran 12. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan persen inhibisi pada lama pemanasan yang berbeda Lampiran 13. Data kinetika inhibisi suhu 40 C Lampiran 14. Data kinetika inhibisi suhu 50 C Lampiran 15. Data kinetika inhibisi suhu 60 C xvii

18 I. PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Sukrosa, dengan nama sistematisnya β-d-fructofuranosyl-α-dglucopyranoside termasuk kelompok disakarida nonpereduksi. Senyawa organik ini merupakan sejenis karbohidrat yang manis, putih dan termasuk bahan dasar makanan. Sumber sukrosa umumnya didapatkan dari nira, seperti nira tebu, nira kelapa, nira siwalan maupun dari bit. Kandungan sukrosa dalam masing-masing nira tersebut berbeda. Nira tebu mengandung 14-20% sukrosa, nira kelapa mengandung 15-20% sukrosa dan nira siwalan mengandung 10-15% sukrosa. Sukrosa banyak digunakan untuk berbagai keperluan dalam industri, namun kerusakan sukrosa mudah terjadi. Proses degradasi sukrosa menjadi gula invert, disebut juga gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) sering terjadi karena lamanya waktu menunggu sebelum nira tebu diproses di industri gula. Selain degradasi sukrosa, senyawa-senyawa hasil degradasi sukrosa tersebut dapat mengganggu proses kristalisasi pada industri gula (sukrosa), sehingga dapat menurunkan rendemen gula sukrosa. Astawan (2001) menyatakan bahwa pembentukan gula invert juga tidak diharapkan pada pengolahan gula semut. Jika kadar gula pereduksinya lebih dari 3 persen maka gula yang dihasilkan akan menjadi lembek dan sangat higroskopis. Kerusakan gula atau sukrosa dapat disebabkan oleh aktivitas enzim, mikroorganisme ataupun perlakuan proses (misalnya asam, suhu tinggi, dan lainnya). Invertase, merupakan salah satu enzim yang dihasilkan pada nira tebu atau hasil aktivitas ekstraseluler mikroorganisme yang turut memicu kerusakan sukrosa. Aktivitas invertase pada ekstrak nira tebu adalah unit, sedangkan aktivitas spesifiknya 2.86 unit/mg (Rahman, 2004). Upaya penghambatan perlu dilakukan untuk mengurangi kerusakan sukrosa, salah satunya dengan menurunkan aktivitas invertase yang mendegradasi sukrosa. Upaya penghambatan laju kerusakan sukrosa melalui penurunan aktivitas invertase telah dilakukan dengan perlakuan suhu, tekanan serta

19 penambahan inhibitor. Cavaille dan Didier (1996) mengkombinasikan perlakuan tekanan tinggi dengan suhu untuk menginaktivasi invertase, sedangkan Causette et al. (1998) melakukan inaktivasi enzim dengan menggunakan gelembung gas inert. Akan tetapi, perlakuan suhu dan tekanan yang tinggi akan mempengaruhi kualitas produk (sukrosa) akibat terjadinya reaksi lain yang tidak diinginkan (lateral reaction). Inhibitor invertase juga ditemukan di dalam umbi kentang (Ewing et al., 1977 dan Pressey, 1966), tembakau, dan tomat (Pressey,1994 dan Weil et al., 1994 dalam Greiner et al., 1998). Inhibitor dari bahan alami tersebut juga memiliki kelemahan, yaitu masih terdapat bahan lain selain inhibitor, bahkan mengandung invertase. Jenis inhibitor lain yang dapat menghambat aktivitas invertase adalah beberapa jenis garam logam, terutama HgCl 2, FeCl 2, CuCl 2, dan CdCl 2, yang dapat menurunkan aktivitas hingga 45-99% (Rahman et al., 2004). Terdapat garam logam lain, seperti CuSO 4 yang juga tersusun dari kation logam bivalen. Penggunaan garam logam ini memerlukan kondisi tertentu agar dihasilkan kinerja inhibisi invertase yang optimal. Perubahan faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim, seperti konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu dan lama pemanasan perlu dilakukan pada saat garam logam CuSO 4 ditambahkan. Perlakuan tersebut diharapkan dapat menghasilkan profil inhibisi aktivitas invertase dalam mendegradasi sukrosa serta diperoleh model kinetika inhibisi yang penting untuk keperluan rekayasa proses. B. TUJUAN Adapun tujuan penelitian ini antara lain untuk menentukan: 1. Pengaruh perubahan ph, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, suhu inkubasi dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO 4 terhadap degradasi sukrosa 2. Parameter kinetika (K M dan V maks ) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO 4 2

20 II. TINJAUAN PUSTAKA A. SUKROSA Sukrosa (glucose-1,2 fructose) merupakan pemanis yang banyak dikonsumsi dalam kehidupan manusia. Salah satu sumber sukrosa terpenting adalah tebu karena mengandung sukrosa hingga 20% (Glazer dan Nikaido, 1995 dalam Filho 1999). Sukrosa, dikenal sebagai gula meja (table sugar), merupakan disakarida yang terbentuk dari satu molekul α-d-glukosa dan satu molekul β-d-fruktosa yang dihubungkan oleh ikatan α-1,2-glikosidik (Rahman et al., 2004). Degradasi sukrosa dapat terjadi melalui hidrolisis asam atau secara enzimatis oleh invertase (Monsan et al., 1984 dalam Filho et al., 1999). Degradasi secara enzimatis terjadi ketika ikatan α-1,2-glikosidik dihidrolisis oleh enzim invertase (D-fructofuranosidase, EC ) atau sucrose synthase (UDP glucose: D-fructose 2-D-glucosyltransferase, EC ). Hidrolisis sukrosa menghasilkan campuran glukosa dan fruktosa yang disebut dengan gula invert (invert sugar) (Rahman et al., 2004). Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase (juga disebut sebagai sucrase atau saccharose) dapat dilihat pada Gambar 1. H Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa oleh invertase B. INVERTASE Sistem tatanama untuk invertase adalah beta-fructofuranosidase (EC ), menunjukkan bahwa reaksi dikatalisasi oleh enzim ini adalah reaksi

21 hidrolisis (Wang, 2002). Invertase terdapat dalam jumlah yang beragam pada tanaman maupun hewan dengan varietas yang luas. Sumber utama invertase berasal dari ragi (yeast) dan fungi lainnya. Reed (1966) dalam Pancoast dan Junk (1980) menyatakan bahwa ragi Saccharomyces cerevisiae dan S. carlsbergensis merupakan sumber utama penghasil invertase untuk aplikasi industri. Aspergillus orizae dan A. Niger adalah fungi yang juga merupakan sumber invertase. Tanaman penghasil enzim ini antara lain tebu (Rahman et al., 2004), buah mangga (Rahman et al., 2001), buah anggur (Nakanishi et al., 1990), buah tomat (Konno et al., 1993 dalam Rahman et al., 2001), padi (Isla et al., 1995) dan umbi kentang (Pressey et al., 1966). Berbeda dengan sebagian besar enzim, invertase memiliki aktivitas yang relatif tinggi pada kisaran ph yang luas antara 3.5 sampai 5.5, dengan aktivitas optimum pada ph 4.5. Aktivitas maksimum dicapai pada suhu 55 C. Nilai Michaelis-Menten untuk jenis enzim yang berbeda bervariasi, tetapi kebanyakan enzim memiliki nilai K M antara 2 mm 5 mm (Wang, 2002). C. AKTIVITAS DAN STABILITAS ENZIM Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mikromol (µmol; 10-6 mol) substrat yang bereaksi atau produk yang dikatalisis setiap menit (Rodwell, 1981). Aktivitas enzim dapat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, ph, dan suhu. Setiap enzim berfungsi optimal pada suhu, ph dan konsentrasi substrat tertentu. Konsentrasi substrat yang rendah menyebabkan daerah aktif pada enzim tidak semuanya terikat pada substrat. Terdapat suhu optimal dimana reaksi berlangsung sangat cepat. Ketika suhu di atas suhu optimal, kecepatan reaksi menurun tajam karena enzim sebagai protein akan terdenaturasi, sedangkan pada suhu terlalu rendah, beberapa enzim tidak dapat bekerja. Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh ph karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi ph (Pelczar dan Chan, 1986). Enzim merupakan salah satu jenis protein globular. Stabilitas dan aktivitas enzim ditentukan oleh konformasi tiga dimensinya yang dipengaruhi 4

22 oleh struktur tertier protein. Terdapat empat jenis interaksi yang menstabilkan struktur tersebut pada suhu, ph dan konsentrasi ion normal, antara lain ikatan hidrogen, gaya tarik ionik, interaksi hidrofobik dan jembatan kovalen. (Lehninger, 1988). D. FAKTOR FAKTOR YANG MEMPENGARUHI LAJU DEGRADASI SUKROSA Laju degradasi sukrosa dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain suhu, ph, lama pemanasan, konsentrasi substrat dan konsentrasi enzim. Laju degradasi sukrosa dapat diperlambat atau bahkan dihambat dengan penambahan inhibitor. 1. Pengaruh Suhu Peningkatan suhu pada reaksi enzim memiliki dua pengaruh yang tidak seimbang. Pengaruh tersebut adalah peningkatan laju reaksi dan di sisi lain dapat menyebabkan inaktivasi enzim (Stauffer, 1989). Aktivitas enzim invertase meningkat secara perlahan dengan kenaikan suhu. Suhu maksimum aktivitas invertase adalah 60 C, peningkatan suhu lebih lanjut menyebabkan penurunan laju degradasi sukrosa (Rahman et al., 2004). Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase di dalam tebu dapat dilihat pada Gambar 2. Aktivitas relatif (%) suhu ( o C) Gambar 2. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) 2. Pengaruh ph Invertase memberikan aktivitas maksimum pada ph 7.2. Aktivitas turun perlahan pada ph asam, tetapi turun secara cepat pada ph basa. 5

23 Observasi ini menunjukkan bahwa enzim relatif stabil pada kisaran ph asam sampai ph netral (Rahman et al., 2004). Nilai ph optimum invertase dari benih padi adalah 7.0 (Chungliang et al. dalam Rahman et al., 2004). Gambar 3 menunjukkan pengaruh ph terhadap aktivitas invertase pada tebu (Rahman et al., 2004). Gambar 3. Pengaruh nilai ph terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) Stauffer (1989) menyatakan bahwa perubahan pada laju reaksi enzim oleh ph mungkin dapat disebabkan oleh tiga faktor, yakni: a. Protonasi sisi aktif rantai asam amino pada kompleks enzimsubstrat (ES) berubah, menghasilkan perubahan kemampuan ES dalam menghasilkan produk. b. Perubahan muatan ion pada molekul substrat atau sisi aktif enzim yang dapat mengubah kecenderungan dari dua molekul tersebut untuk membentuk kompleks ES. c. Perubahan ph dari netral dapat melemahkan stabilitas protein, mempercepat denaturasi enzim yang bersifat irreversible. 3. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim Invertase dapat mengkatalisis sukrosa pada konsentrasi di atas 59%wt/vol. Peningkatan konsentrasi sukrosa lebih lanjut sampai 80%wt/vol menurunkan aktivitas enzim secara signifikan, mungkin disebabkan oleh konsentrasi air rendah, inhibisi oleh substrat atau agregasi substrat (Somiari dan Bielecki, 1995 dalam Filho et al., 1999). Brown pada tahun 1902 melakukan penelitian tentang invertase, menyatakan bahwa jika konsentrasi sukrosa lebih tinggi daripada 6

24 konsentrasi enzim, kecepatan reaksi menjadi tidak tergantung pada konsentrasi sukrosa (Pancoast, 1980). Aktivitas enzimatik akan menurun pada konsentrasi substrat yang tinggi dan cenderung membentuk asimtot. Jenis penghambatan ini akan membentuk kompleks (dead end complex), satu sisi molekul substrat terikat pada enzim dan molekul substrat lain terikat pada sisi lain (sekunder) enzim (Suryani dan Mangunwidjaya, 2002). 4. Pengaruh Perubahan Kondisi Lingkungan Inaktivasi enzim dan mikroorganisme dapat dilakukan dengan perlakuan suhu yang tinggi. Akan tetapi perlakuan suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan perubahan produk, sehingga kualitasnya menurun. Metode lain yang dapat digunakan untuk menurunkan aktivitas enzim dan mikroorganisme tanpa merusak produk yang diinginkan adalah dengan cara pemberian gelembung gas inert. Pemberian gelembung gas inert nitrogen mampu menurunkan aktivitas enzim (Causette et al., 1998). 5. Pengaruh Inhibitor Banyak bahan yang dapat mengubah aktivitas suatu enzim dengan menggabungkannya dalam suatu jalur yang mempengaruhi ikatan substrat. Bahan-bahan yang mereduksi aktivitas suatu enzim dengan cara ini dikenal sebagai inhibitor. Inhibitor terbagi menjadi dua jenis, yakni inhibitor reversible yang membentuk kompleks dinamik dengan enzim dan inhibitor irreversible yang dikenal dengan racun pengkatalis (contohnya beberapa logam berat, seperti merkuri, Hg 2+ ). Inhibitor mengikat molekul enzim dan menurunkan aktivitasnya (Flickinger dan Drew, 1999). Stauffer (1989) juga membagi inhibitor menjadi 3 golongan berdasarkan affinitasnya terhadap molekul enzim sebagai berikut: a. Inhibitor beraffinitas rendah Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 1 M hingga 10 6 M. Inhibitor ini sering menyerupai substrat dengan kereaktifan yang biasa. 7

25 b. Inhibitor beraffinitas tinggi Molekul inhibitor ini memiliki konstanta affinitas antara 10 6 M hingga M. Inhibitor ini menjadi transisi dari kompleks enzim-substrat menjadi kompleks enzim-produk atau sebagai molekul yang mengikat kuat pada sisi aktif enzim. c. Inhibitor irreversible Molekul inhibitor ini membentuk ikatan kovalen dengan molekul pada sisi aktif enzim. Ikatan yang dibentuk bersifat stabil. Reaksi lebih jauh lagi dari enzim dengan inhibitor ini (inhibitor berlebih) menyebabkan enzim menjadi tidak aktif. Penambahan garam logam dan senyawa kimia lainnya dapat menyebabkan peningkatan atau penurunan aktivitas enzim. Peningkatan dan penurunan aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh jenis garam logam ataupun senyawa kimia yang ditambahkan. Pengaruh penambahan beberapa jenis garam logam dan senyawa kimia lainnya terhadap aktivitas enzim dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Pengaruh jenis garam logam dan bahan kimia pada konsentrasi M terhadap aktivitas invertase No. Garam/bahan kimia Aktivitas relatif (%) 1 Tanpa bahan tambahan MgCl KCl NaCl MnCl CaCl HgCl CuCl FeCl ZnCl CdCl AgNO AlCl EDTA Glukosa Asam asetat Sumber: Rahman et al. (2004) 8

26 Hampir semua ion logam selalu berinteraksi dengan kompleks protein secara cepat. Interaksi kompleks antara ion logam dengan protein ada dua bentuk: 1. Metaloenzim Ikatan ini merupakan subkelas dari metaloprotein. Protein berikatan kuat dengan ion logam sehingga dianggap sebagai ikatan yang sangat stabil dan lama. Ion logam menjadi bagian dari struktur protein dan hanya dapat dilepas dalam keadaan tertentu. 2. Metal protein Sistem ikatan ini memungkinkan ion logam mudah saling bertukar dengan protein lain (reversible). Laju pertukaran ion logam dengan kondisi larutan lingkungannya sangat mudah. Ion logam sulit dalam menempati sisi protein yang tepat karena ion logam ini bersifat sangat labil. Kekuatan ikatan ion logam dengan protein tergantung pada muatan kation yang mengikatnya. Semakin tinggi muatan kation dari logam maka semakin kuat ikatannya dengan protein, sehingga ikatan tersebut lebih stabil dan konstan (Darmono, 1995). Hochster dan Quastel (1963) menyatakan, ikatan ion logam bivalen dengan grup sulfhidril yang terdapat pada enzim kemungkinan terjadi sebagai berikut: E dll S E-SH E-S - + H + E-S -M + M 2+ E-SH E-SH E-S - + H + Gambar 4. Ikatan ion logam bivalen (M 2+ ) dan grup sulfhidril Keterangan: E-SH = enzim yang memiliki grup sulfhidril H + M 2+ = ion H + yang terlepas = ion logam bivalen 9

27 E. KINETIKA ENZIMATIK Enzim merupakan katalisator sejati. Molekul ini dapat meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa adanya enzim akan berlangsung lambat. Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim dijaga konstan (Lehninger, 1988). Setiap enzim memiliki sifat yang khas, dinyatakan dalam suatu tetapan yaitu K M (tetapan Michaelis-Menten). Hampir semua enzim memiliki kurva kecepatan reaksi dengan bentuk umum yang hampir sama yaitu hiperbola. Oleh sebab itu, Michaelis-Menten mendefinisikan suatu tetapan untuk menyatakan hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. K M didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Persamaan Michaelis- Menten adalah: V maks [S] V 0 = K M + [S] Keterangan: V 0 V maks K M [S] = kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S] = kecepatan maksimum = tetapan Michaelis-Menten enzim pada substrat tertentu = konsentrasi substrat Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (Lehninger, 1988) Nilai K M dan V maks sulit untuk ditentukan secara tepat dari grafik sederhana yang ditunjukkan pada Gambar 5, karena V maks hanya diduga dan 10

28 tidak dapat diketahui nilai yang sebenarnya. Nilai K M yang lebih tepat dapat diperoleh dengan memetakan data yang sama dengan cara yang berbeda, yakni pemetaan kebalikan-ganda, didapat dari transformasi aljabar persamaan Michaelis-Menten. Hasil transformasi persamaan Michaelis-Menten dikenal dengan persamaan Lineweaver-Burk. 1 K M 1 1 = + V o V maks [S] V maks Selain dapat menentukan V maks secara lebih tepat, persamaan ini bermanfaat dalam menganalisa penghambatan enzim (Lehninger, 1988). Persamaan Lineaweaver-Burk menghasilkan kurva yang ditunjukkan pada Gambar 6. Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk Kinetika inhibisi enzim menyangkut penentuan fungsi laju reaksi terhadap konsentrasi substrat dengan inhibitor pada berbagai konsentrasi. Kurva Lineweaver-Burk memungkinkan untuk menentukan jenis inhibisi yang bersifat reversible, antara lain sebagai berikut. 1. Inhibisi Kompetitif Inhibitor pada model inhibisi ini bersaing dengan substrat untuk memasuki sisi aktif enzim. Struktur kimia inhibitor umumnya menyerupai substrat. Oleh sebab itu, inhibitor tersebut dapat berikatan secara reversible dengan enzim (Rodwell, 2000). Mekanisme inhibisi kompetitif dapat dilihat pada Gambar 7. 11

29 ±I EI (inaktif) E ±S ES (aktif) E + P Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif Penyajian garis lurus pada kurva Lineweaver-Burk memotong sumbu ordinat pada titik yang sama. V maks tidak dipengaruhi oleh inhibitor (Suryani dan Mangunwidjaja, 2002). Kurva Lineweaver-Burk untuk model inhibisi kompetitif ditunjukkan pada Gambar 8. Ditambah inhibitor 1/V 1 Tanpa inhibitor -1/K M -1/K M 1/V maks 0 1/[S] Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif 2. Inhibisi Nonkompetitif Model inhibisi nonkompetitif tidak menunjukkan adanya persaingan antara inhibitor dengan substrat. Struktur inhibitor biasanya tidak atau sedikit menyerupai struktur substrat. Inhibitor nonkompetitif menurunkan kecepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian sejumlah enzim (V maks yang lebih rendah), tetapi biasanya tidak mempengaruhi nilai K M, ditunjukkan oleh kurva Lineweaver-Burk pada Gambar 10. Mekanisme reaksi inhibisi nonkompetitif dapat dilihat pada Gambar 9. 12

30 E ±I ±S EI ES ±S EIS E + P Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif 1/V 1 Ditambah inhibitor Tanpa inhibitor -1/V maks -1/K M 1/V maks 0 1/[S] Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif 3. Inhibisi Unkompetitif Inhibisi ini terjadi jika kompleks EI hilang, tetapi kompleks EIS terbentuk. Inhibitor mengikat langsung pada kompleks enzim-substrat (ES), bukan enzim bebas (Flickinger dan Drew, 1999). Mekanisme inhibisi unkompetitif ditunjukkan pada Gambar 11. E ±S ±I ES EIS E + P Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif 13

31 Inhibitor yang bersifat unkompetitif akan mempengaruhi fungsi enzim, tetapi tidak terhadap ikatannya dengan substrat. Plot Lineweaver- Burk untuk inhibisi unkompetitif adalah linier dengan kemiringan atau slope K M /V maks seperti pada reaksi tanpa inhibitor, dapat dilihat pada Gambar 12 (Simanjutak dan Silalahi, 2003). Ditambah inhibitor 1/V 1 Tanpa inhibitor -1/V maks -1/K M 1/V maks 0 1/[S] Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif 14

32 III. METODOLOGI A. ALAT Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas (pipet tetes, corong, tabung reaksi); peralatan ukur (pipet mikro, pipet volumetri, labu takar, termometer, spektrofotometer, stopwatch dan timbangan); serta peralatan pendukung (water bath dan vortex). B. BAHAN Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sukrosa, invertase (Sigma-Aldrich 19253: ph 4.5, 55 C, 355 units/mg solid), dan larutan CuSO 4. Sedangkan bahan yang digunakan untuk analisa adalah NaOH 0.1 N, HCl 0.1 N, indikator PP, glukosa, fruktosa, buffer ph 3-11, pereaksi DNS (dinitro salicylic acid) dan aquades. C. METODE PENELITIAN Metode penelitian ini dibagi menjadi tahapan penelitian dan prosedur percobaan. Tahapan penelitian menjelaskan tentang langkah-langkah yang harus dilalui untuk mencapai tujuan penelitian, sedangkan prosedur percobaan merupakan urutan kegiatan dan tatacara yang secara teknis dikerjakan dalam setiap tahapan penelitian. 1. Tahapan Penelitian Penelitian dilakukan dalam empat tahap, yaitu (1) Penentuan aktivitas invertase, (2) Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO 4, (3) Penentuan hubungan perubahan faktor konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu dan lama pemanasan dengan adanya penambahan CuSO 4 terhadap degradasi sukrosa, (4) Penentuan parameter kinetika (K M dan V maks ) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO 4. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 13.

33 Mulai Penentuan aktivitas invertase Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO 4 Penentuan pengaruh perubahan faktor dengan adanya penambahan CuSO 4 terhadap degradasi sukrosa Penentuan parameter kinetika (K M dan V maks ) laju degradasi sukrosa dengan adanya penambahan CuSO 4 Selesai Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian a. Penentuan aktivitas invertase Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas invertase, yaitu banyaknya invertase yang dapat membebaskan 1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan adalah kondisi optimum invertase, yaitu pada suhu 55 C, di dalam larutan buffer asetat ph 4.5. Slope yang diperoleh dari gula pereduksi yang dihasilkan pada setiap konsentrasi yang diujikan merupakan besarnya aktivitas enzim. b. Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO 4 CuSO 4 dengan konsentrasi yang berbeda diujikan pada reaksi invertase dengan sukrosa. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari kontrol (perlakuan invertase tanpa CuSO 4 ) menunjukkan adanya inhibisi, sebaliknya jika lebih tinggi dari kontrol menunjukkan aktivasi. Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan. 16

34 c. Penentuan pengaruh hubungan faktor dengan adanya penambahan CuSO 4 terhadap degradasi sukrosa Uji karakterisasi invertase yang dilakukan antara lain pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu dan lama pemanasan dengan ditambahkan CuSO 4. Pengaruh yang diidentifikasi adalah adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan. Inhibisi invertase diukur berdasarkan perbandingan dengan perlakuan tanpa CuSO 4, dinyatakan dalam bentuk persen. d. Penentuan parameter kinetika laju degradasi (K M dan V maks ) sukrosa dengan adanya penambahan CuSO 4 Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga suhu yang berbeda dan ph tertentu yang optimum bagi inhibisi invertase. Model kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika (K M dan V maks ) yang diperoleh dari plot Lineweaver- Burk. Nilai K M diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu x, sedangkan nilai V maks diperoleh dari perpotongan garis linier dengan sumbu y. 2. Prosedur Percobaan Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut. a. Penentuan aktivitas invertase Larutan invertase 0.01 g/l dan larutan sukrosa 50 g/l disiapkan pada tabung reaksi yang terpisah. Masing-masing tabung reaksi kemudian diinkubasi di dalam water bath suhu 55 C sehingga suhu tersebut dicapai oleh larutan di dalam tabung reaksi. Selanjutnya sukrosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi invertase dan mulai diukur waktu reaksi (t = 0). Reaksi dihentikan pada masing-masing waktu yang diujikan, yaitu 0, 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 (detik), dengan memasukkan 2 ml pereaksi DNS. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95 C. Setelah 17

35 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. b. Penentuan konsentrasi inhibitor Larutan CuSO 4 dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 mm mm. Masing-masing larutan CuSO 4 dalam berbagai konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dan divortex. Selanjutnya ditambahkan 1 ml invertase 0.01 g/l pada masing-masing tabung reaksi (t = 0). Pada saat t = 5 menit, reaksi dihentikan dengan perekasi DNS. Prosedur untuk menghentikan reaksi mengikuti prosedur sebelumnya pada penentuan aktivitas. c. Penentuan pengaruh perubahan faktor Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan dengan maupun tanpa adanya penambahan inhibitor. Prosedur yang dilakukan pada perlakuan tanpa inhibitor sama halnya dengan pengujian pada karakterisasi invertase dengan inhibitor, hanya tidak ditambahkan larutan CuSO 4. Total volume larutan dalam tiap tabung reaksi tetap sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah adalah aquades dan buffer. 1. Pengaruh konsentrasi enzim Larutan invertase 0.01 g/l disiapkan pada berbagai konsentrasi sebanyak ml dan ditambahkan larutan buffer ph 7 hingga volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan CuSO mm sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung reaksi. Selanjutnya larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 1 ml dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung waktunya (t = 0 menit). Pada waktu t = 5 menit, dimasukkan 2 ml pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam water bath pada suhu 95 C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. 18

36 2. Pengaruh konsentrasi substrat Larutan CuSO mm sebanyak 0.1 ml dimasukkan pada masing-masing tabung reaksi yang berisi larutan sukrosa 50 g/l dalam konsentrasi yang berbeda. Kemudian aquades ditambahkan hingga volume campuran mencapai 2.0 ml. Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke masing-masing tabung reaksi (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya. 3. Pengaruh ph Invertase 0.01g/l sebanyak 1.0 ml dilarutkan dengan menggunakan buffer ph yang bervariasi (ph 3-11) pada tabung reaksi. Selanjutnya masing-masing tabung reaksi ditambahkan larutan CuSO mm sebanyak 0.1 ml dan 0.9 ml larutan sukrosa 50 g/l (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya. 4. Pengaruh suhu Penangas air mulai suhu 0-90 o C disiapkan dengan interval suhu 10 o C. Pada setiap kelipatan suhu 10 o C tersebut, diuji aktivitas invertase. Larutan CuSO mm sebanyak 0.1 ml, 0.4 ml air dan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalam setiap tabung untuk setiap kelipatan suhu 10 o C. Tabung reaksi selanjutnya dimasukkan ke dalam penangas air pada rentang suhu tersebut dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml ke dalam masing-masing tabung reaksi (t = 0 menit) pada suhu inkubasi. Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya. 5. Pengaruh lama pemanasan Larutan invertase 0.01 g/l sebanyak 1.0 ml dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan dipanaskan dengan waktu yang bervariasi dari 0-5 (menit). Setelah waktu yang diperlukan dicapai, tabung reaksi dikeluarkan dari water bath dan didinginkan. 19

37 Setelah itu larutan CuSO mm sebanyak 0.1 ml dan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dimasukkan ke dalamnya (t = 0 menit). Pengukuran reaksi hidrolisis mengikuti prosedur sebelumnya. d. Penentuan parameter kinetika Kondisi inhibisi invertase oleh CuSO 4 yang optimum dipilih (suhu dan ph) yang kemudian pada selang konsentrasi substrat tertentu diuji aktivitasnya dalam menghidrolisis sukrosa.. Hasil yang diperoleh kemudian diplotkan pada kurva kinetika (Lineweaver-Burk), dan dihitung parameter kinetikanya (K M dan V maks ) serta dibandingkan antara perlakuan tanpa CuSO 4 dan dengan penambahan CuSO 4. Nilai K M dan V maks dapat diperoleh dari persamaan linier plot kurva Lineweaver-Burk. Slope yang diperoleh merupakan K M /V maks, sedangkan intersep menunjukkan 1/V maks. Bentuk kurva Lineweaver- Burk yang diperoleh menunjukkan model kinetika ihibisi. Penentuan model kinetika menggunakan alat bantu program SigmaPlot 2004 for Windows Version Program ini menentukan model kinetika inhibisi yang paling tepat berdasarkan nilai r 2 tertinggi. 20

38 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Kemampuan hidrolisis sukrosa oleh invertase dilakukan dengan mengukur aktivitas enzim tersebut, sedangkan kemampuan inhibisi garam logam CuSO 4 dilihat pada setiap perubahan faktor yang berpengaruh (konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu dan lama pemanasan) terhadap aktivitas enzim serta perubahan parameter kinetika (K M dan V maks ) inhibisi degradasi sukrosa. A. Aktivitas Invertase Penentuan aktivitas invertase penting dilakukan untuk mengetahui seberapa besar perubahan mikromol sukrosa menjadi gula pereduksi setiap menit reaksi. Slope yang diperoleh dari persamaan garis linier adalah , yang berarti bahwa invertase mampu menghidrolisis sukrosa µm menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu detik atau perubahan µmol sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dalam satu menit. Aktivitas invertase digambarkan dalam bentuk kurva pada Gambar konsentrasi gula pereduksi (um) lama reaksi (detik) Gambar 14. Kurva aktivitas invertase berdasarkan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi invertase 5 mg/l, konsentrasi sukrosa 25 g/l. Persamaan garis linier y = x, r 2 =

39 B. Pengaruh Konsentrasi CuSO 4 Penentuan pengaruh konsentrasi CuSO 4 sebagai inhibitor dilakukan berdasarkan uji daya inhibisi CuSO 4 terhadap aktivitas invertase. Adanya inhibisi invertase ditunjukkan dengan menurunnya gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis sukrosa oleh invertase. Analisis sidik ragam menunjukkan bahwa konsentrasi yang diujikan memberikan pengaruh yang nyata terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Konsentrasi gula pereduksi tertinggi diperoleh dari penambahan larutan CuSO mm sebesar µm, sedangkan konsentrasi gula pereduksi terkecil ditunjukkan oleh penambahan larutan CuSO mm sebesar 1052 µm. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO 4 terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar konsentrasi gula pereduksi (um) konsentrasi CuSO 4 (mm) Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi CuSO 4 terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan, dengan konsentrasi sukrosa 25 g/l, konsentrasi invertase 5 mg/l, lama reaksi 5 menit Hasil uji daya inhibisi menunjukkan bahwa tidak semua konsentrasi CuSO 4 yang diujikan menunjukkan adanya penghambatan aktivitas invertase. Gula pereduksi meningkat signifikan dengan penambahan larutan CuSO mm. Hal ini menunjukkan bahwa CuSO 4 pada konsentrasi yang rendah tidak memberikan pengaruh inhibisi terhadap aktivitas invertase. CuSO 4 mempunyai peranan sebagai aktivator invertase pada konsentrasi yang relatif 22

40 kecil. Perubahan muatan pada enzim akibat penambahan CuSO 4 menyebabkan enzim mudah dalam mengikat substrat. Hal ini sesuai dengan teori bahwa logam yang ditambahkan dalam bentuk garam organik memberikan kestabilan enzim dengan cara menetralkan kelebihan muatan elektrostatik yang melindungi molekul enzim sehingga konformasi enzim dapat dipertahankan (Monsan dan Combess, 1984). Kation seperti Cu (II) kemungkinan terlibat langsung dalam proses katalisis enzim, yaitu dalam pengikatan substrat ke sisi aktif enzim, dalam menjaga konformasi enzim dan kestabilan substrat (Whitaker, 1996). Berdasarkan Gambar 15, besarnya penghambatan setelah aktivitas invertase mencapai maksimum meningkat sedikit demi sedikit hingga akhirnya mengalami inhibisi pada konsentrasi CuSO mm. Kemampuan aktivasi enzim menurun dengan semakin tingginya konsentrasi CuSO 4. Besarnya inhibisi ini berbeda nyata dengan kontrol berdasarkan uji lanjut Duncan, dapat dilihat pada Lampiran 2. Gula pereduksi yang dihasilkan pada konsentrasi CuSO mm adalah µm, sedangkan invertase tanpa CuSO 4 (kontrol) menghasilkan gula pereduksi µm, sehingga inhibisi yang diberikan sebesar 9.96 %. Inhibisi terhadap aktivitas invertase disebabkan oleh penghambatan substrat untuk memasuki daerah katalitik enzim dimana kation logam Cu (II) terikat pada sisi aktif enzim. Inhibisi dapat terjadi pada sisi aktif enzim maupun sisi sekunder enzim. Jika inhibitor terikat pada sisi aktif enzim, substrat tidak dapat membentuk kompleks dengan enzim, sehingga produk tidak akan terbentuk. Inhibisi juga dapat terjadi selain pada sisi aktif enzim, yaitu pada sisi sekunder enzim. Pengikatan inhibitor pada sisi sekunder enzim menyebabkan perubahan konformasi enzim, sehingga affinitas enzim pada substrat berkurang. Inhibisi pada fungsi katalitik enzim dapat terjadi pada residu asam amino, yang dapat terletak pada sisi aktif enzim. Hal ini sesuai dengan teori bahwa grup sulfhidril terdapat pada sisi aktif maupun di dekat sisi aktif invertase yang penting dalam menjalankan fungsi katalitik enzim tersebut (Sturm, 1999 dalam Hsiao et al., 2001). 23