1. Filtrat enzim mananase didapatkan dari hasil produksi kapang Eupenisilium javanicum pada substrat bungkil kelapa 3%. 2. Pereaksi yang digunakan ada

Transkripsi

1 PERSYARATAN BATAS WAKTU PENYIMPANAN SUBSTRAT PENENTUAN AKTIFITAS ENZIM 0- MANANASE Emma Ludia Balai Penelitian Ternak Ciawi, P.O. Box 221, Bogor PENDAHULUAN Enzim mananase merupakan suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam proses aktifitas biologis. Senyawa ini berfungsi sebagai biokatalisator dan sifatnya sangat khas karena hanya bekerja pada substrat tertentu misalnya enzim urease substratnya adalah urea dan bentuk reaksinya ialah mengubah substrat menjadi amonia dan karbondioksida. Enzim mananase adalah enzim yang dapat memecah senyawa manan menjadi manosa, enzim mananase dapat diproduksi oleh kapang pada substrat kaya manan seperti gum "locust bean" dan bungkil kelapa. Enzim bereaksi dalam pembentukan senyawa kompleks antara enzim dengan substratnya, sehingga enzim dapat bekerja pada substrat tersebut. Senyawa komplek ini kemudian dipecah untuk menghasilkan suatu senyawa lain dan enzim yang tidak berubah, kemudian molekul enzim terlepas dan bekerja pada molekul substrat gum yang lain. Aktifitas enzim dipengaruhi oleh ph, konsentrasi substrat, suhu dan waktu inkubasi. Satu unit aktifitas enzim mananase setara dengan satu µmol manosa dalam satu menit. Aktifitas enzim diukur dengan menentukan kadar manosa yang terbentuk. Penentuan kadar manosa dilakukan secara kuantitatif yaitu metode asam dinitrosalisilat (DNS). Metoda ini didasarkan pada peristiwa tereduksinya DNS menjadi 3-amino 5 nitrosalisilat oleh senyawa gula pereduksi (manosa) yang akan memberikan warna sindur yang dapat ditentukan absorbansinya dengan cara spektrofotometri. Pada penentuan aktivitas (esai) enzim mananase digunakan substrat gum "locust bean". Substrat tersebut sukar larut dalam larutan dapar, maka dalam pemakaiannya tidak dapat langsung dipergunakan tapi disimpan terlebih dahulu di ruang pendingin agar substrat tersebut benar-benar larut. Penyimpanan substrat yang terlalu lama juga dapat menimbulkan warna yang lebih sindur, oleh sebab itu perlu dicari lama penyimpanan substrat maksimum yang tetap dapat menghasilkan analisis yang akurat. BAHAN DAN METODE Untuk tujuan ini diperlukan filtrat enzim mananase, pereaksi dan peralatan analisis sebagai berikut 182

2 1. Filtrat enzim mananase didapatkan dari hasil produksi kapang Eupenisilium javanicum pada substrat bungkil kelapa 3%. 2. Pereaksi yang digunakan adalah : larutan dapar Asetat 0,1 M ph 5,8 ; Substrat gum "locust bean" (SIGMA) 0,5 % dalam larutan dapar Asetat 0,1 M ph 5,8 ; pereaksi DNS yang terdiri dari : 10 gram NaOH, 182 gram KNatartrat, 10 gram Dinitrosalisilat acid, 2gram Phenol, 0,5 gram Sodium sulphite dilarutkan dalam 1 liter air suling ; deret standar manosa µg/ml. 3. Peralatan yang dipakai adalah Spektrofotometer HITACHI U-200 vortex penangas air, pipet automatik, tabung reaksi. Metode esai Esai enzim P - mananase dilakukan untuk menentukan aktivitas enzim mananase berdasarkan modifikasi metoda Araujo dan Ward (1990) sebagai substrat digunakan larutan manan (Gumlocust bean) 0,5% dalam larutan dapar asetat 0,1 M ph 5,8, suhu inkubasi 40 C. Kadar manosa yang dihasilkan diukur dengan metoda DNS berdasarkan Miller (1959) yaitu dengan menentukan produksi manosa dalam substrat manan "locust bean". Cara kerja esai Enzim yang sudah diencerkan dipipetkan 1 ml ke dalam tabung reaksi, dipanaskan selama 5 menit dalam penangas air dengan suhu 40 C, kemudian ditambahkan 1 ml substrat gum "locust bean" 0,5% yang sudah dipanaskan pada 40 C, diaduk dengan vortex. Selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 40 C selama 30 menit. Setelah inkubasi ditambahkan 3 ml pereaksi DNS untuk menghentikan reaksi, diaduk dengan vortex, selanjutnya tabung reaksi dididihkan 100 C selama 15 menit. Setelah didinginkan warna sindur yang terbentuk diukur pada S pe ktrofoto meter pada panjang gelombang 575 nm dan dibandingkan dengan kadar manosa standar. Blanko disiapkan dengan mencampurkan 1 ml larutan dapar dengan 3m1 DNS, kemudian ditambahkan 1 ml substrat gum "locust bean", diaduk dengan vortex, selanjutnya dididihkan 100 C selama 15 menit. Reaksi dilakukan secara duplo dan disiapkan pula kontrol pada pengenceran enzim yang sama tetapi reaksi langsung dihentikan dengan larutan DNS, penambahan 3m1 larutan DNS dilakukan sebelum penambahan substrat dan kemudian diaduk dengan vortex yang selanjutnya dididihkan pada suhu 100 C selama 15 menit. Perhitungan aktifitas enzim Kadar manosa (hg) contoh - kontrol x faktor pengenceran Bobot molekul manosa = 180 Waktu inkubasi = 30 menit bobot molekul manosa x waktu inkubasi = unit/ml 1 83

3 Penentuan perubahan warna blanko selama penyimpanan substrat Perubahan warna pada substrat dilakukan dengan membandingkan blanko dengan substrat dan tanpa substrat pada panjang gelombang 575 nm. Penentuan waktu penyimpanan substrat optimum Penentuan esai mananase dilakukan dengan substrat gum "locust bean" 0,5% dalam larutan dapar Asetat 0,1 M ph 5,8 yang disimpan di ruang pendingin dari hari ke-1 sampai hari ke-9. Esai enzim dilakukan setiap hari pada contoh enzim dan standar manosa yang sama dan disimpan pada suhu -10 C dengan substrat Gum locust bean yang sama. Penentuan standar manosa Bahan yang diperlukan : larutan standar manosa 1000.tg/mI, dibuat dengan konsentrasi 200, 300, 400 sampai 500 µg/ml, kemudian masing masing konsentrasi larutan diukur kadar manosanya dengan cara seperti di atas. Tabel 1. Regresi kurva standar pada berbagai waktu penyimpanan substrat waktu penyimpanan (hari) Regresi 2 0, , , , , , Tabel 2. Aktivitas mananase pada contoh enzim (unit/ml)* Waktu penyimpanan (hari) Unit/ml Selisih aktifitas (unit/ml) ** 2 632, ,63 33, , ,48 40, ,75 63, ,12 49,4 HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas ditentukan pada setiap waktu penyimpanan dengan kurva standar. Selisih aktivitas ditentukan terhadap nilai aktivitas sebelumnya

4 Perubahan nilai absorben blanko selama penyimpanan diperlihatkan pada Gambar 1.Nilai absorben blanko mulai naik setelah penyimpanan 4 sampai 9 hari, hal ini mungkin disebabkan manan pada lingkungan larutan substrat terhidrolisis pada lingkungan larutan daparnya. Hasil ini menunjukkan bahwa sebaiknya larutan substrat yang digunakan pada larutan yang disimpan 2-4 hari. Gambar 1. Perubahan nilai absorban blanko selama penyimpanan Kemudian nilai perubahan blanko dihubungkan dengan perubahan nilai absorben pada derat standar manosa 200 sampai 500 4g/ml (Gambar 2). Absorben standar manosa tersebut didapatkan setelah blanko dinolkan atau merupakan selisih nilai absorben standar terhadap blanko.nilai absorben deret sandar tidak dipengaruhi waktu penyimpanan dan nilai regresinya masih balk diatas 0,99 (Tabell). Walaupun data nilai blanko berubah selama waktu penyimpanan, dapat disimpulkan waktu penyimpanan tidak berpengaruh pada kurva standar bila blanko dinolkan. Gambar 2. Nilai absorban manosa pada berbagai waktu penyimpanan 1 85

5 Lokakarya Fungsional Non Peneli Analisis contoh enzim pada berbagai waktu penyimpanan menunjukkan dari nilai selisih yang terdekat pada 2 sampai 6 hari dihubungkan dengan nilai absorben blanko (Gambar 1) pada hari ke-4 sampai ke-6 masih menunjukkan garis linier atau analisis enzim mananase bisa dilakukan sampai hari ke-6 walaupun demikian data yang paling akurat didapatkan bila analisis enzim dilakukan pada hari yang sama dan tetap. KESIMPULAN 1. Nilai aktivitas enzim berubah sesuai dengan waktu penyimpanan substrat. 2. Nilai aktvitas contoh enzim turun pada analisis dengan substrat yang disimpan setelah hari ke Larutan substrat masih dapat dipergunakan sampai hari ke-6, tetapi data yang paling akurat didapatkan bila analisis dilakukan pada penyimpanan substrat dari had ke-2 sampai hari ke-4. DAFTAR BACAAN Abriyanto H Aktifitas mananase kapang hasil isolasi biji kelapa sawit dan palem raja. pada substrat Gum Ceratonia Siliqua (locust bean).laporan kerja praktek Akademi Kimia Analisis. Araujo, A. dan 0. P. Ward Extracellular mananases and galactanases from selected Fungi. J. Ind. Microbial. 6 : Miller, G. L Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for determination of Reducing sugar. Anal. Chem 31 :