PENGGUNAAN AKAR KAWAO (Millettia sericea sp) SEBAGAI INHIBITOR AKTIVITAS INVERTASE. Oleh RIAN WIDIPRATOMO F

Transkripsi

1 PENGGUNAAN AKAR KAWAO (Millettia sericea sp) SEBAGAI INHIBITOR AKTIVITAS INVERTASE Oleh RIAN WIDIPRATOMO F DEPARTEMEN TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR

2 PENGGUNAAN AKAR KAWAO (Millettia sericea sp) SEBAGAI INHIBITOR AKTIVITAS INVERTASE SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Teknologi Industri Pertanian Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh RIAN WIDIPRATOMO F FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR ii

3 FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR PENGGUNAAN AKAR KAWAO (Millettia sericea sp) SEBAGAI INHIBITOR AKTIVITAS INVERTASE SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Teknologi Industri Pertanian Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor Oleh RIAN WIDIPRATOMO F Dilahirkan pada tanggal 15 Juli 1983 di Bogor Tanggal Lulus : 24 Agustus 2006 Disetujui Dosen Pembimbing, Bogor, Agustus 2006 Prayoga Suryadarma, STP, MT NIP iii

4 The Use of Kawao (Millettia sericea sp) root as Inhibitor on Invertase Activity Summary The hydrolysis of sucrose, especially the one that occurred in cane sugar industry, is a process of sugar degradation which needs to be avoided in sugar industry. However, the presence of invert sugar as a result of sucrose hydrolysis in mixtures causes the crystallization process inhibited and leads to decrease of sugar yield. On the other hand, the presence of free hemi acetal group in invert sugar is not only oxidize the structure of invert sugar into carboxylic acid, but also causes the decreasing in ph solution. Decreasing hydrogen ion concentration will, progressively, increase the sucrose degradation. Due to the related state, an effort is needed to avoid or at least to reduce the sucrose degradation, so the yield and the productivity of cane sugar industry can be improved. The use of natural compound as inhibitor of invertase is needed as being a convenient way than pressure and temperature treatment and the using of heavy metal ions as an inhibitor. In this research, a kawao (Millettia sencea sp) root was used as an inhibitor which could influence the invertase activity. The presence of kawao root will inhibit the invertase activity and reduce forming of invert sugar. The objective of this research were, (i) to determine the correlation between of substrate concentration, enzyme concentration, ph value, incubation temperature and heat treatment with the addition of the kawao root concerning to sucrose degradation; (ii) to determine the inhibition kinetics parameter (K M and V max ) of the rate of sucrose degradation with the presence of kawao root. The whole research was using reducing sugar measurement methods as a result of sucrose hydrolysis using DNS (dinitrosalicylate). The influence in each of factors were determined by analysis of variance (ANOVA) and Duncan test. The most suitable model and parameter of inhibition kinetic were determined by using SigmaPlot software. Kawao root concentration, substrate concentration, enzyme concentration, ph value, incubation temperature and heat treatment are significantly influence reducing sugar as incubation product. Extract of kawao root, which was used as invertase inhibitor, showing a good result at concentration 5% (v/v). Increasment of reducing sugar occurred by the increasing of the enzyme concentration, and the inhibition caused by kawao root addition was started at 1.65 mg/l of enzyme concentration. Reducing sugar was also increased with the increasing of substrate concentration, with or without the presence of kawao root. Inhibition was started approximately at 7.5 g/l of substrate concentration. In ph factor, as the effect of kawao root addition, the maximum activity of invertase is reached on ph 4 and optimum temperature were changing to 60 o C. The inhibition was activated in the range of ph between ph 4-7 and temperature between 0-60 o C. The activity of invertase was only established until 10 seconds heating, then it would be decreased caused by the denaturation, it also happened in the process with the iv

5 present of kawao root. But for the first 30 seconds the kawao root was still giving a good response of inhibition. The kinetic inhibition of sucrose degradation rate by kawao that has been conducted at ph 7 and three temperature treatment (30 o C, 40 o C, 50 o C) resulting a different value of inhibition kinetics parameter (K M and V max ). The sucrose degradation was getting faster due to the increasing temperature, but the presence of kawao root was still giving a good response of inhibition. The inhibition kinetics model of invertase has had no differences in each temperature. The best fit model was uncompetitive (partial) for all the temperature treatment. At the temperature of 30 o C the value of inhibition kinetics parameters were K M g/l; K M g/l; V max µm/min; V max µm/min; Ki g/l; and β At the temperature of 40 o C the value of inhibition kinetics parameters were K M g/l; K M g/l; V max µm/min; V max µm/min; Ki 0.01 g/l; and β At the temperature of 50 o C the value of inhibition kinetics parameters were K M g/l; K M g/l; V max µm/min; V max µm/min; Ki g/l; and β v

6 Penggunaan Akar Kawao (Millettia sericea sp) sebagai Inhibitor Aktivitas Invertase Ringkasan Hidrolisis sukrosa terutama yang terjadi pada industri gula tebu merupakan suatu proses kerusakan gula yang perlu dihindari pada produksi gula. Pembentukan gula invert hasil hidrolisis akan menghambat proses kristalisasi sukrosa dan mengurangi rendemen gula yang dihasilkan. Selain itu, terdapatnya gugus hemiasetal bebas pada gula pereduksi memicu terjadinya reaksi oksidasi. Reaksi tersebut menyebabkan struktur gula pereduksi teroksidasi menjadi asam karboksilat dan mengakibatkan ph larutan menjadi asam serta semakin memicu kerusakan sukrosa lebih lanjut. Untuk itu diperlukan suatu upaya yang dapat dilakukan agar kerusakan sukrosa semacam ini dapat dihindari atau minimal dapat dihambat sehingga nilai rendemen dan produktivitas industri gula dapat ditingkatkan. Penggunaan bahan alami dalam reaksi inhibisi invertase perlu dilakukan untuk menutupi kelemahan yang terdapat pada perlakuan tekanan dan suhu serta penggunaan logam berat sebagai inhibitor. Dalam penelitian ini, digunakan akar kawao (Millettia sericea sp) sebagai bahan inhibitor yang mampu mempengaruhi aktivitas invertase. Penambahan akar kawao mampu mencegah terbentuknya gula pereduksi yang sulit untuk dikristalkan, karena dapat menghambat aktivitas invertase dan juga sebagai anti mikroba penghasil invertase. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui hubungan perubahan konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu inkubasi dan lama pemanasan akibat penambahan ekstrak kawao pada laju degradasi sukrosa. Selain itu juga untuk menentukan parameter kinetika inhibisi laju degradasi (K M dan V maks ) sukrosa akibat penambahan ekstrak kawao. Pada penelitian ini digunakan metode pengukuran gula pereduksi sebagai hasil dari hidrolisis sukrosa menggunakan DNS. Setiap perubahan faktor dilakukan uji ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan. Model inhibisi yang paling sesuai dan nilai parameter kinetikanya ditentukan dengan menggunakan perangkat lunak SigmaPlot. Perubahan faktor konsentrasi inhibitor (kawao), konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu inkubasi dan lama pemanasan berpengaruh nyata terhadap aktivitas invertase berdasarkan gula pereduksi yang dihasilkan. Ekstrak kawao yang digunakan sebagai inhibitor invertase memberikan hasil yang baik pada konsentrasi 5% (v/v). Peningkatan gula pereduksi terjadi seiring dengan meningkatnya konsentrasi enzim, inhibisi akibat penambahan kawao tercapai mulai konsentrasi enzim 1.65 mg/l. Gula pereduksi pun meningkat dengan kenaikan konsentrasi substrat, baik tanpa penambahan kawao maupun karena penambahan kawao. Inhibisi mulai terjadi pada konsentrasi substrat sekitar 7.5 g/l. Pada faktor perubahan nilai ph, akibat penambahan kawao, aktivitas invertase maksimum tercapai ph 4, dan suhu optimumnya bergeser di suhu 60 o C. Inhibisi terjadi pada rentang ph 4-7 dan mulai suhu 0-60 o C. Aktivitas invertase hanya vi

7 mampu bertahan hingga 10 detik pemanasan, selanjutnya terjadi penurunan akibat mengalami denaturasi, demikian sama halnya dengan penambahan kawao, namun hingga 30 detik pertama masih memberikan respon inhibisi yang cukup baik. Kinetika inhibisi laju degradasi sukrosa dilakukan pada kondisi lingkungan ph 7, dengan tiga titik suhu pengamatan (30 o C, 40 C, 50 C) menghasilkan nilai K M dan V maks yang berbeda seiring dengan peningkatan suhu. Kerusakan sukrosa semakin meningkat seiring dengan meningkatnya suhu, namun penambahan kawao memberikan efek inhibisi yang cukup baik. Model inhibisi yang sesuai dengan data yang diperoleh pada suhu 30 o C, 40 o C dan 50 o C ternyata memberikan hasil yang sama yaitu termasuk dalam model inhibisi un-kompetitif (partial). Nilai parameter kinetika inhibisi pada suhu 30 o C berturut-turut, nilai K M g/l, K M g/l, V maks µm/min, V max µm/min, Ki g/l dan beta Nilai parameter kinetika inhibisi pada suhu 40 o C yaitu, nilai K M g/l, K M g/l, V maks µm/min, V max µm/min, Ki 0.01 g/l dan beta Nilai parameter kinetika inhibisi pada suhu 50 o C yaitu, nilai K M g/l, K M g/l, V maks µm/min, V max µm/min, Ki g/l dan beta vii

8 LEMBAR PERNYATAAN Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa skripsi dengan judul : Penggunaan Akar Kawao (Millettia sericea sp) sebagai Inhibitor Aktivitas Invertase adalah karya asli saya sendiri, dengan arahan dosen pembimbing akademik, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya. Bogor, Agustus 2006 Yang Membuat Pernyataan Nama : Rian Widipratomo NRP : F viii

9 BIODATA RINGKAS Penulis dilahirkan di Bogor pada hari Jumat tanggal 15 Juli Penulis adalah anak ke-dua dari empat bersaudara, putra dari pasangan Sudarsih dan Sutomo. Pendidikan dasar penulis dimulai sejak tahun 1989 di Sekolah Dasar Negeri Perwira I Bogor, hingga selesai pada tahun Penulis melanjutkan pendidikan di SLTP Negeri 4 Bogor hingga selesai pada tahun 1998, kemudian melanjutkan pendidikan di Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor (SMAKBO) hingga selesai pada tahun Pada tahun 2002, Penulis melanjutkan pendidikan tinggi di Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Alhamdulillah, pada tahun 2006 Penulis menyelesaikan pendidikan tinggi strata 1 dan meraih gelar Sarjana Teknologi Pertanian. Selama menjadi mahasiswa Institut Pertanian Bogor, penulis aktif menjadi pengurus BEM FATETA-IPB sebagai Staf Departemen Politik dan Advokasi ( ), sebagai asisten praktikum untuk mata kuliah Menggambar Teknik (2003), asisten praktikum Penerapan Komputer (2004), dan asisten praktikum Peralatan Industri Pertanian (2005). Penulis melaksanakan praktek lapang pada Tahun 2005 dengan topik Penerapan Produksi Bersih pada Proses Produksi Biskuit Tim Tam di PT Arnott s Indonesia-Bekasi, Jawa Barat. ix

10 KATA PENGANTAR Alhamdulillah, segala puji hanyalah milik Allah Azza Wa Jalla. Penulis memanjatkan rasa syukur ke hadirat-nya atas segala rahmat, karunia, dan ridha- Nya sehingga penulis dapat melakukan penelitian serta menyelesaikan skripsi dengan judul Penggunaan Akar Kawao (Millettia sericea sp) sebagai Inhibitor Aktivitas Invertase. Selama pelaksanaan penelitian hingga selesainya penulisan skripsi ini, penulis banyak mendapatkan bimbingan, dukungan, serta semangat dari berbagai pihak. Menyadari hal tersebut, dengan perasaan yang tulus pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Prayoga Suryadarma, STP, MT., selaku dosen pembimbing yang telah memberikan bimbingan, motivasi, dan arahan selama penulis menjalani kegiatan akademis dan penelitian di Departemen Teknologi Industri Pertanian. 2. Dr. Ir. Dwi Setyaningsih, MSi. dan Dr. Ono Suparno, STP, MT., selaku dosen penguji yang telah mengevaluasi dan memberikan saran serta masukan bagi kesempurnaan penulisan skripsi ini. 3. Keluarga penulis yaitu Ibu, Bapak, serta saudara-saudaraku atas doa restu, semangat dan motivasi yang tiada henti menyertai diri penulis. 4. Rekan-rekan TIN angkatan 39, terutama rekan kerja penelitian (Rheni H., Annisa R., Fitri F., dan M. Ichsan) yang telah banyak memberikan bantuan, dukungan, semangat dan doa. 5. Para laboran di Departemen Industri Pertanian atas segala bantuan yang telah diberikan selama penulis melakukan penelitian. 6. Rekan, sahabat dan orang-orang yang mendukung kesuksesan penulis yang tak dapat penulis sebutkan satu per satu. Penulis berharap, semoga karya sederhana ini dapat bermanfaat terutama bagi rekan sejawat. Bogor, Agustus 2006 Penulis x

11 DAFTAR ISI Lembar Pengesahan... iii Ringkasan... iv Lembar Pernyataan... viii Daftar Riwayat Hidup... ix Kata Pengantar... x Daftar Isi... xi Daftar Tabel... xiii Daftar Gambar... xiv Daftar Lampiran... xvi I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang... 1 B. Tujuan Kegiatan... 3 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Sukrosa... 4 B. Akar Kawao... 5 C. Invertase... 5 D. Aktivitas dan Stabilitas Enzim... 6 E. Faktor yang Mempengaruhi Laju Degradasi Sukrosa Pengaruh konsentrasi substrat dan enzim Pengaruh suhu dan tekanan Pengaruh ph Pengaruh penambahan garam logam Perubahan kondisi lingkungan F. Kinetika Enzimatik Inhibisi kompetitif Inhibisi nonkompetitif Inhibisi unkompetitif III. METODOLOGI A. Alat B. Bahan C. Tempat dan Waktu Penelitian D. Metode Penelitian Tahapan penelitian Prosedur percobaan xi

12 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Aktivitas Invertase B. Penentuan Pengaruh Konsentrasi Inhibitor Kawao C. Hubungan Pengaruh Perubahan Faktor terhadap Degradasi Sukrosa Pengaruh konsentrasi enzim Pengaruh konsentrasi substrat Pengaruh ph Pengaruh suhu Pengaruh lama pemanasan D. Kinetika Inhibisi Invertase V. KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan B. Saran DAFTAR PUSTAKA xii

13 DAFTAR TABEL Tabel 1. Pengaruh jenis garam logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0.005M terhadap aktivitas invertase Tabel 2. Hasil penentuan parameter kinetika Tabel 3. Tabulasi data perbandingan volume pengaruh konsentrasi enzim Tabel 4. Tabulasi data perbandingan volume pengaruh konsentrasi substrat Tabel 5. Tabulasi data perbandingan volume pengaruh ph Tabel 6. Tabulasi data perbandingan volume pengaruh suhu inkubasi Tabel 7. Tabulasi data perbandingan volume pengaruh lama pemanasan xiii

14 DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dengan bantuan invertase... 4 Gambar 2. Akar kawao (Millettia sericea)... 5 Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu... 8 Gambar 4. Pengaruh nilai ph terhadap aktivitas invertase dari nira tebu... 9 Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik 12 Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian Gambar 14. Kurva aktivitas invertase dengan nilai persamaan y = x dan koefisien regresi r2 = Gambar 15. Kurva pengaruh konsentrasi kawao terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 16. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi enzim terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 17. Inhibisi aktivitas invertase oleh kawao pada konsentrasi enzim yang berbeda Gambar 18. Kurva pengaruh perubahan konsentrasi sukrosa terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 19. Inhibisi aktivitas invertase oleh kawao pada konsentrasi sukrosa yang berbeda Gambar 20. Kurva pengaruh perubahan ph terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 21. Inhibisi aktivitas invertase oleh kawao pada ph yang berbeda Gambar 22. Kurva pengaruh perubahan suhu terhadap konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 23. Inhibisi aktivitas invertase oleh kawao pada suhu yang berbeda Gambar 24. Kurva pengaruh lama pemanasan terhadap aktivitas konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 25. Inhibisi aktivitas invertase oleh kawao pada lama pemanasan yang berbeda xiv

15 Gambar 26. Kurva aktivitas invertase pada suhu 30 o C yang ditunjukkan oleh hubungan antara konsentrasi sukrosa dan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 27. Kurva aktivitas invertase pada suhu 40 o C yang ditunjukkan oleh hubungan antara konsentrasi sukrosa dan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 28. Kurva aktivitas invertase pada suhu 50 o C yang ditunjukkan oleh hubungan antara konsentrasi sukrosa dan konsentrasi gula pereduksi yang dihasilkan Gambar 29. Kurva persamaan kinetika inhibisi invertase oleh kawao pada masing-masing suhu Gambar 30. Kurva standar glukosa+fruktosa, dengan nilai y = x dan r 2 = Gambar 31. Kurva standar glukosa+fruktosa, dengan nilai y = x dan r 2 = Gambar 32. Kurva standar glukosa+fruktosa, dengan nilai y = x dan r 2 = Gambar 33. Kurva standar glukosa+fruktosa, dengan nilai y = x dan r 2 = Gambar 34. Kurva standar glukosa+fruktosa, dengan nilai y = x dan r 2 = xv

16 DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Prosedur penelitian (tambahan) Lampiran 2. Tabulasi data perbandingan volume masing-masing komponen pada pengujian faktor pengaruh aktivitas enzim Lampiran 3. Data hasil analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan Lampiran 4. Data kinetika inhibisi suhu 30 o C Lampiran 5. Data kinetika inhibisi suhu 40 o C Lampiran 6. Data kinetika inhibisi suhu 50 o C Lampiran 7. Data uji fitokimia akar kawao xvi

17 I. PENDAHULUAN Hampir semua enzim dapat dihambat oleh senyawa kimia tertentu. Senyawa penghambat enzim sangat berguna dalam menjelaskan lintas metabolik di dalam sel. Lebih lanjut, beberapa obat yang bermanfaat di dalam dunia kedokteran nampaknya berfungsi karena senyawa ini dapat menghambat enzimenzim tertentu yang mengganggu kerja sel. Enzim telah menjadi alat praktis yang penting, bukan hanya dalam dunia kesehatan, tetapi juga dalam industri kimiawi, dalam pengolahan pangan, dan pertanian. A. Latar Belakang Sukrosa (glukosa-1,2-fruktosa) yang termasuk dalam golongan disakarida merupakan bahan pemanis yang umum digunakan untuk konsumsi manusia. Salah satu sumber alami sukrosa yang paling utama adalah tebu, yang mengandung hingga 20% sukrosa berdasarkan berat. Sukrosa bukanlah termasuk gula pereduksi, berbeda dengan monosakarida penyusunnya yakni glukosa dan fruktosa yang merupakan gula pereduksi. Hidrolisis sukrosa terutama yang terjadi pada industri gula tebu merupakan suatu proses kerusakan gula yang perlu dihindari. Pembentukan gula invert hasil hidrolisis akan menghambat proses kristalisasi sukrosa dan mengurangi rendemen gula yang dihasilkan. Faktor inilah yang menjadi salah satu penyebab produktivitas dan efisiensi industri gula menjadi rendah. Adanya kandungan gula pereduksi seperti fruktosa dan glukosa menyebabkan sulitnya proses kristalisasi sukrosa menjadi gula pasir. Selain itu, terdapatnya gugus hemiasetal bebas pada gula pereduksi memicu terjadinya reaksi oksidasi. Reaksi tersebut menyebabkan struktur gula pereduksi teroksidasi menjadi asam aldonat dan mengakibatkan ph larutan menjadi asam serta semakin memicu kerusakan sukrosa lebih lanjut. Untuk itu diperlukan suatu upaya yang dapat dilakukan agar kerusakan sukrosa semacam ini dapat dihindari atau minimal dapat dihambat sehingga nilai rendemen dan produktivitas industri gula dapat ditingkatkan. Kerusakan gula atau hidrolisis sukrosa dapat disebabkan oleh aktivitas mikroorganisme yang berada dalam nira, terutama yang menghasilkan

18 invertase, ataupun keberadaan invertase yang memang terdapat dalam nira. Keberadaan invertase terkait erat dengan keberadaan sukrosa, karena hampir di sebagian besar tanaman, sukrosa merupakan bentuk umum senyawaan karbon yang dimetabolisme oleh sel tanaman, dan invertase berperan dalam aktivitas metabolisme sukrosa tersebut. Selain itu perlakuan proses kimia (pengaruh asam, suhu tinggi) juga turut memicu terjadinya hidrolisis sukrosa. Secara kimiawi, penurunan aktivitas enzim sebagai upaya mengurangi kerusakan gula dapat dilakukan dengan pengendalian perlakuan proses atau penambahan garam logam. Namun, upaya tersebut perlu dikurangi pada proses industri pangan terutama terkait dengan isu kesehatan. Upaya lain adalah menurunkan aktivitas enzim, terutama invertase, baik yang terdapat dalam nira maupun hasil ekstraseluler mikroorganisme dengan cara penambahan bahan alami sebagai inhibitor yang mampu menghambat aktivitas enzim. Beberapa upaya penghambatan laju kerusakan sukrosa melalui penurunan aktivitas invertase telah dilakukan baik dengan perlakuan suhu, tekanan serta penambahan inhibitor. Causette et al. (1998) melakukan inaktivasi enzim dengan menggunakan gelembung gas inert, menurutnya perlakuan suhu dan tekanan yang tinggi akan mempengaruhi kualitas produk (sukrosa) akibat terjadinya reaksi lain yang tidak diinginkan (lateral reaction). Cavaille dan Didier (1996) mengkombinasikan perlakuan tekanan tinggi dengan suhu untuk menginaktivasi invertase, sedangkan Trojanowicz et al. (2004) dan Pirvutoiu (2001) melakukan penelitian tentang pengaruh keberadaan kation logam Hg (II) terhadap inhibisi invertase. Penggunaan bahan alami dalam reaksi inhibisi invertase perlu dilakukan untuk menutupi kelemahan yang terdapat pada perlakuan tekanan dan suhu serta penggunaan logam berat sebagai inhibitor. Hal tersebut seperti yang telah dilakukan oleh Ewing et al. (1977) dan Pressey (1966) serta Bracho (1990), mereka menggunakan umbi kentang (Solanum tuberosum L.) sebagai inhibitor invertase, hasil identifikasi menunjukkan adanya zat inhibitor di dalam umbi kentang tersebut. Studi lain juga telah dilakukan oleh Pressey (1994) dan Weil et al. (1994) dalam Greiner et al. (1998) serta Hothorn et al. 2

19 (2003) yang mengidentifikasi keberadaaan inhibitor invertase di dalam tembakau dan tomat. Dalam penelitian ini, digunakan akar kawao (Millettia sericea) sebagai bahan inhibitor yang mampu mempengaruhi aktivitas invertase. Akar kawao digunakan oleh petani gula aren dengan cara menambahkan tumbukan akar kawao seruas jari ke dalam bumbung tempat penyadapan nira. Penambahan akar kawao tersebut mampu mencegah terbentuknya gula pereduksi yang sulit untuk dikristalkan, karena dapat menghambat aktivitas invertase juga sebagai anti mikroba penghasil invertase. Selain itu, perlunya mengetahui perubahan faktor seperti pengaruh konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, ph lingkungan, suhu inkubasi dan lama pemanasan, sehingga dapat diketahui langkah yang tepat dalam upaya mengurangi kerusakan sukrosa. B. Tujuan Tujuan penelitian ini antara lain, 1. Menentukan hubungan perubahan konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu inkubasi dan lama pemanasan akibat penambahan ekstrak kawao (Millettia sericea) pada laju degradasi sukrosa. 2. Menentukan parameter kinetika inhibisi (K M dan V max ) laju degradasi sukrosa akibat penambahan ekstrak kawao (Millettia sericea). 3

20 II. TINJAUAN PUSTAKA A. Sukrosa Sukrosa, biasanya diketahui sebagai gula meja (table sugar), merupakan disakarida yang tersusun atas sebuah molekul α-d-glukosa dan sebuah molekul β-d-fruktosa yang dihubungkan oleh ikatan α-1,2-glikosidik. Ketika ikatan α-1,2-glikosidik terputus oleh reaksi hidrolisis, akan terbentuk campuran glukosa dan fruktosa. Campuran monosakarida tersebut dikenal sebagai gula invert (invert sugar), yang merupakan turunan dari sukrosa. Sukrosa (glukosa-1,2-fruktosa) merupakan bahan pemanis yang umum dan banyak digunakan dalam konsumsi hidup manusia, dan salah satu sumber penting penghasil sukrosa tersebut adalah gula tebu yang mengandung hingga mencapai 20% (w/w) sukrosa (Glazer dan Nikaido, 1995 dalam Filho et al., 1999). Degradasi sukrosa dapat pula terjadi melalui hidrolisis asam atau secara enzimatis menggunakan invertase (Monsan et al., 1984 dalam Filho et al., 1999). Demikian pula dengan Rahman et al. (2004) yang menyatakan bahwa sukrosa dapat dihidrolisis dengan bantuan enzim yaitu invertase atau sukrase. Reaksi hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dengan bantuan invertase dapat dilihat pada Gambar 1. Gambar 1. Reaksi hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dengan bantuan invertase (Chaplin, 2003). 4

21 B. Akar Kawao Kawao (Milletia sericea) merupakan tumbuhan perdu yang memanjat, cegak, panjang m, banyak ditemukan di hutan dan tepi sungai mulai dari dataran rendah sampai ±1000 m dpl. Tumbuhan ini mudah tumbuh di tanah berlumpur seperti pinggir air tawar dekat pantai. Warna akarnya coklat kehitam-hitaman, gemangnya sebesar jari tangan, bagian teras berair, sebagian dari akar keluar di atas lumpur, digunakan untuk membius ikan. Orang Jawa memberikan sepotong akar dalam cairan nira yang masih segar agar cairan tersebut tidak menjadi asam (Heyne, 1987). Akar kawao diperlihatkan pada Gambar 2. Gambar 2. Akar kawao (Millettia sericea) C. Invertase Invertase, yang memecah molekul sukrosa menjadi fruktosa dan glukosa merupakan salah satu enzim yang pertama ditemukan. Enzim ini diisolasi pada pertengahan kedua di abad 19, dan nama enzim tersebut ditentukan karena fungsinya yang menghasilkan gula invert, yaitu campuran 1:1 D-glukosa (dextrorotatory) dan D-fruktosa (levorotatory) (Alberto, et al., 2004). Sistem tata nama untuk invertase adalah beta-fructofuranosidase (EC ), dan nomor klasifikasi tersebut menunjukkan bahwa reaksi yang dikatalisasi adalah reaksi hidrolisis. Berbeda dengan enzim lainnya, invertase memiliki aktivitas yang tinggi pada nilai ph 3,5 5,5, dengan nilai optimum mendekati nilai ph 4,5. Aktivitas enzim mencapai nilai maksimum pada suhu 55 o C. Nilai Michaelis-Menten untuk jenis enzim yang berbeda bervariasi, tetapi kebanyakan enzim memiliki nilai K M antara 2-5 mm (Wang, 2002). Reed (1966) dalam Pancoast (1980) menyatakan bahwa ragi Saccharomyces cerevisiae dan Saccharomyces carlsbergensis merupakan 5

22 sumber utama penghasil invertase untuk aplikasi industri. Aspergillus orizae dan Aspergillus niger adalah fungi yang juga merupakan sumber invertase. Invertase sebagian besar digunakan dalam industri makanan di mana fruktosa lebih disukai dibandingkan dengan sukrosa sebab fruktosa lebih manis dan tidak mengkristal dengan mudah. Namun, penggunaan invertase agak terbatas sebab enzim yang lain yakni glukosa isomerase, dapat digunakan untuk mengkonversi glukosa menjadi fruktosa dengan murah, selain itu dengan alasan kesehatan dan pertimbangan rasa, penggunaannya di dalam industri makanan memerlukan invertase yang tinggi tingkat kemurniannya (Wang, 2002). D. Aktivitas Dan Stabilitas Enzim Aktivitas enzim didefinisikan sebagai kecepatan pengurangan substrat atau kecepatan pembentukan produk pada kondisi optimum. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai satu mikromol (µmol; 10-6 mol), nanomol (nmol; 10-9 mol), atau pikomol (pmol; ) substrat yang bereaksi atau produk yang dikatalisis setiap menit (Rodwell, 1981). Stabilitas dan aktivitas enzim ditentukan oleh konformasi tiga dimensinya. Aktivitas enzim pada suhu tinggi terjadi melalui dua mekanisme, yaitu mekanisme intrinsik dan ekstrinsik. Mekanisme intrinsik yaitu struktur enzim secara alamiah mendukung aktivitasnya yang dipengaruhi oleh faktorfaktor interaksi elektrostatik, interaksi hidrofobik, kandungan asam amino alifatik, ikatan disulfida, dan kekompakan struktur. Ikatan hidrofobik akan semakin kuat pada suhu tinggi untuk enzim termostabil, sebaliknya akan semakin lemah untuk enzim termolabil karena terjadi denaturasi. Mekanisme ekstrinsik yaitu terjadinya stabilitas panas akibat adanya interaksi multipoint dengan komponen-komponen lain dan adanya faktor penstabil panas, yaitu pengikatan substrat dengan komponen berberat molekul rendah, kontak antara protein-protein, gugus prostetik, kation logam dan lain-lain (Nam-Soo dan Kim, 1991). Enzim merupakan salah satu jenis protein globular. Stabilitas dan aktivitas enzim ditentukan oleh konformasi tiga dimensinya yang dipengaruhi oleh struktur tertier protein. Terdapat empat jenis interaksi yang menstabilkan 6

23 struktur tersebut pada suhu, ph dan konsentrasi ion normal, antara lain ikatan hidrogen, gaya tarik ionik, interaksi hidrofobik dan jembatan kovalen (Lehninger, 1988). Aktivitas enzim dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, ph, dan suhu, selain itu memiliki aktivitas yang optimal pada nilai tertentu untuk setiap parameter tersebut. Konsentrasi substrat yang rendah menyebabkan daerah aktif pada enzim tidak semuanya terikat pada substrat. Terdapat suhu optimal dimana reaksi berlangsung sangat cepat. Ketika suhu di atas suhu optimal, kecepatan reaksi menurun tajam karena enzim sebagai protein akan terdenaturasi, sedangkan pada suhu terlalu rendah beberapa enzim tidak dapat bekerja. Aktivitas enzim juga dipengaruhi oleh ph karena sifat ionik gugus karboksil dan gugus amino mudah dipengaruhi ph (Pelczar dan Chan, 1986). E. Faktor Yang Mempengaruhi Laju Degradasi Sukrosa Sukrosa mudah mengalami kerusakan atau degradasi. Proses degradasi sukrosa dapat disebabkan oleh reaksi enzimatis maupun kimiawi (Monsan et al., 1984 dalam Filho et al., 1999). Banyak faktor yang mempengaruhi kerusakan sukrosa, salah satunya adalah yang disebabkan oleh reaksi enzimatis (misal invertase). Reaksi enzimatis dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain suhu dan tekanan, ph, dan penambahan inhibitor (biasanya berupa garam logam atau senyawa kimia lainnya). 1. Pengaruh Konsentrasi Substrat dan Enzim Invertase dapat mengkatalisis sukrosa pada konsentrasi di atas 59% w/v. Peningkatan konsentrasi sukrosa lebih lanjut sampai 80% w/v menurunkan aktivitas enzim secara signifikan, mungkin disebabkan oleh konsentrasi air rendah, inhibisi oleh substrat atau agregasi substrat (Somiari dan Bielecki, 1995 dalam Filho et al, 1999). Penelitian yang dilakukan oleh Brown pada tahun 1902 tentang invertase, menyatakan bahwa bila konsentrasi sukrosa lebih tinggi daripada enzim, kecepatan reaksi menjadi tidak bergantung pada konsentrasi sukrosa (Pancoast, 1980). Aktivitas enzimatik akan menurun 7

24 pada konsentrasi substrat yang tinggi dan cenderung membentuk asimtot. Jenis penghambatan ini akan membentuk kompleks (dead end complex), satu sisi molekul substrat terikat pada enzim dan molekul substrat lain terikat pada sisi lain (sekunder) enzim (Suryani dan Mangunwidjaya, 2002). 2. Pengaruh Suhu dan Tekanan Suhu merupakan salah satu faktor yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Peningkatan suhu dapat meningkatkan reaksi, akan tetapi peningkatan suhu yang tinggi akan menyebabkan denaturasi protein, sehingga akan menurunkan aktivitas enzim. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dapat dilihat pada Gambar 3 (Rahman et al., 2004). Aktivitas relatif (%) suhu ( o C) Gambar 3. Pengaruh suhu terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) Berdasarkan Gambar 3, dapat diketahui bahwa faktor suhu berpengaruh terhadap aktivitas invertase. Semakin tinggi suhu yang diberikan akan meningkatkan aktivitas invertase. Di lain pihak, peningkatan suhu lebih lanjut (di atas 60 o C) dapat menyebabkan penurunan aktivitas invertase. Peingkatan suhu di atas 60 o C dapat menyebabkan denaturasi protein yang merupakan senyawa penyusun enzim. Selain suhu, tekanan juga merupakan faktor yang berpengaruh terhadap aktivitas enzim. Peningkatan suhu pada reaksi enzim dapat meningkatkan laju reaksi, namun di sisi lain dapat menyebabkan inaktivasi enzim (Stauffer, 1989). Peningkatan tekanan di atas 50 Mpa dapat menurunkan aktivitas 8

25 enzim (Cavaille dan Didier, 1996). Perlakuan suhu dan tekanan yang tinggi dapat menurunkan aktivitas invertase, juga mempengaruhi kualitas produk (sukrosa) akibat terjadinya reaksi lain yang tidak diinginkan (lateral reaction) (Causette et al., 1998). 3. Pengaruh ph Nilai ph merupakan faktor yang juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim. Kebanyakan dari enzim tidak aktif atau infaktif pada nilai ph yang ekstrim. Hal tersebut dapat disebabkan oleh nilai ph yang ekstrim dapat merusak protein yang merupakan komponen penyusun enzim. Pengaruh faktor nilai ph terhadap aktivitas enzim dapat dilihat pada Gambar 4 (Rahman et al., 2004). Aktivitas relatif (%) ph Gambar 4. Pengaruh nilai ph terhadap aktivitas invertase dari nira tebu (Rahman et al., 2004) Aktivitas invertase dari nira tebu menurut Gambar 4 tersebut di atas dipengaruhi oleh faktor nilai ph. Peningkatan aktivitas enzim terlihat mulai dari nilai ph 2 sampai dengan ph 7. Namun, peningkatan ph di atas 7 menyebabkan aktivitas invertase menjadi menurun. Setiap enzim akan memberikan profil karakteristik yang spesifik pada rentang ph tertentu, nilai ph optimum diperoleh akibat interaksi struktur maupun kondisi ionik di antara enzim, substrat atau kofaktor yang terlibat. Stauffer (1989) menyatakan bahwa hubungan perubahan ph dengan laju reaksi enzim dapat disebabkan oleh tiga hal, yakni: a. Protonasi sisi aktif rantai asam amino pada kompleks enzim-substrat (ES) berubah, mengakibatkan perubahan kemampuan kompleks ES dalam menghasilkan produk. 9

26 b. Berubahnya muatan ion molekul substrat atau sisi aktif enzim sehingga mempengaruhi kecenderungan pembentukan kompleks ES. c. Pergeseran nilai ph dari kondisi netral dapat melemahkan stabilitas konformasi protein, menyebabkan terjadinya denaturasi enzim yang bersifat irreversible. 4. Pengaruh Penambahan Garam Logam Penambahan garam logam dan senyawa kimia lainnya dapat menyebabkan peningkatan atau penurunan aktivitas enzim. Perubahan aktivitas enzim tersebut dipengaruhi oleh jenis garam logam ataupun senyawa kimia yang ditambahkan. Pada Tabel 1 diperlihatkan mengenai pengaruh penambahan beberapa jenis garam logam dan senyawa kimia lainnya terhadap aktivitas enzim. Tabel 1. Pengaruh jenis garam logam dan bahan kimia pada konsentrasi 0,005 M terhadap aktivitas invertase No. Garam/bahan kimia Aktivitas relatif (%) 1 Tanpa bahan tambahan 100,00 2 MgCl 2 115,00 3 KCl 110,82 4 NaCl 120,00 5 MnCl 2 120,00 6 CaCl 2 114,24 7 HgCl 2 1,02 8 CuCl 2 30,00 9 FeCl 2 20,25 10 ZnCl 2 68,27 11 CdCl 2 55,26 12 AgNO 3 80,00 13 AlCl 3 78,00 14 EDTA 52,74 15 Glukosa 76,00 16 Asam asetat 45,30 Sumber: Rahman et al. (2004) Berdasarkan Tabel 1 dapat diketahui bahwa aktivitas invertase dapat dipengaruhi oleh keberadaan garam logam. Sebagian ada yang menghambat aktivitas enzim, namun sebagian lagi dapat meningkatkan aktivitas invertase yang berasal dari tanaman tebu. Kekuatan ikatan ion logam dengan protein tergantung pada muatan kation yang mengikatnya. Semakin tinggi muatan kation dari logam maka 10

27 semakin kuat ikatannya dengan protein, sehingga ikatan tersebut lebih stabil dan konstan (Darmono, 1995). 5. Perubahan Kondisi Lingkungan Perlakuan suhu yang tinggi dapat menginaktivasi enzim dan mikroorganisme, akan tetapi perlakuan suhu yang tinggi juga dapat menyebabkan perubahan produk, sehingga kualitasnya menurun. Metode lain yang dapat digunakan untuk menurunkan aktivitas enzim dan mikroorganisme tanpa merusak produk yang diinginkan adalah dengan cara pemberian gelembung gas inert. Pemberian gelembung gas inert nitrogen mampu menurunkan aktivitas enzim (Causette et al., 1998). F. Kinetika Enzimatik Enzim merupakan katalisator sejati. Molekul ini dapat meningkatkan kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa adanya enzim akan berlangsung lambat secara nyata. Terdapat dua cara umum dalam meningkatkan kecepatan reaksi kimia. Pertama dengan meningkatkan suhu, yang mempercepat gerak termal molekul. Umumnya kecepatan reaksi kimia meningkat hingga kira-kira 2 kali dengan kenaikan suhu 10 o C. Kedua, dengan menambahkan katalisator. Katalisator mampu menurunkan energi aktivasi, sehingga mempercepat reaksi kimia (Lehninger, 1988). Setiap enzim memiliki sifat yang khas, dinyatakan dalam suatu tetapan yaitu K M (tetapan Michaelis-Menten). Hampir semua enzim memiliki kurva kecepatan reaksi dengan bentuk umum yang hampir sama yaitu hiperbola. Michaelis-Menten mendefinisikan suatu tetapan untuk menyatakan hubungan antara konsentrasi substrat dan kecepatan reaksi enzimatik. K M didefinisikan sebagai konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Persamaan Michaelis-Menten adalah: Keterangan: V o V maks V o V = K maks M [ S] [ S] = kecepatan awal pada konsentrasi substrat [S] = kecepatan maksimum + 11

28 K M [S] = tetapan Michaelis-Menten enzim pada substrat tertentu = konsentrasi substrat Gambar 5. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik (lehninger, 1988) Nilai K M dan V maks sulit untuk ditentukan secara tepat dari grafik sederhana yang ditunjukkan pada Gambar 5, karena V maks hanya diduga dan tidak dapat diketahui nilai yang sebenarnya. Nilai K M yang lebih tepat dapat diperoleh dengan memetakan data yang sama dengan cara yang berbeda, yakni pemetaan kebalikan-ganda, didapat dari transformasi aljabar persamaan Michaelis-Menten. Hasil transformasi persamaan Michaelis-Menten dikenal dengan persamaan Lineweaver-Burk. 1 V o K = V M maks S V maks Selain dapat menentukan V maks secara lebih tepat, persamaan ini bermanfaat dalam menganalisa penghambatan enzim (Lehninger, 1988). Persamaan Lineaweaver-Burk menghasilkan kurva yang ditunjukkan pada Gambar 6. Nilai K M menunjukkan tingkat afinitas antara substrat dan enzim. Nilai K M yang rendah menunjukkan nilai afinitas yang tinggi (Lee, 2003). Gambar 6. Kurva Lineweaver-Burk 12

29 Kinetika inhibisi enzim menyangkut penentuan fungsi laju reaksi terhadap konsentrasi substrat dengan inhibitor pada berbagai konsentrasi. Kurva Lineweaver-Burk memungkinkan untuk menentukan jenis inhibisi yang bersifat reversible, antara lain sebagai berikut. Banyak bahan mengubah aktivitas dari suatu enzim dengan menggabungkannya dalam suatu jalur yang mempengaruhi ikatan substrat. Bahan-bahan yang mereduksi aktivitas suatu enzim dengan cara ini dikenal sebagai inhibitor. Inhibitor berupa bahan yang secara struktural menyerupai substrat enzimnya tetapi salah satunya tidak bereaksi atau bereaksi dengan sangat lambat dibandingkan dengan substrat. Inhibitor-inhibitor seperti ini pada umumnya digunakan untuk menyelidiki sifat kimia dan sifat konformasi alami dari suatu daerah (site) ikatan substrat sebagai bagian dari suatu usaha untuk mengelusidasi mekanisme katalisis enzim tersebut (Simanjuntak dan Silalahi, 2003). Ada berbagai mekanisme di mana inhibitor enzim dapat bekerja. Menurut (Birch, 2005), inhibitor enzim secara garis besar terbagi menjadi dua jenis: 1) Inhibisi tidak dapat balik (irreversible), yakni yang menyebabkan inaktivasi tidak dapat balik pada enzim. Biasanya disebabkan oleh modifikasi ikatan kovalen terhadap struktur enzim. Pengaruh kinetika pada inhibitor tidak dapat balik adalah menurunkan konsentrasi enzim aktif, juga menurunkan kemungkinan konsentrasi maksimum kompleks ES (enzim-substrat). Inhibitor tidak dapat balik umumnya merupakan racun dan tidak diperkenankan untuk tujuan pengobatan. 2) Inhibisi dapat balik (reversible), adalah in-aktivasi dapat balik pada enzim. Umumnya inhibitor dapat balik berikatan dengan enzim melalui gaya nonkovalen dan menjaga kesetimbangan dengan enzim. Konstanta kesetimbangan disosiasi kompleks enzim-inhibitor dikenal dengan istilah Ki. Inhibisi jenis ini dikategorikan menjadi tiga macam, (a) inhibisi kompetitif, (b) inhibisi non-kompetitif, dan (c) inhibisi un-kompetitif. 13

30 1. Inhibisi Kompetitif Inhibitor pada model inhibisi ini bersaing dengan substrat untuk memasuki sisi aktif enzim. Struktur kimia inhibitor umumnya menyerupai substrat. Oleh sebab itu, inhibitor tersebut dapat berikatan secara reversible dengan enzim (Rodwell, 1981). Mekanisme inhibisi kompetitif dapat dilihat pada Gambar 7. Gambar 7. Mekanisme inhibisi kompetitif Penyajian garis lurus pada kurva Lineweaver-Burk memotong sumbu ordinat pada titik yang sama. V maks tidak dipengaruhi oleh inhibitor (Suryani dan Mangunwidjaja, 2002). Kurva Lineweaver-Burk untuk model inhibisi kompetitif ditunjukkan pada Gambar 8. Gambar 8. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi kompetitif 2. Inhibisi Nonkompetitif Model inhibisi nonkompetitif tidak menunjukkan adanya persaingan antara inhibitor dengan substrat. Struktur inhibitor biasanya tidak atau sedikit menyerupai struktur substrat. Inhibitor nonkompetitif menurunkan kecepatan reaksi maksimal yang diperoleh pada pemberian sejumlah enzim (V maks yang lebih rendah), tetapi biasanya tidak 14

31 mempengaruhi nilai K M, ditunjukkan oleh kurva Lineweaver-Burk pada Gambar 10. Mekanisme reaksi inhibisi nonkompetitif dapat dilihat pada Gambar 9. Gambar 9. Mekanisme inhibisi nonkompetitif Gambar 10. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi nonkompetitif 3. Inhibisi Unkompetitif Inhibisi ini terjadi jika kompleks EI hilang, tetapi kompleks ESI terbentuk (Flickinger dan Drew, 1999). Inhibitor mengikat langsung pada kompleks enzim-substrat (ES), bukan pada enzim bebas. Mekanisme inhibisi unkompetitif ditunjukkan pada Gambar

32 Gambar 11. Mekanisme inhibisi unkompetitif Inhibitor yang bersifat unkompetitif akan mempengaruhi fungsi enzim, tetapi tidak terhadap ikatannya dengan substrat. Plot Lineweaver- Burk untuk inhibisi unkompetitif adalah linier dengan kemiringan atau slope K M /V maks seperti pada reaksi tanpa inhibitor, dapat dilihat pada Gambar 12 (Simanjutak dan Silalahi, 2003). Gambar 12. Plot Lineweaver-Burk untuk inhibisi unkompetitif 16

33 III. METODOLOGI A. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain peralatan gelas (erlenmeyer, gelas piala, pipet tetes, corong, tabung reaksi); peralatan ukur (labu takar, gelas ukur, pipet volumetri, pipet mikro, termometer, spektrofotometer, stopwatch, buret, neraca); dan peralatan pendukung (penangas air, sentrifuge, mortar, pisau, vortex). B. Bahan Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sukrosa, invertase (Sigma-Aldrich 19253: ph 4.5, 55 C, 355 units/mg solid), dan akar kawao (Milletia sericea). Akar kawao (Millettia sericea) diperoleh dari perkebunan agropolitan daerah Leuwiliang Bogor. Bahan yang digunakan untuk analisa adalah NaOH 0.1 N dan HCl 0.1 N, indikator PP, glukosa, fruktosa, buffer ph 3-11, pereaksi DNS (dinitro salicylic acid) dan aquades. C. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di laboratorium bioindustri, Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fateta IPB. Pengujian secara spektrofotometri dilakukan di laboratorium genetika, Pusat Antar Universitas (PAU) IPB. Rentang waktu penelitian dimulai pada bulan Januari Juni tahun D. Metode Penelitian Metode penelitian ini meliputi tahapan penelitian dan prosedur percobaan. Tahapan penelitian merupakan tahapan yang dilalui untuk mencapai tujuan penelitian, sedangkan prosedur percobaan merupakan urutan kegiatan dan tatacara yang secara teknis dikerjakan dalam setiap tahapan penelitian. 1. Tahapan Penelitian Penelitian dilakukan dalam empat tahap, yaitu (1) Penentuan aktivitas invertase, (2) Penentuan pengaruh konsentrasi inhibitor akar 17

34 kawao, (3) Penentuan hubungan perubahan faktor akibat penambahan kawao terhadap degradasi sukrosa, (4) Penentuan parameter kinetika (K M dan V maks ) laju degradasi sukrosa akibat penambahan kawao. Diagram alir tahapan penelitian dapat dilihat pada Gambar 13. Gambar 13. Diagram alir tahapan penelitian a. Penentuan aktivitas invertase Aktivitas invertase ditentukan untuk mengetahui kondisi awal enzim yang akan digunakan. Aktivitas invertase diperoleh dengan memplotkan kurva hubungan antara waktu reaksi dengan konsentrasi produk yang terbentuk. Nilai slope yang diperoleh menunjukkan aktivitas invertase yang diukur. Aktivitas enzim diukur berdasarkan definisi satu unit aktivitas invertase, yaitu banyaknya invertase yang dapat membebaskan 1 mikromol gula pereduksi dari substrat sukrosa selama 1 menit pada kondisi percobaan. Kondisi yang digunakan yakni pada kondisi optimum invertase, pada suhu 55 C, di dalam larutan buffer asetat ph

35 b. Penentuan pengaruh konsentrasi kawao Konsentrasi inihibitor akar kawao perlu ditentukan dan disesuaikan dengan komposisi campuran subtrat dan enzim yang akan digunakan, sehingga diperoleh batas konsentrasi optimum yang dapat terukur melalui kurva standar. Konsentrasi inhibitor yang diperoleh selanjutnya digunakan untuk karakterisasi invertase dengan penambahan inhibitor. Nilai gula pereduksi yang lebih rendah dari kontrol (perlakuan invertase tanpa inhibitor) menunjukkan terjadinya inhibisi. Pengaruh yang berbeda nyata diukur berdasarkan analisis sidik ragam (ANOVA) dan uji lanjut Duncan. c. Penentuan hubungan perubahan faktor akibat penambahan kawao terhadap degradasi sukrosa. Perubahan faktor yang dilakukan pada karakterisasi invertase meliputi pengaruh konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, ph, suhu, dan lama pemanasan dengan ditambahkan kawao. Hasil dari tahap ini didapatkan kurva profil pengaruh perubahan faktor akibat penambahan kawao terhadap aktivitas invertase. Pengaruh yang diidentifikasi adalah adanya kenaikan atau penurunan konsentrasi gula pereduksi pada setiap taraf yang diujikan berdasarkan analisis sidik ragam dan uji lanjut Duncan. d. Penentuan parameter kinetika (K M dan V maks ) laju degradasi sukrosa akibat penambahan kawao. Penentuan parameter kinetika dilakukan pada tiga titik suhu yang berbeda (30 o C, 40 o C, dan 50 o C) dan pada ph 7, di mana inhibisi akibat penambahan kawao masih terjadi. Model kinetika inhibisi diidentifikasi berdasarkan jenis perubahan nilai parameter kinetika (K M dan V maks ) yang diperoleh dari plot Lineweaver-Burk. Pengolahan data sehingga diperoleh model inhibisi yang sesuai serta nilai parameter kinetika (K M dan V maks ) dilakukan dengan menggunakan alat bantu 19

36 program SigmaPlot 2004 for Windows Version 9.01 dari Systat Software Inc. 2. Prosedur Percobaan Prosedur percobaan yang dilakukan pada penelitian ini adalah sebagai berikut. a. Penentuan aktivitas invertase Larutan kerja invertase 0.01 g/l (yang telah dibuat seperti pada Lampiran 1), disiapkan pada 8 buah tabung reaksi dengan volume masing-masing 1 ml. Secara terpisah, disiapkan pula larutan sukrosa 50 g/l pada 8 buah tabung reaksi berbeda, dengan volume masingmasing 0.5 ml sukrosa dan 0.5 ml air. Seluruh tabung reaksi tersebut yang berjumlah 16 buah, kemudian diinkubasi dalam penangas air yang bersuhu 55 C selama kurang lebih 5 menit. Selanjutnya secara berpasangan, tiap tabung yang berisi sukrosa dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi invertase, reaksi berlangsung pada kondisi suhu 55 o C. Waktu reaksi (t) mulai diukur pada saat larutan sukrosa kontak dengan invertase. Reaksi dihentikan pada masing-masing waktu yang diujikan, yaitu 30, 60, 90, 120, 180, 240, dan 300 (detik), dengan menambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 95 C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. b. Penentuan konsentrasi inhibitor Persiapan ekstrak kawao dilakukan dengan cara mencampurkan satu bagian akar kawao dengan dua bagian air berdasarkan bobot, selanjutnya akar kawao ditumbuk dan cairan ekstrak dipisahkan hingga diperoleh ekstrak kawao. Ekstrak kawao yang diperoleh disentrifugasi pada rpm selama 10 menit, lalu dibuat dalam beberapa konsentrasi, 0 25 % (v/v) ke dalam tabung reaksi. Setiap tabung selanjutnya ditambahkan larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 0.5 ml dan divortex. Kemudian ditambahkan 1 ml invertase 20

37 0.01 g/l pada masing-masing tabung reaksi (waktu reaksi mulai dihitung, t = 0). Pada saat waktu reaksi 5 menit (t = 5 menit), reaksi dihentikan dengan penambahan pereaksi DNS. Prosedur penghentian reaksi dan pengukuran sesuai dengan prosedur sebelumnya pada penentuan aktivitas invertase. c. Penentuan pengaruh perubahan faktor Penentuan pengaruh perubahan faktor dilakukan pada kondisi dengan penambahan inhibitor kawao yang dibandingkan dengan perlakuan kondisi normal (tanpa penambahan inhibitor kawao). Prosedur yang dilakukan pada perlakuan tanpa inhibitor (normal) sama halnya dengan pengujian pada penambahan inhibitor, hanya saja tidak ditambahkan larutan kawao. Untuk setiap pengujian pengaruh perubahan faktor, digunakan ekstrak kawao yang segar dan bukan berasal dari larutan stok ekstrak kawao. Total volume larutan dalam setiap tabung reaksi pada pengujian tetap sama yakni 2 ml, sehingga volume yang ditambah atau dikurangi adalah aquades dan buffer. Secara tabulasi data perbandingan volume masing-masing komponen dapat dilihat pada Lampiran Pengaruh konsentrasi enzim Larutan kerja enzim invertase 0.01 g/l disiapkan pada rentang volume ml yang kemudian volume larutan digenapkan dengan penambahan larutan buffer ph 7 hingga volumenya 1 ml. Kemudian ditambahkan larutan kawao sebanyak 0.1 ml pada masing-masing tabung reaksi. Selanjutnya larutan sukrosa 50 g/l sebanyak 1 ml dimasukkan pada tiap-tiap tabung tersebut, dan mulai dihitung waktu reaksinya (t = 0 menit). Reaksi berlangsung pada suhu ruang (28 ± 2 o C), saat waktu reaksi 5 menit dimasukkan 2 ml pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi. Kemudian tabung tersebut dimasukkan ke dalam penangas air pada suhu 95 C selama 10 menit. Setelah 10 menit, tabung reaksi dikeluarkan dan didinginkan untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. 21