TRANSFORMASI GENETIKA PADI DENGAN PERANTARA RHIZOBIUM DAN AGROBACTERIUM DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6

Transkripsi

1 i TRANSFORMASI GENETIKA PADI DENGAN PERANTARA RHIZOBIUM DAN AGROBACTERIUM DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6 SYAMSIDAH RAHMAWATI SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

2

3 PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6 adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini. Bogor, Januari 2012 Syamsidah Rahmawati G

4

5 ABSTRACT SYAMSIDAH RAHMAWATI. Genetic Transformation of Rice using Rhizobium and Agrobacterium and Functional Analysis of OsHox6 Gene. Under direction of SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, and INEZ HORTENSE SLAMET-LOEDIN Rice (Oryza sativa) is not only the most important crop in the world, but also a model plant for functional genomic studies. Genetic transformation is a routine technique for transferring important traits into plants including rice genome and for gene function analysis. Agrobacterium transformation technique is the most commonly used for genetic transformation of plants. However, the complexity of patents landscape surrounds this technology restricts its use for agricultural development in developing countries. In this study, the effectiveness of Rhizobium transformation techniques were evaluated in three rice cultivars Ciherang, Nipponbare, and Rojolele, and compared to Agrobacterium. Six-day old callus induced from immature embryos were co-cultivated with Rhizobium leguminosarum ANU845 and Agrobacterium tumefaciens LBA288 both carrying the plasmid pcambia pcambia 5106 is a cointegrative vector. The T- DNA contained an hpt gene and a GUSPlus each controlled by the CaMV 35S promoter. This study showed that the Rhizobium could transfer genes into rice genome as efficient as that of Agrobacterium based on evaluation on transformation efficiency, transgene expression, copy number, segregation pattern, and plant growth and fertility. Drought is one of abiotic factors that inhibit rice growth and production. A number of genes responsible for drought tolerance have been identified, isolated and tested in different plant species. However, none of these genes was effective in the fields. In this study, a drought inducible gene, OsHox6, was selected to be studied further. Bioinformatics analysis of OsHox6 promoter sequences indicated that the OsHox6 promoter contains cis-regulatory elements important to drought and ABA responses. Temporal and spatial expression patterns of GUSPlus gene fused to OsHox6 promoter through histochemical visualization of GUSPlus in transgenic plant of Ciherang and Nipponbare showed that promoter activity was increased during dehydrated condition in vegetative and generative organs, although the expression was relatively low. Promoter activity was higher in meristematic tissues. Transgenic rice plants containing an extra copy of OsHox6 genes controlled by OsLEA3 promoter were obtained. Four transgenic of IR64 lines (I.19, I.23, I.33, and I.40) containing an extra copy of OsHox6 gene were more tolerant to drought condition, showing higher survival rate compare to wild type plants. It is anticipated that the increase in the survival rate was associated with the expression level of OsHox6 gene. Thus, the expression of OsHox6 gene will be further evaluated. The growths of transgenic rice plants were similar to its wild type counterpart. Further studies are needed to understand the modulation of drought tolerant by the OsHox6 gene. Key words: Drought stress, transcription factor, HD-Zip, OsHox6, OsLEA3, rice, Rhizobium leguminosarum ANU845, Agrobacterium tumefaciens, survival rate

6

7 RINGKASAN SYAMSIDAH RAHMAWATI. Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Dibimbing oleh SUHARSONO, DIDY SOPANDIE, dan INEZ HORTENSE SLAMET-LOEDIN Padi merupakan tanaman yang sangat penting, salah satu makanan pokok penduduk dunia dan tanaman model untuk penelitian functional genomic. Transformasi genetik merupakan teknik yang rutin digunakan saat ini untuk mentransfer berbagai sifat penting pada tanaman termasuk padi dan untuk analisis fungsi gen. Teknik transformasi Agrobacterium merupakan teknik transformasi yang paling umum digunakan karena besar kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan salinan gen tunggal. Namun, teknik ini telah dipatenkan sehingga perlu agen transformasi alternatif yang memiliki kemampuan transfer gen seperti Agrobacterium. Penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transformasi genetik memungkinkan untuk dilakukan dengan melibatkan T- DNA dan gen-gen virulen dari plasmid Ti yang telah dimodifikasi. Efektifitas teknik transformasi Rhizobium dievaluasi pada tiga kultivar padi, Ciherang (Indica), Nipponbare (Japonica), dan Rojolele (Javanica), dibandingkan dengan Agrobacterium. Kalus umur 6 hari yang diinduksi dari embrio padi masak susu (immature) dikokultivasi dengan Rhizobium leguminosarum bv trifolii ANU845 dan Agrobacterium tumefaciens LBA288 yang membawa plasmid pcambia Plasmid pcambia 5106 ini mengandung satu set minimal gen virulen dan T-DNA yang penting dalam proses transfer gen. Didalam T-DNA terdapat gen GUSPlus dan gen hpt masing-masing dikendalikan oleh promoter CaMV 35S. Efisiensi transformasi (jumlah tanaman PCR positif hpt dibagi jumlah kalus yang diinokulasi) bervariasi antara 1,14 hingga 12,05% tergantung pada genotipe dan bakteri yang digunakan. Efisiensi transformasi dan regenerasi tertinggi (12,05% dan 59,38%) diperoleh pada Ciherang yang ditransformasi dengan R. leguminosarum. Hampir semua tanaman transgenik yang diperoleh baik hasil transformasi dengan Agrobacterium maupun Rhizobium secara morfologi normal dan fertil. Integrasi, ekspresi dan pola pewarisan gen, dibuktikan dengan analisis molekuler dan genetik pada tanaman T 0 dan T 1, menunjukkan bahwa efektifitas Rhizobium leguminosarum dalam melakukan transfer gen mirip dengan A. tumefaciens. Kekeringan adalah salah satu faktor abiotik yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman padi. Sejumlah gen yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan telah diidentifikasi, namun belum ada dari gen-gen tersebut yang efektif di lapangan. Oleh karena itu, penelitian tentang analisis fungsi gen yang diduga terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan dan bagaimana mekanisme kerjanya pada level molekul aktif diteliti saat ini. Di dalam penelitian ini, fungsi gen OsHox6 yang diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan pada tanaman padi dipelajari. OsHox6 merupakan anggota famili protein homeodomain leucine zipper (HD-Zip) sub-famili I yang menyandikan faktor transkripsi unik pada tumbuhan. Hasil penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa ekspresi gen OsHox6 diregulasi pada level transkripsi oleh ketersediaan air. Analisis bioinformatik sekuen promoter OsHox6

8 mengindikasikan bahwa promoter OsHox6 mengandung elemen responsif terhadap ABA dan elemen cis-regulatory responsif terhadap kekeringan. TATA box yang umum dijumpai di derah promoter tanaman, berdasarkan hasil analisis sekuen promoter OsHox6, tidak ditemukan. Hasil analisis pola ekspressi temporal dan spasial promoter gen OsHox6 melalui visualisasi gen GUSPlus secara histokimia pada jaringan tanaman transgenik Ciherang dan Nipponbare menunjukkan bahwa aktivitas promoter ini meningkat saat kekeringan pada organ vegetatif (batang, daun, dan akar) dan generatif (bunga). Aktivitas promoter lebih kuat pada daerah dimana terdapat jaringan meristem yang aktif membelah. Untuk mempelajari peranan gen OsHox6 dalam merespon kekeringan, digunakan tanaman padi transgenik mengandung gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6. Empat galur padi transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 (IR64 I.19, I.23, I.33, dan I.40) lebih tahan pada kondisi kekeringan pada fase vegetatif, ditunjukkan oleh persentase recovery yang lebih tinggi dibandingkan dengan tanaman kontrol tipe liarnya (IR64). Diduga peningkatan persentase recovery berhubungan dengan tingkat ekspresi gen OsHox6. Oleh karena itu konfirmasi ekspresi gen OsHox6 akan dilakukan. Penampilan morfologi (tinggi tanaman) padi hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA3 tidak berbeda dengan tanaman padi tipe liarnya. Karena aktivitas promoter OsHox6 lebih tinggi pada daerah akar lateral, maka diduga OsHox6 penting dalam pembentukan akar lateral. Oleh karena itu penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengamati morfologi akar tanaman transgenik yang mengoverekspresikan OsHox6. Kata Kunci: Cekaman kekeringan, faktor transkripsi, HD-Zip, OsHox6, OsLEA3, padi, Rhizobium leguminosarum ANU845, Agrobacterium tumefaciens, pesentase recovery.

9 Hak cipta milik IPB, tahun 2012 Hak dilindungi undang-undang Dilarang mengutip sebahagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah, dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

10

11 TRANSFORMASI GENETIKA PADI DENGAN PERANTARA RHIZOBIUM DAN AGROBACTERIUM DAN ANALISIS PERANAN GEN OsHox6 SYAMSIDAH RAHMAWATI Disertasi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Departemen Biologi SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

12 Penguji pada ujian tertutup : 1. Dr. Ir. Miftahuddin, M.Si 2. Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Sc Penguji pada ujian terbuka : 1. Prof. Dr. Ir. Sudirman Yahya, M.Sc 2. Dr. Ir. Buang Abdullah, M.Sc

13 Judul Nama Mahasiswa NRP Program Studi : Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6 : Syamsidah Rahmawati : G : Biologi Disetujui, Komisi Pembimbing Prof. Dr. Ir. Suharsono, DEA Ketua Dr. Ir. Inez Hortense Slamet-Loedin Anggota Prof. Dr. Ir. Didy Sopandie, M.Agr Anggota Diketahui, Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc. Agr Tanggal Ujian: 17 Januari 2012 Tanggal Lulus:

14

15 PRAKATA Segala puji bagi Allah yang telah memberikan kenikmatan yang sangat banyak serta kemudahan-kemudahan, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi ini. Penulis sangat beruntung mendapat kesempatan untuk melakukan penelitian Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Penelitian ini merupakan penelitian yang sangat menarik bagi penulis karena memberikan wawasan baru tentang adanya teknik transformasi alternatif bagi tanaman dengan menggunakan bakteri selain Agrobacterium dan bagaimana mempelajari fungsi suatu gen. Penelitian ini akan sangat bermanfaat untuk mendukung karier penulis sebagai peneliti di masa mendatang. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih yang sebesarbesarnya kepada Prof. Suharsono, Prof. Didy Sopandie, dan Dr. Inez Hortense Slamet-Loedin atas kesediannya membimbing penulis dalam melakukan penelitian ini. Ucapan terimakasih disampaikan kepada Kepala Puslit Bioteknologi LIPI yang telah memberikan izin untuk melanjutkan studi pada program S3, kepada Kementrian Riset dan Teknologi dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia yang telah memberikan beasiswa kepada penulis selama pendidikan berlangsung, kepada Dekan Sekolah Pascasarjana dan Ketua Departemen Biologi IPB yang telah memberi kesempatan untuk mengikuti pendidikan S3 di Sekolah Pascasarjana Departemen Biologi IPB. Kepada Dr. Satya Nugroho dan Dr. Amy Estiati atas izin peggunaan fasilitas di Lab. Biologi Molekuler Puslit Bioteknologi LIPI. Kepada keluarga besar di Bogor dan di Medan saya ucapkan terimakasih atas semua dukungan dan doa sehingga penulis tetap bersemangat dalam menyelesaikan disertasi ini. Juga kepada semua teman dari lab Padi Puslit Bioteknologi LIPI, angkatan 2006 Pascasarjana IPB atas semua dukungan, bantuan, serta doanya saya ucapkan terimakasih. Semoga Disertasi ini bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi. Bogor, Januari 2012 Syamsidah Rahmawati

16

17 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan Tapanuli Utara tanggal 8 April 1969, anak sulung dari Bapak Saman dan Ibu Amijah Porman Marpaung. Pendidikan Sarjana ditempuh di Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara Medan, lulus pada tahun Pada tahun 1997 penulis mendapatkan kesempatan mengikuti program S2 LINK Institut Teknologi Bandung dengan University of New South Wales Australia melalui program Beasiswa STAID yang dikoordinir oleh Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT), lulus tahun Pada tahun 2006, penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan pendidikan S3 di Sekolah Pascasarjana IPB, Departemen Biologi dengan beasiswa dari Kementrian Riset dan Teknologi pada tahun pertama dan kedua, dan kemudian Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia pada tahun ke tiga dan ke empat. Penulis bekerja sebagai staf peneliti di Pusat Penelitian Bioteknologi sejak tahun 1993 pada bidang konservasi benih, kemudian sejak tahun 1996 pindah ke bidang biologi molekuler hingga sekarang. Penulis terlibat dalam kegiatan penelitian padi sejak tahun 1999 hingga sekarang terutama untuk transformasi genetika padi untuk memperbaiki sifat toleran padi terhadap cekaman biotik dan abiotik. Selama mengikuti program S3, penulis mendapat kesempatan untuk mengikuti training mengenai Rice:Research to Production di International Rice Research Institute (IRRI) Filipina selama 3 minggu pada tahun Topik penelitian untuk Disertasi adalah Transformasi Genetika Padi dengan Perantara Rhizobium dan Agrobacterium dan Analisis Peranan Gen OsHox6. Comparative analysis of rice transformation using Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium leguminosarum yang merupakan bagian dari Disertasi ini telah dipublikasi di Indonesian Journal of Biotechnology Volume 15 No. 1 Juni 2010.

18

19 DAFTAR ISI Daftar Tabel... Daftar Gambar... Daftar Lampiran... Halaman iii v vii I. PENDAHULUAN Latar Belakang... 1 Tujuan Penelitian... 5 Manfaat Penelitian... 5 Ruang Lingkup Penelitian... 6 II. TINJAUAN PUSTAKA Padi Sebagai Tanaman Penting... 9 Cekaman Kekeringan Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan Faktor Transkripsi HD-Zip Analisis Fungsi Gen Transformasi Genetika Tanaman III. ANALISIS KOMPARATIF TRANSFORMASI GENETIK PADI MENGGUNAKAN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS DAN RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan... 40

20 ii IV. ANALSIS REGULASI PROMOTER OsHox6 PADA TANAMAN PADI Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan V. OVEREKSPRESI GEN OsHox6 PADA TANAMAN PADI Abstrak Abstract Pendahuluan Bahan dan Metode Hasil Pembahasan Simpulan VI. PEMBAHASAN UMUM Rhizobium Sebagai Agen Tranformasi Genetik Alternatif Pendekatan Reverse Genetic untuk Mempelajari Fungsi Gen OsHox Upaya Lebih Lanjut Analisis Fungsi Gen OsHox6 pada Tanaman Padi VII. SIMPULAN UMUM DAN SARAN SIMPULAN UMUM SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 99

21 iii DAFTAR TABEL Halaman 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan Subfamili HD-Zip dan fungsinya Media yang digunakan untuk transformasi tiga varietas padi (Ciherang, Nipponbare, dan Rojolele) Efisiensi transformasi tiga varietas padi hasil transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens Ekspresi GUS dan HPT pada tiga varietas padi hasil transformasi dengan Rhizobium leguminosarum dan Agrobacterium tumefaciens berdasarkan uji GUS dan higromisin pada daun Prakiraan jumlah gen hpt pada galur tanaman transgenik terpilih hasil transformasi dengan Agrobacterium (A) dan Rhizobium (R) Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T 1 galur terpilih Pertumbuhan dan fertilitas beberapa galur transgenik terpilih hasil transformasi dengan Rhizobium dan Agrobacterium Kandidat cis-acting element responsif kekeringan dan ABA pada 1 kb daerah promoter OsHox Segregasi gen hpt pada populasi tanaman T 1 Ciherang dan IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA Tingkat recovery tanaman transgenik pada kondisi kekeringan Perbandingan antara transformasi menggunakan bantuan A. tumefaciens dengan R. leguminosarum... 75

22 iv

23 v DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Diagram alur penelitian Skema struktur protein unik dari setiap subfamili HD-Zip T-DNA di dalam pcambia Amplifikasi fragmen gen hpt tanaman transgenik terpilih hasil transformasi dengan A. tumefaciens atau R. leguminosarum pembawa plasmid pcambia Daun tanaman padi transgenik yang mengekspresikan β- glucuronidase dan higromisin fosfotransferase Contoh hasil hibridisasi Southern Penampilan morfologi Niponbare, Ciherang, dan Rojolele hasil transformasi dengan A. tumefaciens LBA288 (pcambia5106) and R. leguminosarum (pcambia5106) Skema proses kloning untuk pembentukan fusi promoter OsHox6 dengan gen pelapor GUSPlus Posisi elemen cis-acting responsif kekeringan pada daerah promoter OsHox Hasil pensejajaran sekuen kandidat promoter OsHox6 yang diisolasi dari padi Ciherang dengan sekuen acuan dari Nipponbare Contoh hasil PCR menggunakan primer spesifik untuk gen hpt Ekspresi GUSPlus pada berbagai organ tanaman padi cv Ciherang dan Nipponbare hasil transformasi dengan gen GUSPlus yang dikontrol oleh promoter terinduksi kekeringan OsHOx6 dan promoter konstitutif CaMV 35S pada saat ada atau tidak ada induksi kekeringan Pola ekspresi GUSPlus yang dikontrol oleh promoter OsHox6 pada berbagai organ tanaman Penampang melintang dan membujur bagian buku batang padi yang telah di uji GUS T-DNA di dalam pcambia 1301H OsHox Tahapan kultur jaringan untuk menghasilkan tanaman padi varietas Ciherang atau IR64 yang mengandung OsLEA3::OsHox Hasil hibridisasi Southern DNA tanaman IR64 yang ditransformasi dengan gen OsHox Recovery tanaman transgenik galur IR64 tahan higromisin mengandung 1 salinan gen hasil transformasi dengan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter OsLEA Tinggi tanaman beberapa galur toleran kekeringan... 70

24 vi

25 vii DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Media Kultur Jaringan Media Bakteri Larutan Yoshida

26 I. PENDAHULUAN Latar Belakang Padi (Oryza sativa L.) merupakan komoditas strategis, makanan pokok penduduk Indonesia dan penduduk di berbagai belahan dunia terutama Asia, Timur Tengah dan Amerika Latin. Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil, karena dibandingkan dengan tanaman lain dari kelompok monokotil, padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil (430 Mb), umur relatif singkat, menyerbuk sendiri, diploid sehingga memudahkan dalam melakukan analisis genom ( net/daisy/ricegenome/3649/3593.html). Meskipun variasi ukuran genom dan ploidi pada tanaman monokotil sangat besar, genom padi dan tanaman monokotil lainnya sangat konservatif baik dalam hal sekuen dari gen yang ada, juga dalam urutan gen atau synteni. Sehingga informasi yang ada pada genom tanaman padi dapat digunakan sebagai acuan untuk mempelajari genom tanaman monokotil lainnya. Kekeringan adalah salah satu faktor utama penghambat produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menurunkan produksi tanaman dengan menghambat pertumbuhan dan fotosintesis (Shou et al. 2004). Menurunnya produksi akibat kekeringan berdampak pada peningkatan harga produk pertanian dan memperburuk kemiskinan ( /arch26.pdf). Studi dan analisis data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir dan prediksi 50 tahun ke depan menggunakan model perubahan iklim global mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi (Naylor et al. 2007). Kekeringan dapat terjadi kapan saja selama fase pertumbuhan padi, namun yang paling merugikan adalah kekeringan yang terjadi pada fase generatif. Perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi perubahan iklim yang ekstrim. Upaya untuk mempelajari sifat toleran kekeringan pada level molekul sangat aktif dilakukan di seluruh dunia untuk membantu mengungkap mekanisme molekuler tanaman pada kondisi kekurangan air. Pemahaman ini sangat membantu upaya perakitan padi toleran kekeringan di masa mendatang.

27 2 Sifat toleran kekeringan sangat kompleks, dikendalikan oleh banyak gen (multigenik) yang tersebar di banyak lokus dan diwariskan secara kuantitatif (Valliyodan & Nguyen 2006; Fleury et al. 2010; Lang & Buu 2010). Selain itu tanaman memiliki mekanisme yang berbeda (escape, penghindaran atau avoidance, atau toleran) dalam merespon kekeringan (Levit 1972). Tanaman escape kekeringan dengan mempersingkat siklus hidupnya. Sebahagian tanaman menghindari kekeringan dengan meningkatkan penyerapan air dan meminimalkan kehilangan air. Tanaman toleran kekeringan melibatkan mekanisme osmotic adjustment, antioksidan, dan ketahanan desikasi. Namun bagaimana mekanisme molekuler tanaman dalam merespon dan beradaptasi terhadap kekeringan belum sepenuhnya dimengerti. Berbagai pendekatan telah diupayakan untuk mempercepat pengungkapan mekanisme toleran kekeringan pada level molekuler. Sejumlah gen terinduksi kekeringan telah berhasil diidentifikasi pada level transkripsi menggunakan analisis microarray pada tanaman model Arabidopsis dan padi (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Zhou et al. 2007), namun belum semua fungsi gen berhasil diungkapkan. Analisis fungsional genomik sangat penting dilakukan untuk memahami lebih lanjut fungsi gen terkait dan bagaimana mekanisme pengaturannya pada level molekuler. Berdasarkan pengaturan ekspresi gen, Yamaguchi-Shinozaki dan Shinozaki (1993a) mengelompokkan gen-gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan ke dalam dua kelompok utama, yaitu kelompok yang ekspresinya bergantung pada ABA (ABA dependent) dan tidak bergantung pada ABA (ABAindependen). Berdasarkan peran atau fungsi proteinnya maka Shinozaki et al. (2003) mengelompokkan gen-gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan pada dua kelompok utama, protein fungsional (seperti osmoprotektan, LEA, transporter, chaperon) dan protein regulator (misalnya faktor transkripsi dan protein kinase). Yang et al. (2010) membagi gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi biologisnya ke dalam 3 kelompok; yaitu yang berperan dalam (1) regulasi transkripsi, (2) post-transkripsi RNA atau fosforilasi protein, dan (3) metabolisme osmoprotektan atau molekul chaperon. Selain itu masih ada kelompok gen yang belum diketahui fungsinya (Bhatnagar-Mathur et al. 2008).

28 3 Oleh karena kompleksnya sifat toleran kekeringan, penyisipan satu gen yang memiliki fungsi tunggal tidak cukup untuk mengembalikan fungsi sel dan membuat tanaman lebih toleran kekeringan (Bohnert et al. 1995; Mitra 2001). Untuk mengatasi hal tersebut akhir-akhir ini penelitian lebih diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang bertanggungjawab pada sifat toleran kekeringan. Faktor transkripsi berperan dalam mengatur ekspresi gen-gen lain melalui pengikatan spesifik antara protein faktor transkripsi dengan elemen cisacting promoter gen target. Sejumlah faktor transkripsi terinduksi kekeringan pada tanaman telah berhasil diungkap. Secara umum faktor transkripsi yang responsif terhadap kekeringan tersebut dikelompokkan ke dalam beberapa famili seperti AP2/ERF, bzip, NAC, MYB, MYC, Cys2His2 zinc finger dan WRKY (Vinocur & Altman 2005; Bartels & Sunkar 2005; Shinozaki & Yamaguchi- Shinozaki 2007). Setelah sekuen genom padi dan Arabidopsis berhasil diungkap, faktor transkripsi yang ada pada tanaman padi dan Arabidopsis dapat diidentifikasi (Seki et al. 2002; Shinozaki & Yamaguchi-Shinozaki 2007; Agalou et al. 2008). Berbagai teknik reverse genetik telah dikembangkan untuk mempelajari fungsi faktor transkripsi. Secara umum teknik reverse genetik ini dibagi ke dalam 2 pendekatan, yaitu overekspresi dan knockout (Zhang 2003). Selain itu analisis promoter yang difusikan dengan gen pelapor digunakan untuk mempelajari mekanisme regulasi proses transkripsi gen pada level molekuler dan aktivitas promoter secara spasial dan temporal (Hiwatashi & Fukuda 2000; Xiao & Xue 2001; Johannesson et al. 2003; Itoh et al. 2008). HD-Zip adalah salah satu faktor transkripsi yang unik ditemukan pada tanaman, dikenali dengan adanya homeodomain yang penting untuk pengikatan DNA dan motif leucin zipper yang membantu proses dimerisasi protein. Proses dimerisasi protein diperlukan untuk membantu proses pengikatan DNA. HD-Zip merupakan suatu famili faktor transkripsi yang besar yang dibagi ke dalam IV sub-famili berdasarkan kespesifikan pengikatan DNA oleh homeodomain, struktur dan fungsi gen, dan adanya motif lain (Ariel et al. 2007). HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam. Ekspresi Gen HD-Zip sub-famili I dan II di pengaruhi faktor eksternal termasuk kekeringan dan berperan dalam adaptasi

29 4 perkembangan tanaman pada saat terjadi cekaman (Olsson et al. 2004; Dezar et al. 2005a; Agalou et al. 2008). Faktor transkripsi HD-Zip di tanaman padi baru diteliti beberapa tahun belakangan ini. Informasi tentang fungsi dan mekanisme regulasinya masih sangat terbatas. Dari 31 gen HD-Zip sub-famili I,II, dan III yang ada pada padi, baru 2 yang dipelajari fungsinya, yaitu OsHox1 dan OsHox4. OsHox1 berperan dalam differensiasi jaringan pembuluh (Scarpella et al. 2000), sedangkan OsHox4 berperan dalam pemanjangan dan pembesaran sel pembuluh (Agalou et al. 2008). Pada penelitian ini fungsi gen faktor transkripsi OsHox6 yang diisolasi dari tanaman padi dipelajari. Gen OsHox6, merupakan anggota HD-Zip sub-famili I, dilaporkan meningkat ekspresinya pada saat kekeringan (Purwantomo 2007; Agalou et al. 2008), sehingga diduga berperan penting dalam menentukan sifat toleran kekeringan. Untuk mempelajari lebih lanjut fungsi gen OsHox6 dalam adaptasi toleran kekeringan, aktivitas native promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus diamati pada tanaman padi saat kekeringan. Kekeringan meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada berbagai organ (batang, akar, daun, dan bunga) tanaman padi, namun ekspresinya rendah. Oleh karena itu pada percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 padi pada kondisi kekeringan. Sebelumnya, Xiao et al. (2007) melaporkan bahwa OsLEA3 menunjukkan aktivitas yang tinggi pada kondisi kekurangan air. Selanjutnya toleransi tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi. Selanjutnya untuk mendukung kegiatan analisis fungsi gen, pengembangan teknik transformasi menggunakan Rhizobium sebagai upaya untuk menyediakan teknik transformasi alternatif untuk tanaman khususnya padi akan di pelajari. Teknik yang umum digunakan saat ini untuk mengintroduksi gen pada tanaman, khususnya padi, adalah menggunakan transformasi Agrobacterium. Teknik ini memiliki keunggulan dimana kemungkinan untuk menghasilkan satu salinan gen lebih besar dan dapat digunakan untuk mentransformasi berbagai tanaman termasuk dari kelompok dikotil dan monokotil. Namun, teknik ini telah

30 5 dipatenkan yang mana dapat menjadi ganjalan bila produk akan dipasarkan. Oleh karena itu perlu diupayakan teknik transformasi alternatif. Broothaerts et al. (2005) melaporkan bahwa sejumlah bakteri yang berasosiasi dengan tumbuhan, jika dilengkapi dengan gen-gen virulen dan T-DNA dari plasmid Ti mampu mentransfer T-DNA ke dalam genom tanaman. Bakteri Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp dan Mesorhizobium loti mengandung plasmid Ti dari Agrobacterium dapat mentransfer T-DNA ke dalam genom padi, tembakau dan Arabidopsis dengan efisiensi transformasi yang bervariasi antara 1-40% tergantung pada spesies dan pengujian yang digunakan. Evaluasi efektititas bakteri selain Agrobacterium dalam mentransfer gen ke dalam genom tanaman dibandingkan dengan A. tumefaciens belum pernah dilakukan. Informasi ini penting sebagai langkah awal dalam upaya pengembangan transformasi genetik menggunakan bakteri selain Agrobacterium. Selanjutnya perubahan faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi diharapkan dapat meningkatkan efisiensi transformasi di masa mendatang. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk; 1. Mengevaluasi efektifitas sistem transformasi Rhizobium pada tanaman padi dibandingkan dengan sistem transformasi Agrobacterium, 2. Menjelaskan regulasi gen OsHox6 melalui studi bioinformatik promoter gen OsHox6 serta analisis pola ekspresinya pada tanaman padi transgenik yang mengandung fusi promoter OsHox6 dengan gen penyandi β-glucuronidase, dan 3. Menjelaskan peranan faktor transkripsi OsHox6 pada tanaman transgenik mengandung ekstra salinan gen OsHox6 pada kondisi kekeringan. Manfaat Penelitian 1. Teknik transformasi alternatif perlu ada selain untuk menghindari kendala paten juga untuk meningkatkan efisiensi transformasi tanaman yang sulit di transformasi dengan Agrobacterium.

31 6 2. Informasi tentang peranan gen OsHox6 dalam mekanisme toleran kekeringan tanaman padi penting untuk diketahui dalam upaya mencari gengen potensial untuk toleran kekeringan. 3. Promoter terinduksi kekeringan dapat digunakan untuk mengendalikan ekspresi gen-gen penting terkait toleran kekeringan. 4. Padi toleran kekeringan sangat diperlukan untuk antisipasi fluktuasi iklim ekstrim (kemarau panjang) yang semakin sering terjadi akibat pemanasan global yang mengakibatkan gagal panen di daerah utama padi sawah yang rawan kekeringan. Ruang Lingkup Penelitian Untuk mencapai tujuan penelitian di atas, maka penelitian ini dibagi dalam 3 tahap percobaan. Pada tahap awal dilakukan penelitian pendahuluan dengan topik Analisis komparatif transformasi genetik padi menggunakan Agrobacterium tumefaciens dan Rhizobium leguminosarum. Untuk mengevaluasi keefektifan teknik transformasi Rhizobium dibandingkan dengan transformasi Agrobacterium pada tanaman padi, maka pengamatan difokuskan pada efisiensi regenerasi dan transformasi masing-masing sistem, ekspresi gen, kecenderungan jumlah salinan gen, pola pewarisan gen, dan pertumbuhan dan kesuburan (fertilitas) tanaman yang dihasilkan oleh kedua sistem transformasi ini. Pada tahap berikutnya dilakukan isolasi dan konstruksi vektor yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus. Selanjutnya vector ini ditransformasikan ke dalam genom tanaman padi. Aktivitas promoter OsHox6 diamati pada tanaman padi yang mengandung promoter OsHox6 yang difusikan dengan gen GUSPlus pada kondisi air terbatas (kekeringan) atau tidak kekurangan air (normal). Selanjutnya, pengamatan dilakukan pada organ vegetatif (batang, akar, daun) dan generatif (bunga). Untuk mengamati jaringan yang mengakumulasikan GUSPlus dilakukan irisan secara melintang dan membujur. Percobaan tahap berikutnya dilakukan penambahan jumlah salinan gen OsHox6 yang dikendalikan oleh promoter terinduksi kekeringan OsLEA3 untuk meningkatkan ekspresi gen OsHox6 pada kondisi kekeringan. Selanjutnya

32 7 ketahanan tanaman padi yang mengandung tambahan gen OsHox6 terhadap kekeringan dievaluasi. Seluruh kegiatan penelitian dalam disertasi ini dirangkum dalam alur penelitian yang disajikan pada Gambar 1. Studi transformasi padi Ciherang, Rojolele dan Nipponbare dengan Rhizobium dan Agrobacterium Evaluasi efektifitas transformasi Isolasi Promoter OsHox6 dan konstruksi vektor pcambia OsHox6P::GUSPlus Pembentukan populasi tanaman mengandung OsHox6P:: GUSPlus Analisis ekspresi gen yang dikendalikan oleh promoter OsHox6 Pembentukan populasi tanaman mengandung OsLEA3P:: OsHox6 Evaluasi tingkat toleransi tanaman padi mengandung ekstra gen OsHox6 pada kondisi kekeringan Gambar 1 Diagram alur penelitian

33 8

34 II. TINJAUAN PUSTAKA Padi Sebagai Tanaman Penting Padi tergolong ke dalam genus Oryza, sub-famili Oryzoideae, famili Poaceae kelas monocotyledoneae. Padi yang dibudidayakan tergolong ke dalam 2 spesies, yaitu Oryza sativa L. umum ditanam di Asia dan Oryza glaberrima Steud atau disebut juga padi Afrika. Dari kedua spesies tersebut O. sativa adalah yang paling banyak dibudidayakan. O. sativa diperkirakan terdiri dari sedikitnya 140,000 varietas dan secara umum dikelompokkan ke dalam 3 grup atau subspesies; yaitu Indica, Japonica dan Javanica (Tropical Japonica). Padi merupakan tanaman yang memiliki nilai ekonomi sangat penting, makanan pokok lebih dari separuh penduduk dunia. Berdasarkan nilai ekonomi tanaman pangan secara global tahun , padi menempati urutan teratas dibandingkan dengan tanaman pangan penting lainnya (jagung, gandum, kentang, singkong dan sorghum), sedangkan berdasarkan jumlah produksi, padi menempati urutan kedua setelah jagung (FAOSTAT 2009). Di Indonesia padi menempati urutan pertama dari 7 komoditas pangan utama baik dari segi produksi maupun nilai ekonomi (FAOSTAT 2009; BPS 2009). Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil. Sebagai tanaman model padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil ( 430 Mb), umur relatif singkat, dan jumlah set kromosom sederhana (diploid) ( sehingga memudahkan dalam analisis sekuen genom. Selanjutnya tersedianya protokol transformasi genetika tanaman padi dengan efisiensi tinggi (Hiei et al. 1994; Hiei & Komari 2006), peta fisik dan genetika dengan kepadatan tinggi (Harushima et al. 1998; Temnykh et al. 2001; McCouch et al. 2002), dan kenyataan bahwa antara tanaman sereal memiliki derajat synteni yang tinggi, menjadikan padi sebagai organisme yang unik untuk mempelajari fisiologi, biologi pertumbuhan dan perkembangan, serta genetika dan evolusi tumbuhan. Tahun 2002 sekuen lengkap genom padi berhasil diungkap dan dipublikasi (Goff et al. 2002; Yu et al. 2002), sebagai langkah awal dari upaya pemahaman tentang biologi padi pada level molekuler. Rice Annotation Project (2007)

35 10 memprediksi padi mengandung gen. Jumlah ini lebih sedikit dibandingkan dengan prediksi sebelumnya (30-50 ribu gen) oleh Goff et al. (2002). Sebanyak cdna utuh telah berhasil disekuen dan berdasarkan pencarian BLASTN dan BLASTX menunjukkan bahwa 75,86% diantaranya merupakan gen yang menyandikan protein yang mirip dengan data yang ada dipangkalan data (Rice Full-Length cdna Consortium 2003). Sisanya, masih belum dipelajari. Oleh karena itu tugas berikutnya adalah mempelajari fungsi dari gen-gen tersebut. Cekaman Kekeringan Kekeringan adalah salah satu faktor yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menyebabkan kerugian ekonomi yang nyata (Kalsim 2007). Kerugian akibat kekeringan ditaksir mencapai milyaran rupiah setiap tahunnya. Kerugian akibat kekeringan sangat bergantung pada genotipe yang digunakan, fase pertumbuhan dimana kekeringan terjadi, dan lama serta tingkat keparahan kekeringan (Setter et al. 1995). Fase generatif merupakan fase yang sangat sensitif terhadap kekeringan (Yue et al. 2006). Kekeringan yang terjadi pada fase generatif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah malai dan hasil, bahkan dapat mengakibatkan puso. Dalam beberapa tahun terakhir kasus kekeringan semakin sering terjadi akibat adanya perubahan iklim yang disebabkan oleh pemanasan global. Menurut prediksi menggunakan model perubahan iklim global berdasarkan data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi 50 tahun ke depan (Naylor et al. 2007). Oleh karena itu perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi fluktuasi iklim yang ekstrim. Untuk dapat merakit padi toleran kekeringan diperlukan pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada tanaman. Oleh karena itu kajian tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada level molekuler sangat penting dilakukan. Data hasil kajian yang telah berhasil diperoleh hingga saat ini dapat dijadikan sebagai dasar di dalam upaya memahami sifat toleran kekeringan pada tanaman padi, dan juga pada

36 11 tanaman sereal lainnya. Tanaman toleran kekeringan adalah tanaman yang mampu hidup, tumbuh, dan memberikan hasil yang memuaskan pada kondisi air terbatas (Turner 1979, diacu dalam Fleury et al. 2010). Padi toleran kekeringan yang ideal adalah padi yang dalam kondisi tercekam kekeringan memberikan hasil yang tinggi dibandingkan padi lainnya (Fukai & Cooper 1995) atau memberikan hasil stabil dan mampu bertahan pada kondisi kekeringan (Price et al. 2002). Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman Tanaman tidak seperti makhluk hidup lain yang dapat bergerak atau berlari menghindar dari bahaya yang mengancam dirinya. Oleh karena itu untuk mengatasi cekaman lingkungan yang tidak menguntungkan, tanaman mengembangkan suatu mekanisme toleransi (Levit 1980; Mundree et al. 2002). Setiap tanaman memiliki kemampuan ini dengan derajat yang berbeda beda. Kemampuan tanaman dalam mengatasi cekaman lingkungan sangat dipengaruhi oleh mekanisme yang dimiliki tumbuhan untuk menghindari atau mengatasi cekaman yang dihadapinya dan tingkat keparahan cekaman. Untuk dapat mengatasi cekaman lingkungan, tanaman memberikan tanggapan dan adaptasi melalui perubahan morfologi, fisiologi, biokimia dan perkembangan, termasuk menginduksi ekspresi gen dan sintesis sejumlah protein (Takahashi et al. 2000). Tanaman yang berada di bawah cekaman menunjukkan perubahan pada aktivitas enzim daun, akumulasi mrna, fotosintesis, kandungan karbohidrat dan asam amino (Foyer et al. 1998). Secara umum mekanisme yang dikembangkan oleh tumbuhan untuk mengatasi cekaman lingkungan (kekeringan) dikelompokkan ke dalam tiga kelompok (Levit 1980; Chaves et al. 2003), yaitu escape, penghindaran (avoidance), dan toleran. Mekanisme adaptasi tanaman ini tidak saling terpisah. Suatu tanaman dapat menggabungkan berbagai mekanisme yang berbeda untuk proses adaptasi terhadap cekaman (Ludlow 1989, diacu dalam Chavez et al. 2003).

37 12 Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan Salah satu kunci utama dalam pemuliaan tanaman toleran kekeringan adalah mengetahui gen-gen yang mengendalikan sifat toleran kekeringan. Diduga ada ratusan gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan. Berbagai pendekatan telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen responsif kekeringan, diantaranya adalah substractive hybridization (Ouvrard et al. 1996; Deokar et al. 2011), differential display RT-PCR (Medini et al. 2009), cdna AFLP (Gao et al. 2009), dan DNA microarray (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Lorenz et al. 2011). Seki et al. (2001) mengamati 1300 gen Arabidopsis menggunakan cdna microarray dan menemukan 40 gen terinduksi kekeringan, 14 diantaranya sudah pernah dilaporkan sebelumnya (rd29a/cor78, cor15a, kin1, kin2, rd17/cor47, erd10, dan rd20), sedangkan 30 sisanya belum diketahui fungsinya. Kemudian Seki et al. (2002) mengamati 7000 gen Arabidopsis lainnya dan menemukan 277 gen terinduksi kekeringan. Sebanyak 128 diantaranya ekspresinya hanya terinduksi oleh kekeringan, sedangkan sisanya diinduksi oleh kekeringan, salinitas, dan ABA. Rabbani et al. (2003) mengamati 1700 cdna tanaman padi menggunakan cdna microarray dan menemukan 67 gen terinduksi kekeringan, sebahagian diantaranya belum diketahui fungsinya. Akhir-akhir ini Gao et al. (2009) membandingkan ekspresi gen terinduksi kekeringan pada padi sawah dan padi gogo. Dari hasil kajian tersebut ditemukan bahwa ada 57 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi gogo dan 38 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi sawah mengindikasikan adanya ekspresi gen yang berbeda antara padi gogo dan padi sawah. Berdasarkan pengaturan ekspresinya Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (1997) membagi gen terinduksi kekeringan ke dalam dua kelompok, yaitu yang ekspresinya diinduksi oleh ABA (ABA-dependent) dan tidak diinduksi ABA (ABA-independent). Berdasarkan fungsinya, Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (2007) membagi produk dari gen-gen ini ke dalam 2 grup, yaitu: protein fungsional dan protein regulator. Protein fungsional meliputi protein yang berperan dalam merespon kekeringan misalnya protein yang berperan sebagai protease, water channel atau transporter, enzim detoksifikasi, protein faktor

38 13 makromolekul, (LEA protein dan Chaperon), dan enzim kunci untuk biosintesa osmolit (prolin, gula). Protein regulator meliputi protein yang mengatur ekspresi gen lain, misalnya faktor transkripsi, protein kinase, dan protein yang mengatur biosintesa ABA. Menurut Cushman dan Bohnert (2000) setidaknya ada 8 kelompok gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi gennya, yaitu yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan. Beberapa gen yang berperan dalam mekanisme toleran kekeringan disajikan pada Tabel 1. Pada masa awal pengembangan tanaman toleran kekeringan, pendekatan yang digunakan adalah memanfaatkan atau meningkatkan ekspresi satu gen dengan fungsi tunggal seperti osmoprotektan, protein LEA, atau heat shock protein. Tanaman yang dihasilkan, berdasarkan pengamatan di Laboratorium atau di rumah kaca, memiliki ketahanan yang lebih baik dari tetuanya. Namun, hingga saat ini belum ada tanaman toleran kekeringan hasil rekayasa genetika yang telah berhasil dilepas secara komersial. Karena kompleksnya sifat toleran kekeringan yang melibatkan banyak gen penting, rekayasa satu enzim atau protein kelihatannya tidak cukup untuk membantu tanaman menghadapi kondisi cekaman kekeringan (Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki 2005; Bhatnagar-Mathur et al. 2008). Oleh karena itu akhir-akhir ini pengembangan padi toleran kekeringan dengan pendekatan rekayasa genetika diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang mengendalikan sekaligus beberapa gen terkait toleran kekeringan (Bhatnagar- Mathur et al. 2008). Faktor Transkripsi Faktor transkripsi, disebut juga faktor pengikat sekuen DNA tertentu (sequence-specific DNA-binding factor), adalah suatu protein yang menempel pada urutan DNA tertentu dan mengatur proses transkripsi satu atau lebih gen. Sejak sekuen lengkap genom beberapa tanaman berhasil diungkap, faktor transkripsi dapat diidentifikasi dengan lebih mudah menggunakan kajian

39 14 Tabel 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya Kelompok/ Fungsi Osmo protektan Reactive oxygen scavengers Protein stres Status air Komponen sinyal Kontrol transkripsi Pengatur pertumbuh an Kemungkinan mekanisme Penyesuaian osmotic (osmotic adjustment); perlindungan atau stabilisasi membrane/ protein, pemusnah reactive (OH-) Detoksifikasi spesies oksigen reaktif (ROS) Stabilisasi protein, stabilisasi membrane, chaperon Tingkah laku stomata, pengaturan jumlah AQP pada tonoplas dan membrane plasma Transduksi sinyal yang dimediasi oleh sensor Ca 2+ / fosforilasi Pengaktifan transkripsi Perubahan homeostasis hormon Produk Asam amino (prolin, ektoin) Senyawa dimetil sulfonium (glisin betain, DMSP) Polyol (mannitol, D-ononitol, sorbitol) Gula (sucrose, trehalose, fruktan) Enzim (catalase, Fe/Mn superoxide dismutase, askorbat peroksidase, enzim siklus glutation, glutathione S- transferase, glutation peroksidase, gammaglutamilsistein sintetase, alternative oksidase) Non enzim (askorbat, flavon, karotenoid, antosianin) Protein LEA (late embryogenesis abundant ); mis. dehidrin Aquaporin atau lubang (channel) air Homolog histidin kinase (AtRR1/2), MAP kinase 2+ (PsMAPK, HOG), Ca dependent protein kinase, SNF1/kinase, protein fosfatase (ABI1/2), system sinyal CAN/B,Ca 2+ sensor (SOS3), inositol kinase Faktor transkripsi famili: APETELA2 (AP2), bzip, zincfinger, MYB, MYC, NAC,HD-Zip Mengubah jalur biosintesis atau level konjugat ABA, sitokinin dan/atau brassinosteroid Gen Dadc (Capel et al. 2004), ectabc (Nakayama et al. 2000), AtP5CS (Yamada et al. 2005) CMO (Shirasawa et al. 2006) mtld (Karakas et al. 1997), IMT1 (Sheveleva et al. 1997) OtsA, OtsB (Garg et al. 2002) chlcu/zn SOD (Chatzidimitriadou et al. 2009), PpAPX (Li et al. 2009), SOD, APX (Lu et al. 2010), Eltayeb et al. 2007) HaDhn1,2 (Cellier et al. 1998), OsLEA3-1 (Xiao et al. 2007) OsPIP2-2 (Guo et al. 2006) OsMPK5 (Xiong & Yang 2003), OsSIK1 (Ouyang et al. 2010). OsDREB1 (Ito et al. 2006) OsbZIP23 (Xiang et al. 2008) WRKY11 (Wu et al. 2009), OsMyb4 (Mattana et al. 2005) SNAC1 (Hu et al. 2006) Hahb4 (Dezar et al. 2005a) ARR4 and ARR5 (Miyata et al. 1998) OsRR6 ( Jain et al. 2006)

40 15 bioinformatik. Konsorsium faktor transkripsi tanaman, menggunakan data dari 50 spesies tanaman, memperkirakan tanaman mengandung ribuan faktor transkripsi yang dibagi ke dalam 58 famili berdasarkan struktur dari domain penempelannya (binding domain) (Zhang et al. 2011). Jumlah ini diperkirakan akan meningkat dimasa mendatang seiring dengan bertambahnya spesies tanaman yang dipelajari. Setiap tanaman memiliki komposisi faktor transkripsi yang berbeda. Arabidopsis, misalnya, diprediksi mengandung 2023 faktor transkripsi yang dikelompokkan ke dalam 58 famili. Sementara padi Japonica dan Indica diprediksi masing-masing mengandung 2438 dan 1943 faktor transkripsi yang dikelompokkan kedalam 56 famili. Setiap famili memiliki anggota yang bervariasi jumlahnya mulai dari puluhan hingga ribuan anggota dan baru sedikit yang sudah dipelajari. Dari 58 famili faktor transkripsi yang ada pada tanaman beberapa dilaporkan terkait dengan toleran kekeringan, yaitu famili AP2/ERF, C2H2 Zinc finger, NF-YA, bzip, NAC, MYB, WRKY, dan HD-Zip. Beberapa contoh anggota dari masingmasing famili dan fungsi yang diperankan terkait dengan toleran kekeringan disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan Family Gen Mekanisme Pustaka AP2/ERF DREB Biosintesa osmoprotectan, Ito et al. 2006; protein LEA, & pengaturan Lopato & Langridge 2011 CBF4 HARDY GmERF3 SHN1/WIN1 pertumbuhan Pengaturan pertumbuhan Meningkatkan efisiensi penggunaan air (WUE) Biosintesa osmoprotektan Biosintesa lapisan lilin Haake et al Karaba et al Zhang et al Aharoni et al C2H2 Zinc dst Pengaturan stomata Huang et al Finger WRKY BhWRKY1 Signaling oligosakarida famili Wang et al rafinosa NF-YA NFYA5 Pengaturan stomata Li et al. 2008, Cominelli et al Seo et al MYB MYB96 Pengaturan lapisan lilin kutikula AtMYB60 Pengaturan stomata Cominelli et al NAC SNAC Pengaturan stomata Hu et al ONAC045 Zheng et al bzip PtrABF Scavenging ROS Huang et al Dezar et al. 2005a HD-Zip Hahb4 Pengaturan perpanjangan sel atau pertumbuhan

41 16 HD-Zip HD-Zip atau homeodomain leucin zipper protein adalah faktor transkripsi yang unik pada tumbuhan. Protein HD-Zip memiliki ciri yang unik yaitu adanya homeodomain (HD) dan leucin zipper motif yang penting untuk proses pembentukan protein dimer. Homo ataupun heterodimerisasi protein diperlukan dalam proses pengikatan DNA. Faktor transkripsi HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah lumut (Sakakibara et al. 2001), paku (Aso et al. 1999), hingga tumbuhan tingkat tinggi poplar (Populus tricocarpa) (Robischon et al. 2011), dari kelas monokotil seperti padi (Agalou et al. 2008) dan jagung (Whipple et al. 2011), maupun dikotil misalnya Arabidopsis (Henriksson et al. 2005), bunga matahari (Manavella et al. 2008), dan tumbuhan gurun Craterostigma plantagineum (Deng et al. 2002), tanaman C3 padi dan tanaman C4 jagung. Pusat bioinformatik China memprediksi secara total ada 1419 gen dari famili HD-Zip pada tanaman yang sudah diidentifikasi ( pku.edu.cn/ ). Pada Arabidopsis thaliana, misalnya, terdapat 56 gen HD-Zip, kemudian pada bunga matahari ada 15, sedangkan pada padi Indica dan pada padi Japonica secara berturut-turut adalah 46 dan 61 (Zhang et al. 2011). Gen HD-Zip ini dibagi kedalam empat sub-famili (I-IV) berdasarkan empat kriteria, yaitu; (1) konservasi domain HD-Zip yang menggambarkan spesifisitas pengikatan DNA, (2) struktur gen, (3) motif conserved tambahan, dan (4) berdasarkan fungsinya (Ariel et al. 2007). Perbedaan struktur protein dari masing-masing sub-famili diilustrasikan pada Gambar 2. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya pada berbagai tanaman menunjukkan gen HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam (Tabel 3). Beberapa protein HD-Zip yang terkenal adalah GLABRA dari sub-famili IV dan PHABULOSA, CORONA dan REVOLUTA dari sub-famili III. Gen GLABRA penting dalam pembentukan trikoma (Rerie et al. 1994), sedangkan gen REVOLUTA, PHABULOSA dan CORONA berperan dalam perkembangan daun, jaringan pembuluh dan inisiasi jaringan meristem (Prigge et al. 2005). Akhir-akhir ini gen dari faktor transkripsi HD-Zip khususnya sub-famili I dan II banyak dipelajari terkait respon kekeringan. Pada tanaman gurun yang sangat

42 17 toleran kekeringan Craterostigma plantagineum telah diisolasi 5 gen HD-Zip (CpHB3, 4, 5, 6, 7) responsif kekeringan (Deng et al. 2002). Sebelumnya, Frank et al. (1998) telah mengisolasi 2 gen HD-Zip (CpHB1 & 2) responsif kekeringan dari spesies yang sama. Namun, belum ada laporan lebih lanjut mengenai fungsi atau mekanisme toleran yang diperankan oleh masing gen HD-Zip ini dalam merespon kekeringan. Pada Arabidopsis 26 gen HD-Zip dari sub-famili I dan II telah berhasil diisolasi. Empat (AtHB5, 6, 7, dan 12) diantaranya responsif terhadap kekeringan. Kekeringan menurunkan ekspresi gen AtHB5 dan 6, dan sebaliknya meningkatkan ekspresi gen AtHB7 dan 12 (Ariel et al. 2007). Overekspresi gen AtHB7 dan 12 mengakibatkan tanaman menjadi lebih pendek karena panjang sel berkurang (Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004), namun belum membuktikan bahwa gen AtHB7 dan 12 meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Penelitian yang menunjukkan bahwa gen HD-Zip meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekurangan air dilaporkan oleh Dezar et al. (2005a) menggunakan gen Hahb-4 (HD-Zip sub-famili I) bunga matahari. Overekspresi Hahb-4 dengan promoter CaMV35S menyebabkan tanaman lebih toleran kekeringan dengan tingkat survival yang lebih tinggi dari tetuanya. Hal ini menunjukkan potensi pemanfaatan gen HD-Zip dalam perakitan tanaman toleran kekeringan di masa mendatang. Pada tanaman padi gen HD-Zip baru dipelajari beberapa tahun terakhir ini. Hasil analisis in silico terhadap sekuen utuh genom padi yang dilakukan oleh Agalou et al. (2008) berhasil mengidentifikasi 26 gen HD-Zip sub-famili I dan II. Delapan (yaitu OsHox4, 6, 11, 19, 20, 22, 24, dan 27) dari 26 gen HD-Zip tersebut responsif kekeringan pada dua varitas padi Zhensan97 (padi sawah sensitif kekeringan) dan IRAT109 (padi gogo toleran kekeringan) berdasarkan hasil analisis ekspresi menggunakan real-time PCR. Overekspresi OsHox4 menggunakan promoter CaMV35S pada tanaman Arabidopsis dan padi meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan. Namun, tanaman menjadi kerdil akibat ukuran sel yang pendek dan steril (Agalou et al. 2008). Hal ini mengindikasikan bahwa OsHox4 berperan dalam pemanjangan sel. Fungsi gen responsif kekeringan OsHox lainnya belum diketahui, sehingga analisis fungsi gen OsHox masih perlu dilakukan.