BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Survei dan Identifikasi Virus yang Menginfeksi Mentimun Pengambilan Sampel

Transkripsi

1 9 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan sejak Februari 2011 sampai Agustus Penelitian dilaksanakan di rumah kaca Institut Pertanian Bogor di Cikabayan, Dramaga dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Survei dan Identifikasi Virus yang Menginfeksi Mentimun Pengambilan Sampel Sampel berasal dari pertanaman mentimun milik petani di desa Situgede, Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor. Daun mentimun yang dikumpulkan sebagai sampel adalah daun yang menunjukkan gejala terserang virus. Sampel daun dibedakan berdasarkan tipe gejalanya yaitu bintik kuning, mosaik kuning, mosaik hijau, mosaik hijau-kuning, mosaik hijau keriting, mosaik kuning-hijaukeriting, dan keriting. Deteksi Virus pada Sampel Daun dari Lapangan Infeksi virus diidentifikasi dengan metode ELISA tidak langsung (indirect ELISA) dengan menggunakan beberapa antiserum yaitu antiserum untuk CMV, ZYMV, SqMV, WMV, dan TRSV. Penggunaan beberapa jenis antiserum tersebut bertujuan untuk mengetahui jenis-jenis virus yang menyerang tanaman mentimun di lapangan. Pengujian ini juga untuk menentukan isolat SqMV yang akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut. Perbanyakan Inokulum SqMV Inokulum SqMV diperbanyak pada tanaman mentimun dengan cara penularan mekanis. Isolat SqMV diperoleh dari sampel daun yang positif terinfeksi SqMV dan memiliki titer virus paling tinggi. Cairan perasan tanaman (sap) ditularkan pada tanaman mentimun yang berumur tujuh hari setelah tanam.

2 10 Sap tanaman dipersiapkan dengan menggerus sebanyak 0.2 g daun dalam bufer fosfat dengan perbandingan 1:10 (b/v). Inokulasi dilakukan pada kotiledon tanaman yang telah ditaburi dengan karborundum (600 mesh) dengan cara mengoleskan sap tanaman sakit pada permukaan kotiledon dengan menggunakan jari. Setelah pengolesan, kotiledon tersebut dibilas dengan aquades mengalir (Bos 1990). Tanaman yang telah diinokulasi dipelihara dan diamati gejala yang timbul. Setelah empat belas hari, daun yang menunjukkan gejala dipanen dan diawetkan menggunakan nitrogen cair lalu disimpan pada suhu C. Penanaman dan Pemeliharaan Tanaman Mentimun Penanaman Benih Media tanam disiapkan yaitu berupa campuran tanah dan pupuk kandang (1:1) yang telah disterilkan dengan mengunakan otoklaf. Polybag berukuran 35 cm x 35 cm diisi dengan media sebanyak tiga per empat bagian. Benih mentimun yang akan ditanam terlebih dahulu direndam dalam fungisida selama 1 jam lalu ditiriskan. Benih lalu ditanam pada polibag yang telah disiapkan dalam kondisi basah. Benih ditanam pada kedalaman 3 cm dengan letak calon akar (bagian yang runcing) berada di bagian bawah. Benih mentimun yang digunakan berasal dari toko pertanian, terdiri dari lima varietas yaitu Vario F1, Calista F1, Venus, Yupiter, dan Japan file. Penggunaan varietas-varietas tersebut didasarkan pada varietas yang banyak digunakan oleh petani, mudah diperoleh, dan banyak dikonsumsi masyarakat. Pemupukan dan Penyiraman Pupuk NPK 15:15:15 diberikan dua tahap. Tahap pertama diberikan 1 minggu setelah inokulasi. Pemupukan tahap kedua diberikan ketika tanaman memulai masa generatif yaitu ketika terjadi pemunculan bunga pertama. Pada masa pengisian buah, tanaman disemprot dengan pupuk Gandasil B. Penyiraman dilakukan setiap pagi hari. Air diberikan pada tanaman di dalam polibag sehingga air tidak dapat tersimpan. Penyiraman harus diberikan sesuai kebutuhan tanaman dan memenuhi standar waktu, cara, dan jumlah yang tepat.

3 11 Pengikatan dan Pemangkasan Tanaman mulai diikat pada umur 2 minggu setelah tanam (MST). Batang mentimun diikat pada tali sehingga tanaman dapat merambat (Gambar 2a). Pemangkasan dilakukan terhadap wiwilan (kuncup daun yang hanya menghasilkan daun). Cabang anakan diatur agar tidak mengganggu tanaman di dekatnya, caranya adalah dengan memangkas bagian pucuk cabang anakan sehingga pertumbuhan diarahkan pada pembesaran buah. Pemanenan Mentimun yang ditanam dapat berbuah pada usia 32 sampai 50 hari tergantung varietas (Lampiran 1). Buah yang dipanen untuk kepentingan konsumsi adalah buah yang telah matang penuh ditandai dengan warna hijau yang seragam (Gambar 2b). Pemetikan dapat dilakukan dengan memotong sebagian tangkai atas. Pemetikan dapat dilakukan dengan bantuan gunting atau pisau sehingga bidang potong rata dan beraturan. Pemetikan dapat dilakukan setiap hari, karena proses pematangan buah berlangsung 7 sampai 10 hari setelah bunga mekar. Buah yang dipanen dengan kepentingan sebagai benih adalah buah mentimun yang tua, ditandai dengan warna kulit buah sudah putih atau kuning tergantung varietas. a b Gambar 2 Tanaman merambat pada tali yang disediakan (a) ; Buah mentimun siap panen (b)

4 12 Inokulasi SqMV pada Lima Varietas Mentimun Inokulasi dilakukan pada tanaman berusia 7 hari setelah tanam. Sumber inokulum adalah daun sampel tanaman yang telah diuji dan positif terinfeksi SqMV. Tahapan inokulasi diawali dengan persiapan sap tanaman. Sebanyak 0.2 g daun digerus dalam bufer fosfat dengan perbandingan 1:10 (b/v). Inokulasi dilakukan pada kotiledon tanaman yang telah ditaburi dengan karborundum (600 mesh) dengan cara mengoleskan sap tanaman sakit pada permukaan kotiledon dengan menggunakan jari. Setelah pengolesan, kotiledon tersebut dibilas dengan aquades mengalir (Bos 1990). Tahapan inokulasi dilakukan terhadap lima varietas tanaman. Jumlah tanaman yang diinokulasi adalah 10 tanaman untuk setiap varietas. Pengamatan dilakukan terhadap masa inkubasi dan kejadian penyakit. Masa inkubasi adalah waktu gejala pertama kali muncul setelah tanaman diinokulasi. Kejadian penyakit untuk setiap varietas dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Jumlah tanaman terserang % kejadian penyakit = x 100% Jumlah tanaman Pengamatan terhadap perkembangan penyakit mosaik dilakukan dengan mengamati perkembangan gejala yang muncul dan pengukuran titer virus pada masa vegetatif, masa berbunga, dan masa berbuah. Pengukuran titer virus dilakukan dengan metode indirect-elisa. Deteksi SqMV Terbawa Benih SqMV dilaporkan sebagai patogen terbawa benih. Pada penelitian ini dilakukan pengujian untuk mengetahui jumlah benih yang membawa SqMV. Pengujian terhadap benih dibedakan menjadi dua bagian yaitu pengujian terhadap benih yang dibeli dari toko pertanian (F1) dan pengujian terhadap benih dari tanaman percobaan di rumah kaca (F2). Benih diuji dengan metode growing-on test yaitu benih ditumbuhkan pada media tanam di tempat pembibitan hingga berusia 7 hari setelah tanam (Gambar 3). Bagian tanaman (bibit) yang digunakan untuk pengujian adalah daun pertama yang muncul.

5 13 Total benih yang diuji untuk setiap varietas mentimun berjumlah 30 benih. Deteksi SqMV dilakukan dengan metode DIBA (Dot Immunobinding Assay). Persentase virus terbawa benih dihitung dengan rumus sebagai berikut: Jumlah benih terinfeksi % virus terbawa benih = x 100% Jumlah benih yang ditanaman Gambar 3 Benih ditanam pada baki persemaian (growing on test) Metode Indirect-ELISA Metode ELISA tidak langsung dilakukan berdasarkan prosedur umum Indirect ELISA (Agdia Inc, Indiana USA). Teknik deteksi diawali dengan tahapan persiapan antigen. Antigen disiapkan dengan menggerus 0.2 g daun mentimun dalam plastik tebal dan ditambah GEB (General Extract Buffer) ph 7.4. Perbandingan daun dengan GEB adalah 1:10 (b/v). Sebanyak 100 µl antigen diisikan pada sumuran plat mikrotiter, kemudian diinkubasi semalaman pada suhu 4 0 C. Setelah inkubasi, cairan dalam plat mikrotiter dibuang dan diisi dengan 100 µl bloking solution yaitu skim milk 2%. Penggunaan bloking solution berfungsi untuk menutupi bagian sumuran yang tidak berikatan dengan antigen virus. Plat mikrotiter lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 0 C kemudian dicuci menggunakan 200 µl PBST (phosphate buffer saline tween-20) sebanyak lima kali. Tahap deteksi selanjutnya adalah menyiapkan antiserum SqMV yaitu dengan mengencerkan antiserum SqMV dalam conjugate buffer dengan perbandingan 1:200. Sebanyak 100 µl antiserum diisikan ke dalam setiap sumuran plat mikrotiter lalu diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 0 C. Plat mikrotiter dicuci kembali dengan PBST sebanyak lima kali. Masing-masing

6 14 sumuran lalu diisi dengan 100 µl campuran antibodi kedua (goat anti rabbit-igg, Agdia). Antibodi ini telah dilabel dengan phosphatase dan diencerkan dalam conjugate buffer dengan perbandingan 1:5000. Plat mikrotiter diinkubasi kembali selama 2 jam pada suhu 37 0 C lalu dicuci dengan PBST. Tahap deteksi selanjutnya adalah mengisi plat mikrotiter dengan 100 µl substrat PNP (paranitrophenyl phosphate) dan diinkubasi selama 30 sampai 60 menit pada suhu ruang. Apabila warna berubah kuning, maka reaksi segera dihentikan dengan 50 µl NaOH 3 M. Hasil ELISA diukur dengan menggunakan ELISA reader (Bio-rad model 550 microplate reader) pada panjang gelombang 405 nm. Hasil ELISA dinyatakan positif jika nilai absorbans sampel yang diuji 2 kali lebih besar dari nilai kontrol negatif tanaman sehat (Matthews 1993). Metode DIBA (Dot Immunobinding Assay) Metode DIBA dilakukan berdasarkan Mahmood et al dalam Opriana Membran nitroselulosa (Hybond TM P, Amersham Bioscience UK) sebelum digunakan direndam dalam metanol 100% selama 10 detik dan dikering anginkan. Jaringan daun tanaman yang diduga terinfeksi SqMV digerus dalam tris buffer saline (TBS) dengan perbandingan 1:10 (b/v) (TBS: Tris-HCl 0.02 M dan NaCl 0.15 M, ph 7.5). Cairan perasan tanaman tersebut selanjutnya diteteskan ke atas membran nitroselulosa sebanyak 10 µl. Setelah tetesan sampel kering, membran direndam di dalam 10 ml larutan blocking non fat milk 2% dalam TBS yang mengandung Triton X-100 dengan konsentrasi akhir 2%. Membran kemudian diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm selama 2 jam dengan menggunakan shaker (EYELA multi shaker MMS). Membran kemudian dicuci 5 kali dengan dh 2 O, tiap pencucian berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung antibodi SqMV 5 µl ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran diinkubasi semalam pada suhu kamar sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan Tween 0,05% dalam TBS (TBST). Membran selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung

7 15 konjugat 5 µl (goat anti rabbit-igg, Agdia) ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran diinkubasi selama 60 menit sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran selanjutnya dicuci kembali dengan TBST, kemudian membran direndam selama 5 menit dalam substrate buffer (Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.1 M dan MgCl 5 mm) yang mengandung nitro blue tetrazolium (NBT) 66 µl dan bromo chloro indolit phosphate (BCIP) 30 µl. Bila reaksi positif akan terjadi perubahan warna putih menjadi ungu pada membran nitroselulosa yang telah ditetesi cairan perasan tanaman dan reaksi dapat dihentikan dengan merendam membran dengan dh 2 O.