REKAYASA GENETIKA TANAMAN CABAI (Capsicum annuum L.) TAHAN VIRUS MOSAIK KETIMUN (CMV)

Transkripsi

1 REKAYASA GENETIKA TANAMAN CABAI (Capsicum annuum L.) TAHAN VIRUS MOSAIK KETIMUN (CMV) Edy Batara Mulya Siregar Laboratorium Bioteknologi, Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara Abstrak Pemuliaan tanaman merupakan suatu usaha untuk memperbaiki sifat atau bentuk tanaman. Proses pemuliaan tanaman biasanya diawali dengan mendapatkan variabilitas genetik, melakukan kegiatan seleksi terhadap sumber genetik tersebut, melakukan persilangan-persilangan dan seleksi lanjutan. Hal ini menjadi masalah bila sifat yang diinginkan tidak terdapat pada sumber genetik tersebut, maka harus dicari dari sumber genetik lainnya. Keperluan akan varietas cabai yang bermutu, terutama yang mempunyai ketahanan terhadap penyakit virus sangat diperlukan dan dirasakan sangat mendesak. Telah pula diketahui bahwa pengendalian penyakit infeksi yang terbaik adalah dengan menggunakan varietas yang resisten. Menurut Hull (1990), terdapat tiga pendekatan untuk mencegah penurunan produksi akibat serangan virus, yaitu: (1) menghilangkan sumber infeksi, (2) mencegah penyebaran virus, dan (3) menggunakan varietas yang tahan. Penggunaan varietas tahan mempunyai keunggulan, yaitu secara ekonomi paling baik untuk petani, berwawasan lingkungan (mengurangi penggunaan pestisida), dan efektif untuk jangka panjang. Kata kunci: Rekayasa genetika, CMV A. Pendahuluan Tanaman cabai merupakan tanaman hortikultura yang penting di Indonesia. Bila dibandingkan dengan tanaman sayuran lainnya, tanaman cabai menempati pilihan utama yang ditanam petani. Total area tanaman cabai merupakan yang terbesar, yaitu mencapai luas hektar sampai tahun Jumlah ini kurang lebih 21,5 % dari total area seluruh pertanaman sayuran di Indonesia (BPS, 1999). Berdasarkan data-data permintaan dan produksi, diproyeksikan bahwa permintaan terus meningkat dengan laju 13 % setiap tahun. Jika produktivitas tidak ditingkatkan, maka pemerintah akan mengimpor produk segar cabai maupun produk hasil olahannya setiap tahun. Produktivitas tanaman cabai di Indonesia, yaitu rata-rata 2,6 ton per hektar merupakan produktivitas yang paling rendah di Asia Tenggara dengan rata-rata dapat mencapai 8-9 ton per hektar (BPS, 1999). Banyak faktor yang menyebabkan rendahnya produktivitas cabai di Indonesia, di antaranya adalah: penggunaan benih yang kurang bermutu, teknik budidaya yang belum sempurna, dan tingginya serangan hama dan penyakit. Fenomena serangan virus kompleks (dengan gejala keriting) pada tanaman cabai merupakan masalah yang telah lama dihadapi para petani cabai di Indonesia. Penyakit virus kompleks pada cabai merupakan penyakit virus yang disebabkan oleh infeksi lebih dari satu jenis virus tanaman. Tanaman cabai yang sakit diinfeksi oleh beberapa jenis virus, di antaranya yang dominan adalah virus mosaik ketimun (CMV), virus etch tembakau (TEV), virus moasik tembakau (TMV), virus Y kentang, dan chilli veinal mottle virus (CVMV). Setiap pertanaman cabai yang terinfeksi oleh penyakit ini tidak dapat menghasilkan buah yang dapat dipanen. Keparahan dan besarnya reduksi hasil panen akibat penyakit ini bergantung pada varietas tanaman, jumlah virus yang menginfeksi dan waktu infeksi di lapangan. Terjadinya infeksi yang lebih awal dan adanya infeksi 30

2 beberapa virus sekaligus akan menambah keparahan dan reduksi hasil panen. Puso (pertanaman terserang total) pada pertanaman cabai akibat infeksi virus kompleks sering kali terjadi. Telah diketahui bahwa budidaya cabai merupakan usaha tani yang berbiaya tinggi, sehingga resiko kegagalan harus dihindarkan. Oleh karena itu pengembangan pengendalian yang tepat terhadap infeksi virus mutlak diperlukan. Pemuliaan tanaman merupakan suatu usaha untuk memperbaiki sifat atau bentuk tanaman. Proses pemuliaan tanaman biasanya diawali dengan mendapatkan variabilitas genetik, melakukan kegiatan seleksi terhadap sumber genetik tersebut, melakukan persilangan-persilangan dan seleksi lanjutan. Hal ini menjadi masalah bila sifat yang diinginkan tidak terdapat pada sumber genetik tersebut, maka harus dicari dari sumber genetik lainnya. Telah dibuktikan bahwa teknik rekayasa genetik merupakan salah satu cara yang menjanjikan untuk mendapatkan tanaman yang resisten terhadap penyakit virus. Gen ketahanan tersebut berasal dari virus sendiri, yaitu gen CP CMV dan gen tersebut dapat dimasukkan ke dalam genom tanaman cabai. Keperluan akan varietas cabai yang bermutu, terutama yang mempunyai ketahanan terhadap penyakit virus sangat diperlukan dan dirasakan sangat mendesak. Telah pula diketahui bahwa pengendalian penyakit infeksi yang terbaik adalah dengan menggunakan varietas yang resisten. Menurut Hull (1990), terdapat tiga pendekatan untuk mencegah penurunan produksi akibat serangan virus, yaitu: (1) menghilangkan sumber infeksi, (2) mencegah penyebaran virus, dan (3) menggunakan varietas yang tahan. Penggunaan varietas tahan mempunyai keunggulan, yaitu secara ekonomi paling baik untuk petani, berwawasan lingkungan (mengurangi penggunaan pestisida), dan efektif untuk jangka panjang. Penggunaan gen pembungkus protein (gen CP) untuk pengendalian virus pertama kali dilaporkan oleh Powell-Abel et al. (1986) pada tanaman tembakau. Tanaman tembakau yang mengandung dan mengekspresikan gen CP TMV dapat menghambat infeksi virus TMV. Nelson et al. (1988) bahkan telah melakukan percobaan lapangan terhadap tomat transgenik yang mengandung gen CP TMV. Sejak laporan tersebut, berbagai tanaman transgenik yang mengandung berbagai gen CP telah diregenerasikan dan diuji resistensinya terhadap infeksi virus. Diantaranya adalah resistensi TMV pada tomat, resistensi AlMV pada alfalfa, resistensi PVY pada kentang dan tembakau, resistensi PStV pada kacang tanah, dan berbagai resistensi lain pada tanaman yang berbeda. Resistensi terhadap penyakit virus tanaman telah di-review secara vekstensif oleh Grumet (1990), dan Hull (1990). Tiga komponen kunci rekayasa genetik untuk mendapatkan tanaman cabai transgenik tahan virus adalah: (1) tersedianya gen antivirus (gen CP CMV), (b) tersedianya cara introduksi gen CP ke dalam genom tanaman cabai dan regenerasi cabai transgenik, serta (c) ekspresi gen CP pada tanaman transforman. Dua komponen, yaitu komponen (2) dan (3) pada tanaman cabai telah diteliti pada penelitian sebelumnya (Siregar et al., 1997, Siregar & Sudarsono, 1997). Kedua metode untuk komponen (2) dan (3) telah dibakukan Proyek RUT IV dan Graduate Team Research Batch II), sehingga bila komponen (a) yang diperlukan tersedia maka rekayasa genetik tanaman cabai tahan virus dapat dilaksanakan. Laboratorium Virologi Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan dan Pusat Kajian Pengandalian Hama Terpadu Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor telah mengadakan serangkaian penelitian untuk mendapatkan tanaman cabai tahan virus, baik melalui pendekatan pemuliaan maupun dengan teknik rekayasa genetik (Proyek RUT, Hibah Bersaing, Graduate Team Research, dan kegiatan penelitian rutin lainnya). Pada penelitian dilaksanakan kegiatankegiatan untuk menghasilkan gen anti virus, 31

3 yaitu gen CP CMV sehingga tersedia untuk digunakan dalam rekayasa genetik tanaman cabai. Gen ketahanan tersebut diintroduksikan ke dalam genom tanaman cabai, sehingga dihasilkan tanaman cabai transgenik yang tahan terhadap infeksi virus CMV. Kegiatan penelitian ini juga merupakan usaha untuk mengatasi serangan penyakit virus kompleks pada tanaman cabai dengan menggunakan tanaman cabai transgenik tahan virus. Selain itu, kegiatan penelitian ini juga merupakan usaha untuk mengembangkan sumberdaya manusia terampil untuk menghasilkan sesuatu yang orisinil Indonesia. Kegunaan dan Tujuan Khusus Hasil penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan gen anti virus (gen CP CMV) sehingga dapat digunakan dalam rekayasa genetik tanaman, khususnya tanaman cabai. Gen CP CMV tersebut juga dapat dimasukkan ke tanaman lain yang biasa diinfeksi oleh virus CMV. Pengembangan sumberdaya manusia yang terampil dalam bidang rekayasa genetik tanaman juga merupakan kegunaan dari penelitian. Tujuan khusus penelitian adalah: 1. Menyediakan gen anti virus CMV (gen CP CMV) 2. Menghasilkan vektor transforman yang mengandung gen CP CMV 3. Menghasilkan planlet tanaman cabai transgenik yang mengandung gen CP CMV. Introduksi Gen CP CMV ke dalam Genom Tanaman Cabai Kegiatan penelitian ini meliputi persiapan kultur bakteri, kokultivasi, seleksi, dan pemeliharaan kultur. Tiga kultivar cabai, yaitu Tit L. Super, Jatilaba, dan Laris digunakan sebagai bahan tanaman percobaan. Daun dari kecambah cabai in vitro yang berumur 21 hari digunakan sebagai eksplan untuk dikokultivasi. Pada percobaan diuji pengaruh tingkat populasi bakteri, waktu inokulasi, waktu kokultivasi dan pengaruh pre-kultur sebelum eksplan dikokultivasi. Sebagai penyeleksi adalah antibiotik hygromycin untuk menekan pertumbuhan sel tanaman asal sehingga sel transgenik dapat tumbuh dan dapat dibedakan dari sel yang lain. Konsentrasi antibiotik tersebut diuji untuk mendapatkan efisiensi seleksi hasil kokultivasi. Analisis Molekuler Tanaman Transgenik Tanaman trasngenik yang diperoleh dianalisis secara molekuler untuk membuktikan adanya integrasi gen CP CMV yang diintroduksikan. Deteksi integrasi gen nptii dan gen CP CMV dilakukan dengan teknik PCR. Susunan primer dan kondisi PCR yang digunakan disesuaikan dengan susunan dan kondisi PCR yang telah dipublikasikan. Uji Ketahanan Tanaman Transgenik Kegiatan ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan tanaman transgenic yang diperoleh terhadap sejumlah strain virus CMV. Bahan tanaman transgenik yang diuji diperoleh dengan cara sebagai berikut: tanaman transgenik pertama (R 0 ) yang diperoleh dari kultur diaklimatisasi dan ditanam pada pot di rumah kasa tertutup. Benih R 1 (generasi F 1 ) dikumpulkan dari tanaman R 0. Masing-masing sebanyak 20 buah tanaman R 1 yang berumur 21 hari digunakan untuk pengujian. Inokulasi dilakukan secara mekanik sesuai prosedur yang ada. Tiga minggu setelah inokulasi daun pucuk tanaman cabai dianalisis dengan teknik ELISA. Pola Pewarisan Gen CP CMV pada Tanaman Cabai Pola pewarisan gen CP CMV yang terdapat pada tanaman transgenik dipelajari untuk mengetahui bagaimana pewarisan gen CP CMV. Studi pola pewarisan gen CP CMV pada tanaman cabai transgenik yang diperoleh akan dilakukan sampai keturunan R2. Kegiatan penelitian ini juga akan dapat mengetahui kestabilan integrasi gen CP CMV pada genom tanaman cabai. 32

4 B. Metode Penelitian 1. Introduksi Gen CP CMV ke dalam Genom Tanaman Cabai Esplan daun tanaman cabai yang berumur 21 hari dikokutivasi dengan kultur bakteri Agrobacterium dengan cara merendam eksplan di dalam suspensi bakteri selama 5 menit. Kemudian eksplan dikulturkan pada media regenerasi, yaitu media dasar MS yang ditambahkan BAP (4 mg/l) dan IAA (0.25 mg/l), antibiotik penyeleksi (50 dan 100 mg/l; sesuai perlakuan). Jumlah antibiotik yang ditambahkan pada media merupakan bagian percobaan untuk mengetahui efisiensi transformasi. Selain itu pada media juga ditambahkan antibiotik cefotaxime (500 mg/l) untuk membunuh agrobacterium. Eksplan disubkultur ke dalam media seleksi yang masih segar setiap tujuh hari sekali. Semua kultur diinkubasikan dalam ruang Kultur dengan intensitas penyinaran lux selama 24 jam. Suhu ruangan diatur sehingga berkisar antara C. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah eksplan yang hidup, jumlah eksplan yang beregenerasi, dan jumlah tunas yang terbentuk. Percobaan juga dilakukan untuk mengetahui pengaruh tingkat populasi bakteri (OD600 = 0,2 dan OD600 = 0,5), waktu inokulasi (2.5 dan 5 menit), waktu kokultivasi (0, 1, dan 2 hari) dan pengaruh pre-kultur (1, 2, dan 3 hari) sebelum eksplan dikokultivasi. 2. Analisis Molekuler Tanaman Transgenik Tanaman transgenik yang diperoleh dianalisis secara molekuler untuk membuktikan adanya integrasi gen CP CMV yang diintroduksikan. Deteksi integrasi gen nptii dan gen CP CMV dilakukan dengan teknik PCR. Susunan primer dan kondisi PCR yang digunakan disesuaikan dengan susunan dan kondisi PCR yang telah dipublikasikan. DNA diisolasi dari tanaman putatif transgenik dan kontrol dengan metode CTAB mengikuti Murray & Thompson (1980). Pada analisis molekuler digunakan polimerase amplitaq yang berasal dari Perkin Elmer Cetus. Reaksi dilakukan dalam volume 10 ul yang terdiri atas 1 ul DNA tanaman, dntps 0.2 mm (Perkin Elmer), MgCl mm (Perkin Elmer), bufer PCR (Tris-HCl 20 mm, 50 mm KCl), primer um dan Taq DNA polymerase 2.5 unit (Perkin Elmer). Susunan primer gen nptii yang digunakan adalah: 5 CAA GAT GGA TTG CAC GCA GGT TC 3 dan 5 TCC AGA TCA TCC TGA TCG ACA AG 3 yang akan menghasilkan fragmen amplifikasi sebesar 465 bp. Kondisi PCR untuk amplifikasi gen nptii dilakukan sebanyak 30 siklus, setiap siklus terdiri atas 94 0 C selama 1 menit, 55 0 C selama 1 menit, dan 72 0 C selama 2 menit. Hasil amplifikasi PCR kemudian dimigrasikan pada gel agarose-ethidium bromide 1.5 % dengan bufer TBE. Hasil migrasi diamati dengan sinar UV (panjang gelombang 300 nm), didokumentasi dengan kamera polaroid dan untuk penanda ukuran fragmne DNA digunakan penanda 1.0 kb ladder (Promega). 3. Uji Ketahanan Tanaman Transgenik Kegiatan ini bertujuan untuk mengetahui ketahanan tanaman transgenik yang diperoleh terhadap sejumlah strain virus CMV. Bahan tanaman transgenik yang diuji diperoleh dengan cara sebagai berikut: tanaman transgenik pertama (R 0 ) yang diperoleh dari kultur diaklimatisasi dan ditanam pada pot di rumah kasa tertutup. Benih R 1 (generasi F 1 ) dikumpulkan dari tanaman R 0. Masing-masing sebanyak 20 buah tanaman R 1 yang berumur 21 hari digunakan untuk pengujian. Inokulasi dilakukan secara mekanik sesuai prosedur yang ada. Tiga minggu setelah inokulasi daun pucuk tanaman cabai dianalisis dengan teknik ELISA. Prosedur yang dilakukan sesuai dengan petunjuk pada Agdia PathoScreen Kit DAS ELISA Peroxidase. Hasil yang diperoleh kemudian dibaca dengan alat ELISA READER pada panjang gelombang 490 nm. 4. Pola Pewarisan Gen CP CMV pada Tanaman Cabai Pola pewarisan gen CP CMV yang terdapat pada tanaman transgenik dipelajari untuk mengetahui bagaimana pewarisan gen CP 33

5 CMV. Studi pola pewarisan gen CP CMV pada tanaman cabai transgenik yang diperoleh akan dilakukan sampai keturunan R 2. Kegiatan penelitian ini juga akan dapat mengetahui kestabilan integrasi gen CP CMV yang diinsersikan pada genom tanaman cabai. C. Hasil dan Pembahasan Semua tunas yang diperoleh selanjutnya disubkultur pada media pembesaran dan Tabel 1. pemanjangan tunas dengan media dasar MS yang mengandung BAP (1 mg/l), AgNO 3 (5 mg/l), GA 3 (2 mg/l) dan Ca-P (2 mg/l). Tanaman putatif transgenik yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara molekuler untuk membuktikan introduksi gen yang ditransformasikan. Analisis molekuler masih menunggu tunas tanaman membesar dan lengkap menjadi tanaman. Respons Eksplan Daun Cabai CV. Tit L. Super terhadap Konsentrasi Antibiotik Kanamycin yang Digunakan untuk Menyeleksi Eksplan. Inokulasi Eksplan Dilakukan dengan Merendam dalam Suspensi Bakteri Selama 5 Menit dengan Jumlah Populasi Bakteri pada OD600 = 0.5. Eksplan Dikultur pada Media Regenerasi yang Mengandung Antibiotik Penyeleksi. Konsentrasi Kanamycin (mg/l) Tunas per Eksplan *) (73.6 %) (53.1 %) 1.3 Tabel 2. Respons Eksplan Daun Cabai CV. Tit L. Super terhadap Dua Populasi Bakteri yang Digunakan untuk Menginokulasi Eksplan. Inokulasi Eksplan Dilakukan dengan Merendam dalam Suspensi Bakteri Selama 5 Menit. Eksplan Dikultur pada Media Regenerasi yang Mengandung Antibiotik Penyeleksi. Populasi Bakteri OD 600 = *) (26.5%) 1.8 OD 600 = (23.5%) 1.5 Tabel 3. Respons Eksplan Daun Cabai CV. Tit L. Super terhadap Dua Waktu Inokulasi yang Digunakan untuk Menginokulasi Eksplan. Inokulasi Eksplan Dilakukan dengan Merendam dalam Suspensi Bakteri. Populasi Bakteri yang Digunakan adalah OD600 = 0.5. Eksplan dikultur pada Media Regenerasi yang Mengandung Antibiotik Penyeleksi. Lama Inokulasi (menit) *) 10 0 (0%) (71.9%) 1.5 Tabel 4. Respons Eksplan Daun Cabai CV. Tit L. Super terhadap Tiga Waktu Kokultivasi yang Digunakan untuk Menginokulasi Eksplan. Inokulasi Eksplan Dilakukan dengan Merendam dalam Suspensi Bakteri Selama 5 Menit. Populasi Bakteri yang Digunakan adalah OD600 = 0.5. Eksplan Dikultur pada Media Regenerasi yang Mengandung Antibiotik Penyeleksi. Lama Kokultivasi (hari) *) 64 42(65.6%) (37.5%)

6 Tabel 5. Respons Eksplan Daun Cabai CV. Tit L. Super terhadap tiga Waktu Perlakuan Pre-Kultur Eksplan Sebelum Inokulasi Eksplan Dilakukan. Inokulasi Eksplan Dilakukan dengan Merendam dalam Suspensi Bakteri Selama 5 Menit. Populasi Bakteri yang Digunakan adalah OD600 = 0.5. Eksplan Dikultur pada Media Regenerasi yang Mengandung Antibiotik Penyeleksi. Lama Pre- Kultur (hari) *) 72 45(62.5%) (62.1%) (55.2%) 1.2 D. Daftar Pustaka Agrios, G.N., Plant Pathology. Second Edition. Academic Press. New York. P Brunt, A.A., Crabtree, K., Dallwitz, M.J., Gibbs, A.J., Watson, L. and Zurcher, E.J., Plant Viruses Online: Descriptions and Lists from the VIDE Database.Version:20thAugust URL.( au/groups/m ES/vide/). Chabbouh, N. and C. Cherif, Cucumber Mosaic Virus in artichoke. FAO Plant. Prot. Bull. 38: Clark, M.F. and Adams, A.N., Characteristic of the Microplate Method of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the Detection of Plant Viruses. J. Gen. Virol Dixon, G.R., Vegetable Crop Diseases. First American Edition. The AVI Publishing Company. Inc. Westport, Connecticut. Hong Kong. Duriat, A.S. dan S. Sastrosiswojo, Pengendalian Hama Penyakit Terpadu Pada Agribisnis Cabai. Dalam Santika, A. (Editor). Agribisnis Cabai. Penebar Swadaya. Jakarta. Francki, R.I.B., D.W. Mossop and T. Hatta, Cucumber Mosaic Virus. CM1/AAB Description of Plant Viruses. No Kaper, J.M and M.E. Tousignant, Cucumber Mosaic Virus Assosiated RNA-5. I. Role of Host Plant and Helper Strain in Determining Amount of Associated RNA-5 with Virions. Virology. 80: MacNab, A.A., A.F. Sherf and J.K. Springer, Identifying Diseases of Vegetables. The Pennsylvania State University. Mashari, M.A., Virus Si Biang Penyakit Tanaman. Majalah Pertanian Abdi Tani. Wahana Informasi Pertanian. Surabaya. (Vol. 4. No. 3 / Edisi XVI Juli.). Murant, A.F. and A.M. Mayo, Satellites of Plant Viruses. Ann. Rev. Phytophatologi. 20: Provvidenti, R., R.W. Robinson and J.W. Shail, A Source of Resistance to A Strain of CMV in Lactucia saligna L. Hort Scpence, 15: Rist, D.L and J.W. Lorbeer, Occurrence and Overwintering of CMV and Broad Bean Wilt Virus in Weeds Growing Near Commercial Lettuce Field in New York. Phytophatology. 79: Russels, G.E Plant Breeding for Pest and Disease Resistance. Butterworths. Toronto. 427p. Setiadi, Bertanam Cabai. Penebar Swadaya. Jakarta. Siregar, E.B.M, Assosiasi Virus Mosaik Ketimun-Satelit RNA-5 dalam Memproteksi Tanaman Tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) dan Cabai Merah (Capsicum annuum L.) Terhadap Virus Mosaik Ketimun 35

7 Patogenik. Laporan Penelitian Program Pascasarjana. IPB. Watterson, J.C., Development and Breeding of Resistance to Pepper and Tomato Viruses. Pp In Kyle, M.M. (Editor). Resistance to Virus Diseases of Vegetable. Timber Press, Oregon. 36