Metode Imunokimia untuk analisis senyawa aktif

Transkripsi

1 Metode Imunokimia untuk analisis senyawa aktif Marlia Singgih Wibowo School of Pharmacy Institut Teknologi Bandung

2 Analisis Imunokimia Berdasarkan prinsip reaksi spesifik antara Antigen-Antibodi Penggunaan senyawa penanda (label) untuk visualisasi reaksi Deteksi menggunakan metode fisiko-kimia

3 Prinsip Reaksi : meniru reaksi imunologi dalam tubuh Reaksi imunologi di dalam mamalia : Ag memicu Ab Reaksi primer Reaksi sekunder (Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi) Reaksi tersier (degranulasi,opsonisasi)

4 Mengapa reaksi Antigen-Antibodi? Reaksi dan kekuatan antibodi untuk specific and reproducible protein binding Prinsip reaksi : immunoassays

5 Antigen-Antibody Interaction for analysis SUBSRATE Complex Ag-Ab-Label PRODUCT (visualized)

6 Metode analisis berbasis imunokimia Imunopresipitasi Imunoaglutinasi Imunokimia berlabel : EIA/ELISA (Enzyme ImmunoAssay) RIA (Radio ImmunoAssay) IFA (ImmunoFluorescence Assay) LIA (Luminescence Immuno Assay) dll

7 Antigen (antibody generator) Senyawa atau kompleks senyawa yang dapat menginduksi sistem imun mamalia Sifat : Imunogenik : induksi/stimulasi sistem imun mamalia Antigenik : bereaksi spesifik dengan antibodi Syarat antigen: High Molecular Weight (>5000), chemical structure Complex Jika MW < 5000, supaya bersifat imunogenik dan antigenik dapat dikonjugasi dengan suatu protein untuk meningkatkan immunogenicity

8 Yang dapat menjadi antigen Mikroba patogen dan atau toksin mikroba Toksin tanaman, hewan Protein spesifik atau senyawa lain yang berstruktur spesifik Senyawa obat (narkotik, psikotropik), tidak imunogenik, tetapi dapat dikonjugasi dengan suatu protein carrier (contoh : BSA) Senyawa pestisida, dll.

9 Apakah Antibodi? Antibodi adalah protein yang disekresi oleh sel plasma limfosit B akibat stimulasi molekul asing (antigen) pada reseptor antigen limfosit B Spesifik terhadap antigen yang memicunya Antibodi adalah molekul-molekul glikoprotein yang dikenal sebagai immunoglobulin: IgA, IgD, IgM, IgE, IgG

10 SIFAT UMUM ANTIBODI Antibodi memiliki spesifisitas dan aktivitas biologi Struktur Antibodi : Dua fragmen tempat berikatannya antigen secara spesifik, disebut sebagai fragmen Fab (fragment antigen binding) yang univalen, masing-masing memiliki satu situs pengikatan dan identik satu sama lain dalam segala hal Fragmen ketiga adalah Fc (Fragment crystallisable), fragmen yang dapat dikristalkan, tidak berikatan dengan antigen, tetapi bertanggung jawab untuk fungsi biologik molekul antibodi setelah antigen berikatan dengan daerah Fab dari molekul utuh

11 Struktur Antibodi Terdiri dari dua rantai berat (heavy chain = H) dan dua rantai ringan (light chain = L). Rantai H IgG ( ) memiliki massa molekul sekitar kda, sementara rantai H IgM (μ) memiliki massa molekul sekitar kda. Rantai L (dengan massa molekul kda) memiliki isotype kappa atau lambda dan ditemukan berikatan dengan seluruh kelas rantai H. Rantai peptida ini berikatan melalui ikatan non-kovalen dan jembatan kovalen disulfida. Ikatan disulfida ini relatif terekspos dan oleh karena itu dapat mudah di reduksi atau oksidasi.

12 Domain konstan (Fc) IgG dan IgM dapat berinteraksi dengan sel dan sistem efektor dalam tubuh, dan domain variabel (Fab) nya dapat berinteraksi dengan antigen. Lokasi pada struktur antigen tempat berikatan dengan antibodi disebut epitope atau disebut antigenic determinant, sedangkan lokasi pada struktur antibodi yang dapat berikatan dengan antigen disebut paratop.

13 IgG and IgM IgG IgM

14 Specificity and Selectivity Monoclonal Antibody Polyclonal Antibody Recombinant Monoclonal Antibody

15 KELEBIHAN ANTIBODI MONOKLONAL DIBANDINGKAN POLIKLONAL Dapat menjamin keseragaman kandungan antibodi yang dihasilkan karena berasal dari satu jenis klon saja yang diproduksi secara berulang dari suatu kumpulan sel hibrid yang telah diseleksi sebelumnya. Mengurangi kemungkinan terjadinya reaksi silang atau reaksi nonspesifik seperti yang dapat terjadi pada penggunaan antibodi poliklonal. Kekuatan atau afinitas kecepatan reaksi antigen-antibodi monoklonal umumnya lebih kuat dibandingkan dengan ikatan antigen-antibodi poliklonal. Proses pemurnian lebih mudah karena relatif lebih sedikit jenis kandungan antibodinya. Dapat digunakan untuk tujuan terapi yaitu antara lain untuk perbaikan overdosis obat, mengurangi resiko transplantasi organ, deteksi tumor metastasis, dan sebagai obat target sitotoksik.

16

17 Teknik lain untuk produksi antibodi monoklonal Teknologi Antibody Expression Libraries, yaitu konstruksi cdna dari mrna yang diisolasi dari sel B manusia atau murine Gen IgG diamplifikasi dengan cara PCR, lalu rantai berat dan ringan nya dikonstruksi dengan cara digesti dan insersi ke dalam bakteriofaga atau plasmid yang sesuai. Rekombinasi random terjadi, lalu diekspresi di dalam bakteri, skrining dengan western blot Klon yang positif diisolasi dan diperbanyak untuk menghasilkan antibodi Fab yang murni Mudah melakukan kimerisasi, perubahan afinitas,dan modifikasi fungsi efektor

18 Penggunaan Prinsip reaksi Antigen-Antibodi di bidang Farmasi Clinical Diagnosis, misalnya Serodiagnosis untuk Penyakit Infeksi Drug Monitoring and Toxicology Cancer Research Proteomic Study

19 KINETIKA INTERAKSI ANTIGEN-ANTIBODI

20 Antigen-Antibody Interaction

21 Prinsip ELISA (Enzyme Linked-Immunosorbent Assay) Antigen Antibodi Kompleks Ag- Ab Konjugat enzim pada Ag-Ab Substrat Reaksi enzimatik Produk berwarna

22 Kinetika reaksi Antigen-Antibodi Reaksi reversibel k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 k1 dan k2 adalah konstanta laju asosiasi dan disosiasi

23 Laju pembentukan kompleks Ag-Ab : d (Ag-Ab) dt = k1(ag) (Ab) k2 (Ag-Ab) k1/k2 = (AgAb) (Ag) (Ab) = K (konstanta kesetimbangan) Bila antibodi memiliki aviditas atau afinitas tinggi, maka K tinggi, demikian sebaliknya

24 B/F (rasio terikat dan bebas) 5.00 Bila F adalah antigen bebas, dan B adalah antigen yang terikat, Abx adalah konsentrasi awal Ab,maka pada kesetimbangan : K = k1/k2 = (Ag-Ab)/(Ag)(Ab) = B / F [(Abx)-B] Slope = -K, potongan dgn x adalah b, potongan dgn y adalah Kb Jadi B/F = K [(Abx)-B] B (terikat)

25 Reaksi pada permukaan bahan padat dan cair Kebanyakan metode imunokimia yang ada dibuat dalam media/fase padat (solid phase) untuk memudahkan proses pemisahan dalam percobaan yang heterogen Ketika antigen diimobilisasi pada fase padat, ikatan antibodi tergantung pada laju difusi dan ikatan pada konsentrasi diatas 1 pmol/cm2 dipengaruhi oleh interaksi sterik

26 Reaksi pada fase padat memiliki laju reaksi intrinsik dan reaksi balik yang lebih kecil dibandingkan reaksi di dalam larutan Oleh karena itu reaksi Ag-Ab pada fase padatcair secara praktis merupakan reaksi irreversibel

27 Parameter analisis Sensitivitas Spesifisitas Selektivitas Hal yang mempengaruhi parameter : Reaksi silang Adanya senyawa yang mempengaruhi aviditas reaksi Ag-Ab, misalnya garam, urea

28 Bagaimana menentukan jenis analisis imunokimia berlabel? Reaktan apa yang akan diberi label, antigen (analit) atau antibodi? Apakah antigen atau antibodi yang akan ditentukan? Apakah analisis kompetitif atau nonkompetitif? Apakah sistem analisis homogen atau heterogen?

29 Pengelompokkan jenis analisis imunokimia 1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan analit yang diberi label 2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan antibodi yang diberi label 3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi langsung kompleks imun 4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan reaksi khusus yang berlebih 5. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi spesifik 6. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag-Ab merupakan penguatan sinyal

30 1. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan analit yang diberi label : Analisis ini mirip dengan analisis radiokimia klasik, melibatkan penggunaan sejumlah terbatas antibodi. Analit dapat dilabel dengan senyawa radioaktif, fluoresensi, luminesensi atau enzim. 2. Analisis kompetitif untuk antigen/hapten dengan antibodi yang diberi label : analisis ini berguna ketika antigen atau hapten yg dilabel memiliki sifat yang kurang menguntungkan, misalnya kelarutan yang rendah dalam medium reaksi. Dalam reaksi digunakan analit imobilisasi dengan jumlah tetap dan terbatas. Sensitivitas reaksi tergantung pada afinitas antibodi berlabel

31 3. Analisis imunokimia yang tergantung pada deteksi langsung kompleks imun: analisis yang dilihat langsung yaitu presipitasi, turbidimetri, aglutinasi, perhitungan partikel 4. Analisis imunokimia dengan melibatkan label dan reaksi khusus yang berlebih: analisis sandwich seperti 2-site immunometric assay, dan ELISA. Analit diinkubasi dengan antibodi berlabel dalam jumlah berlebih, antibodi yang tidak berikatan akan dibuang

32 1. Analisis imunokimia untuk mengukur antibodi spesifik : analisis ini melibatkan antigen amobil berlebih pada fase padat untuk menangkap antibodi spesifik di dalam sampel. 2. Analisis imunokimia yang melibatkan pereaksi berlabel dimana hasil reaksi Ag- Ab merupakan penguatan sinyal: analisis ini termasuk imunokimia homogen untuk memberikan efek 100% modulasi sinyal dari label yang digunakan

33 Reaksi Imunokimia dengan jumlah antibodi berlebih (tipe I) Analit + antibodi kompleks Ag-Ab sisa antibodi Sensitivitas maksimum dicapai pada jumlah antibodi yang tidak terhingga Sensitivitas adalah 1 molekul analit (teoritis) Antigen yang dapat bereaksi silang berpotensi reaksi seimbang dengan sistem antibodi berlebih Reaksi antigen-antibodi hanya sedikit dipengaruhi oleh senyawa seperti garam atau urea Waktu analisis relatif cepat dengan antibodi berlabel

34 2-site immunometric sandwich assay (non-kompetitif untuk Ag polivalen) inkubasi pencucian Ab1 Ag Ab2 berlabel Pencucian dan inkubasi ditambahkan berlebih Ukur aktivitas labelnya

35 Reaksi Imunokimia dengan jumlah antigen berlebih (tipe II) Analit + antibodi kompleks Ag-Ab sisa antigen Sensitivitas maksimum dicapai ketika konsentrasi antibodi mendekati 0 Penjenuhan ini diatur oleh konstanta kesetimbangan Sensitivitas tergantung pada konstanta afinitas antibodi Sensitivitas maksimum mol/liter (teoritis) Antigen yang dapat bereaksi silang akan menunjukkan kekuatan relatifnya tergantung pada laju konstanta kesetimbangan antara analit dan antigen cross-reactant tersebut Reaksi dalam percobaan lambat karena kesetimbangan harus tercapai

36 Imunokimia kompetitif dengan analit berlabel Ag + + Ag-berlabel Ab + Analit berlabel berkompetisi dengan antigen tidak berlabel untuk berikatan dengan antibodi.aktivitas spesifik dari fraksi analit berlabel yang terikat dgn antibodi berbanding terbalik dengan konsentrasi analit bebas

37 Sensitivitas metode Kesalahan eksperimen paling besar kira-kira 17% Konstanta kesetimbangan antibodi kira-kira liter/mol Sensitivitas tertinggi (limit deteksi) kira-kira mol/liter (kira-kira 10 8 molekul per ml)

38 ANALISIS IMUNOKIMIA DENGAN LABEL NON-RADIOAKTIF

39 Karakteristik suatu label untuk analisis imunokimia Memiliki aktivitas spesifik Mudah dideteksi Tidak berbahaya

40 Aktivitas spesifik label berhubungan dengan : Fraksi pada label yang akan digunakan untuk deteksi Derajat amplifikasi Efisiensi deteksi

41 Syarat Enzim yang ideal sebagai label Memiliki aktivitas tinggi pada konsentrasi (Km rendah) Stabil pada kondisi reaksi (biasanya ph netral) Mudah dikonjugasi ke molekul lain untuk reaksi lanjutan atau dalam penyimpanan Tersedia dalam keadaan murni (high purity) Harga murah Mudah dideteksi dengan cara yang sederhana Tidak terdapat di dalam cairan sampel biologi yang akan diuji

42 Contoh enzim sebagai label Enzim dan sumber ph optimum Aktiv.spes (U/mg, 37 C) BM Alkalinfosfatase (usus sapi) -galaktosidase (E.coli) HRP (lobak) Enzim lain : amilase, katalase, urease, xantin-oksidase, heksokinase, adenosin deaminase, invertase, -laktamase, dll.

43 Enzim dan sumbernya B-galaktosidase Peroksidase Glukosa oksidase A-amilase G6PDH MDH Heksokinase Propionil-CoA-karboksilase Lisozim Escherichia coli Lobak Aspergillus sp. Bacillus subtilis Leoconostoc mesenteroides Lactobacillus arabinosus Saccharomyces sp. Saccharomyces sp. Egg-white

44 Senyawa berfluoresensi sebagai label Pada saat molekul fluoresensi dieksitasi oleh sinar terpolarisasi, polarisasi sinar yang teremisi tergantung pada rotasi acak yang terjadi selama proses eksitasi Semakin kecil molekul, makin cepat rotasi yg terjadi dan sinyal semakin kecil Pada IFA, senyawa fluoresensi sebagai label yang terkonjugasi dengan Ag atau Ab, akan tereksitasi, lalu setelah ikatan Ag-Ab, rotasi diperlambat, dan polarisasi meningkat Oleh karena itu, untuk label ukuran dan rotasi label bebas menjadi hal yang penting, karena akan mempengaruhi polarisasi label yang terikat

45 Syarat ideal Senyawa Fluoresensi sebagai label Memiliki intensitas fluoresensi yang tinggi (absorptivitas molar tinggi) Stoke shift > 50 nm untuk mengurangi pengaruh latar belakang (background) akibat scattering Larut dalam air Mudah dikonjugasi dengan molekul lain Harga murah

46 Contoh label fluoresensi Fluorofor Quantum yield Lifetime (ns) Emisi/eksita si (nm) Absorptivitas (liter/mol) Dansil klorida Fluoresein isotiosianat Rhodamin B isotiosianat 0,3 14, /340 3,4x10 3 0,85 4,5 520/492 7x10 4 0,7 3,0 585/550 1,2x10 4

47 Senyawa kelat dari logam lantanida saat ini banyak digunakan untuk label fluoresensi Europium, terbium, samarium, memiliki emisi fluoresensi yang panjang (mikrodetik sampai milidetik) Dapat menghilangkan pengaruh background

48 Reaksi silang (cross-reaction) Ketepatan suatu analisis tergantung pada spesifisitas nya Reaksi Antigen-Antibodi bersifat spesifik, namun dapat pula terjadi reaksi silang, yaitu reaksi dengan sebagian atau seluruh struktur kimia dari analit lain Reaksi silang dievaluasi dengan cara membandingkan kemampuan masing-masing analit terhadap ikatan dengan label

49 B (%) Std Cross-reactant x1 x2 Log konsentrasi % reaksi silang = konsentrasi Std (x1) / konsentrasi cross-reactant (x2) x 100%

50 Perkembangan metode Imunokimia Penggunaan sintetik peptida untuk epitop spesifik pada Ag virus Metode Scintillation Proximity : Radioimunokimia menggunakan fluomicrosphere yang dilapisi dengan Ab atau reseptor. Fluomicrosphere ini akan menghasilkan sinyal bila Ab atau molekul reseptor berikatan dengan ligand yang dilabel dengan radioaktif ( 3 H atau 125 I) Metode Idiometrik (Idiometric assay) : non-kompetitif untuk pengukuran senyawa molekuler yang kecil Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay

51 Metode Scintillation Proximity Radiasi FI A + L* FI A L* sinar Suatu Ligand radioaktif berikatan dengan molekul akseptor (A) yang terikat pada molekul fluomikrosfer, yang setelah diradiasi akan memancarkan sinar

52 Metode Idiometrik Pada metode ini digunakan tambahan dua jenis antibodi anti-idiotipik (anti-idiotypic antibody) selain antibodi utama Antibodi anti-idiotipik alfa dan beta Alfa akan mengenali epitop dalam daerah variabel Ab utama, dan tidak sensitif terhadap ada atau tidaknya analit pada situs ikatannya Beta akan berkompetisi dengan analit pada bagian paratop (daerah ikatan Ag pada Ab) Biasanya digunakan untuk antigen kecil, misalnya estradiol

53 Ultrasensitive two-site enzyme immunoassay Untuk mengukur kadar antigen yang sangat kecil : Chorionic gonadotropin dalam serum atau plasma (pada kasus tumor) Thyrotropin dalam serum darah Luteinizing hormon dalam serum darah anakanak Growth hormon