II. TINJAUAN PUSTAKA Padi Sebagai Tanaman Penting

Transkripsi

1 II. TINJAUAN PUSTAKA Padi Sebagai Tanaman Penting Padi tergolong ke dalam genus Oryza, sub-famili Oryzoideae, famili Poaceae kelas monocotyledoneae. Padi yang dibudidayakan tergolong ke dalam 2 spesies, yaitu Oryza sativa L. umum ditanam di Asia dan Oryza glaberrima Steud atau disebut juga padi Afrika. Dari kedua spesies tersebut O. sativa adalah yang paling banyak dibudidayakan. O. sativa diperkirakan terdiri dari sedikitnya 140,000 varietas dan secara umum dikelompokkan ke dalam 3 grup atau subspesies; yaitu Indica, Japonica dan Javanica (Tropical Japonica). Padi merupakan tanaman yang memiliki nilai ekonomi sangat penting, makanan pokok lebih dari separuh penduduk dunia. Berdasarkan nilai ekonomi tanaman pangan secara global tahun , padi menempati urutan teratas dibandingkan dengan tanaman pangan penting lainnya (jagung, gandum, kentang, singkong dan sorghum), sedangkan berdasarkan jumlah produksi, padi menempati urutan kedua setelah jagung (FAOSTAT 2009). Di Indonesia padi menempati urutan pertama dari 7 komoditas pangan utama baik dari segi produksi maupun nilai ekonomi (FAOSTAT 2009; BPS 2009). Selain sebagai makanan pokok, padi juga merupakan tanaman model untuk kelompok monokotil. Sebagai tanaman model padi memiliki ukuran genom yang relatif kecil ( 430 Mb), umur relatif singkat, dan jumlah set kromosom sederhana (diploid) ( sehingga memudahkan dalam analisis sekuen genom. Selanjutnya tersedianya protokol transformasi genetika tanaman padi dengan efisiensi tinggi (Hiei et al. 1994; Hiei & Komari 2006), peta fisik dan genetika dengan kepadatan tinggi (Harushima et al. 1998; Temnykh et al. 2001; McCouch et al. 2002), dan kenyataan bahwa antara tanaman sereal memiliki derajat synteni yang tinggi, menjadikan padi sebagai organisme yang unik untuk mempelajari fisiologi, biologi pertumbuhan dan perkembangan, serta genetika dan evolusi tumbuhan. Tahun 2002 sekuen lengkap genom padi berhasil diungkap dan dipublikasi (Goff et al. 2002; Yu et al. 2002), sebagai langkah awal dari upaya pemahaman tentang biologi padi pada level molekuler. Rice Annotation Project (2007)

2 10 memprediksi padi mengandung gen. Jumlah ini lebih sedikit dibandingkan dengan prediksi sebelumnya (30-50 ribu gen) oleh Goff et al. (2002). Sebanyak cdna utuh telah berhasil disekuen dan berdasarkan pencarian BLASTN dan BLASTX menunjukkan bahwa 75,86% diantaranya merupakan gen yang menyandikan protein yang mirip dengan data yang ada dipangkalan data (Rice Full-Length cdna Consortium 2003). Sisanya, masih belum dipelajari. Oleh karena itu tugas berikutnya adalah mempelajari fungsi dari gen-gen tersebut. Cekaman Kekeringan Kekeringan adalah salah satu faktor yang menghambat pertumbuhan dan produksi tanaman termasuk padi. Kekeringan menyebabkan kerugian ekonomi yang nyata (Kalsim 2007). Kerugian akibat kekeringan ditaksir mencapai milyaran rupiah setiap tahunnya. Kerugian akibat kekeringan sangat bergantung pada genotipe yang digunakan, fase pertumbuhan dimana kekeringan terjadi, dan lama serta tingkat keparahan kekeringan (Setter et al. 1995). Fase generatif merupakan fase yang sangat sensitif terhadap kekeringan (Yue et al. 2006). Kekeringan yang terjadi pada fase generatif dapat menyebabkan berkurangnya jumlah malai dan hasil, bahkan dapat mengakibatkan puso. Dalam beberapa tahun terakhir kasus kekeringan semakin sering terjadi akibat adanya perubahan iklim yang disebabkan oleh pemanasan global. Menurut prediksi menggunakan model perubahan iklim global berdasarkan data iklim dan produksi padi di Jawa dan bali 25 tahun terakhir mengindikasikan bahwa kekeringan akan semakin sering terjadi 50 tahun ke depan (Naylor et al. 2007). Oleh karena itu perakitan padi toleran kekeringan sangat penting untuk mengantisipasi fluktuasi iklim yang ekstrim. Untuk dapat merakit padi toleran kekeringan diperlukan pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada tanaman. Oleh karena itu kajian tentang mekanisme pengaturan sifat toleran kekeringan pada level molekuler sangat penting dilakukan. Data hasil kajian yang telah berhasil diperoleh hingga saat ini dapat dijadikan sebagai dasar di dalam upaya memahami sifat toleran kekeringan pada tanaman padi, dan juga pada

3 11 tanaman sereal lainnya. Tanaman toleran kekeringan adalah tanaman yang mampu hidup, tumbuh, dan memberikan hasil yang memuaskan pada kondisi air terbatas (Turner 1979, diacu dalam Fleury et al. 2010). Padi toleran kekeringan yang ideal adalah padi yang dalam kondisi tercekam kekeringan memberikan hasil yang tinggi dibandingkan padi lainnya (Fukai & Cooper 1995) atau memberikan hasil stabil dan mampu bertahan pada kondisi kekeringan (Price et al. 2002). Mekanisme Toleran Kekeringan pada Tanaman Tanaman tidak seperti makhluk hidup lain yang dapat bergerak atau berlari menghindar dari bahaya yang mengancam dirinya. Oleh karena itu untuk mengatasi cekaman lingkungan yang tidak menguntungkan, tanaman mengembangkan suatu mekanisme toleransi (Levit 1980; Mundree et al. 2002). Setiap tanaman memiliki kemampuan ini dengan derajat yang berbeda beda. Kemampuan tanaman dalam mengatasi cekaman lingkungan sangat dipengaruhi oleh mekanisme yang dimiliki tumbuhan untuk menghindari atau mengatasi cekaman yang dihadapinya dan tingkat keparahan cekaman. Untuk dapat mengatasi cekaman lingkungan, tanaman memberikan tanggapan dan adaptasi melalui perubahan morfologi, fisiologi, biokimia dan perkembangan, termasuk menginduksi ekspresi gen dan sintesis sejumlah protein (Takahashi et al. 2000). Tanaman yang berada di bawah cekaman menunjukkan perubahan pada aktivitas enzim daun, akumulasi mrna, fotosintesis, kandungan karbohidrat dan asam amino (Foyer et al. 1998). Secara umum mekanisme yang dikembangkan oleh tumbuhan untuk mengatasi cekaman lingkungan (kekeringan) dikelompokkan ke dalam tiga kelompok (Levit 1980; Chaves et al. 2003), yaitu escape, penghindaran (avoidance), dan toleran. Mekanisme adaptasi tanaman ini tidak saling terpisah. Suatu tanaman dapat menggabungkan berbagai mekanisme yang berbeda untuk proses adaptasi terhadap cekaman (Ludlow 1989, diacu dalam Chavez et al. 2003).

4 12 Identifikasi Gen yang Terlibat dalam Mekanisme Toleran Kekeringan Salah satu kunci utama dalam pemuliaan tanaman toleran kekeringan adalah mengetahui gen-gen yang mengendalikan sifat toleran kekeringan. Diduga ada ratusan gen yang terlibat dalam mekanisme toleran kekeringan. Berbagai pendekatan telah dilakukan untuk mengidentifikasi gen responsif kekeringan, diantaranya adalah substractive hybridization (Ouvrard et al. 1996; Deokar et al. 2011), differential display RT-PCR (Medini et al. 2009), cdna AFLP (Gao et al. 2009), dan DNA microarray (Seki et al. 2001; Seki et al. 2002; Rabbani et al. 2003; Lorenz et al. 2011). Seki et al. (2001) mengamati 1300 gen Arabidopsis menggunakan cdna microarray dan menemukan 40 gen terinduksi kekeringan, 14 diantaranya sudah pernah dilaporkan sebelumnya (rd29a/cor78, cor15a, kin1, kin2, rd17/cor47, erd10, dan rd20), sedangkan 30 sisanya belum diketahui fungsinya. Kemudian Seki et al. (2002) mengamati 7000 gen Arabidopsis lainnya dan menemukan 277 gen terinduksi kekeringan. Sebanyak 128 diantaranya ekspresinya hanya terinduksi oleh kekeringan, sedangkan sisanya diinduksi oleh kekeringan, salinitas, dan ABA. Rabbani et al. (2003) mengamati 1700 cdna tanaman padi menggunakan cdna microarray dan menemukan 67 gen terinduksi kekeringan, sebahagian diantaranya belum diketahui fungsinya. Akhir-akhir ini Gao et al. (2009) membandingkan ekspresi gen terinduksi kekeringan pada padi sawah dan padi gogo. Dari hasil kajian tersebut ditemukan bahwa ada 57 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi gogo dan 38 gen yang secara spesifik diekspresikan pada padi sawah mengindikasikan adanya ekspresi gen yang berbeda antara padi gogo dan padi sawah. Berdasarkan pengaturan ekspresinya Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (1997) membagi gen terinduksi kekeringan ke dalam dua kelompok, yaitu yang ekspresinya diinduksi oleh ABA (ABA-dependent) dan tidak diinduksi ABA (ABA-independent). Berdasarkan fungsinya, Shinozaki dan Yamaguchi-Shinozaki (2007) membagi produk dari gen-gen ini ke dalam 2 grup, yaitu: protein fungsional dan protein regulator. Protein fungsional meliputi protein yang berperan dalam merespon kekeringan misalnya protein yang berperan sebagai protease, water channel atau transporter, enzim detoksifikasi, protein faktor

5 13 makromolekul, (LEA protein dan Chaperon), dan enzim kunci untuk biosintesa osmolit (prolin, gula). Protein regulator meliputi protein yang mengatur ekspresi gen lain, misalnya faktor transkripsi, protein kinase, dan protein yang mengatur biosintesa ABA. Menurut Cushman dan Bohnert (2000) setidaknya ada 8 kelompok gen responsif kekeringan berdasarkan fungsi gennya, yaitu yang berperan dalam sintesa osmoprotektan, reactive oxygen spesies (ROS), protein stres, ion atau proton transporter, protein yang mengendalikan status air sel, komponen sinyal, kontrol transkripsi, dan pengaturan pertumbuhan. Beberapa gen yang berperan dalam mekanisme toleran kekeringan disajikan pada Tabel 1. Pada masa awal pengembangan tanaman toleran kekeringan, pendekatan yang digunakan adalah memanfaatkan atau meningkatkan ekspresi satu gen dengan fungsi tunggal seperti osmoprotektan, protein LEA, atau heat shock protein. Tanaman yang dihasilkan, berdasarkan pengamatan di Laboratorium atau di rumah kaca, memiliki ketahanan yang lebih baik dari tetuanya. Namun, hingga saat ini belum ada tanaman toleran kekeringan hasil rekayasa genetika yang telah berhasil dilepas secara komersial. Karena kompleksnya sifat toleran kekeringan yang melibatkan banyak gen penting, rekayasa satu enzim atau protein kelihatannya tidak cukup untuk membantu tanaman menghadapi kondisi cekaman kekeringan (Nakashima & Yamaguchi-Shinozaki 2005; Bhatnagar-Mathur et al. 2008). Oleh karena itu akhir-akhir ini pengembangan padi toleran kekeringan dengan pendekatan rekayasa genetika diarahkan pada penggunaan faktor transkripsi yang mengendalikan sekaligus beberapa gen terkait toleran kekeringan (Bhatnagar- Mathur et al. 2008). Faktor Transkripsi Faktor transkripsi, disebut juga faktor pengikat sekuen DNA tertentu (sequence-specific DNA-binding factor), adalah suatu protein yang menempel pada urutan DNA tertentu dan mengatur proses transkripsi satu atau lebih gen. Sejak sekuen lengkap genom beberapa tanaman berhasil diungkap, faktor transkripsi dapat diidentifikasi dengan lebih mudah menggunakan kajian

6 14 Tabel 1 Gen yang terlibat dalam respon terhadap cekaman kekeringan dan fungsinya Kelompok/ Fungsi Osmo protektan Reactive oxygen scavengers Protein stres Status air Komponen sinyal Kontrol transkripsi Pengatur pertumbuh an Kemungkinan mekanisme Penyesuaian osmotic (osmotic adjustment); perlindungan atau stabilisasi membrane/ protein, pemusnah reactive (OH-) Detoksifikasi spesies oksigen reaktif (ROS) Stabilisasi protein, stabilisasi membrane, chaperon Tingkah laku stomata, pengaturan jumlah AQP pada tonoplas dan membrane plasma Transduksi sinyal yang dimediasi oleh sensor Ca 2+ / fosforilasi Pengaktifan transkripsi Perubahan homeostasis hormon Produk Asam amino (prolin, ektoin) Senyawa dimetil sulfonium (glisin betain, DMSP) Polyol (mannitol, D-ononitol, sorbitol) Gula (sucrose, trehalose, fruktan) Enzim (catalase, Fe/Mn superoxide dismutase, askorbat peroksidase, enzim siklus glutation, glutathione S- transferase, glutation peroksidase, gammaglutamilsistein sintetase, alternative oksidase) Non enzim (askorbat, flavon, karotenoid, antosianin) Protein LEA (late embryogenesis abundant ); mis. dehidrin Aquaporin atau lubang (channel) air Homolog histidin kinase (AtRR1/2), MAP kinase 2+ (PsMAPK, HOG), Ca dependent protein kinase, SNF1/kinase, protein fosfatase (ABI1/2), system sinyal CAN/B,Ca 2+ sensor (SOS3), inositol kinase Faktor transkripsi famili: APETELA2 (AP2), bzip, zincfinger, MYB, MYC, NAC,HD-Zip Mengubah jalur biosintesis atau level konjugat ABA, sitokinin dan/atau brassinosteroid Gen Dadc (Capel et al. 2004), ectabc (Nakayama et al. 2000), AtP5CS (Yamada et al. 2005) CMO (Shirasawa et al. 2006) mtld (Karakas et al. 1997), IMT1 (Sheveleva et al. 1997) OtsA, OtsB (Garg et al. 2002) chlcu/zn SOD (Chatzidimitriadou et al. 2009), PpAPX (Li et al. 2009), SOD, APX (Lu et al. 2010), Eltayeb et al. 2007) HaDhn1,2 (Cellier et al. 1998), OsLEA3-1 (Xiao et al. 2007) OsPIP2-2 (Guo et al. 2006) OsMPK5 (Xiong & Yang 2003), OsSIK1 (Ouyang et al. 2010). OsDREB1 (Ito et al. 2006) OsbZIP23 (Xiang et al. 2008) WRKY11 (Wu et al. 2009), OsMyb4 (Mattana et al. 2005) SNAC1 (Hu et al. 2006) Hahb4 (Dezar et al. 2005a) ARR4 and ARR5 (Miyata et al. 1998) OsRR6 ( Jain et al. 2006)

7 15 bioinformatik. Konsorsium faktor transkripsi tanaman, menggunakan data dari 50 spesies tanaman, memperkirakan tanaman mengandung ribuan faktor transkripsi yang dibagi ke dalam 58 famili berdasarkan struktur dari domain penempelannya (binding domain) (Zhang et al. 2011). Jumlah ini diperkirakan akan meningkat dimasa mendatang seiring dengan bertambahnya spesies tanaman yang dipelajari. Setiap tanaman memiliki komposisi faktor transkripsi yang berbeda. Arabidopsis, misalnya, diprediksi mengandung 2023 faktor transkripsi yang dikelompokkan ke dalam 58 famili. Sementara padi Japonica dan Indica diprediksi masing-masing mengandung 2438 dan 1943 faktor transkripsi yang dikelompokkan kedalam 56 famili. Setiap famili memiliki anggota yang bervariasi jumlahnya mulai dari puluhan hingga ribuan anggota dan baru sedikit yang sudah dipelajari. Dari 58 famili faktor transkripsi yang ada pada tanaman beberapa dilaporkan terkait dengan toleran kekeringan, yaitu famili AP2/ERF, C2H2 Zinc finger, NF-YA, bzip, NAC, MYB, WRKY, dan HD-Zip. Beberapa contoh anggota dari masingmasing famili dan fungsi yang diperankan terkait dengan toleran kekeringan disajikan pada Tabel 2. Tabel 2 Contoh faktor transkripsi tanaman dan peranannya dalam respon kekeringan Family Gen Mekanisme Pustaka AP2/ERF DREB Biosintesa osmoprotectan, Ito et al. 2006; protein LEA, & pengaturan Lopato & Langridge 2011 CBF4 HARDY GmERF3 SHN1/WIN1 pertumbuhan Pengaturan pertumbuhan Meningkatkan efisiensi penggunaan air (WUE) Biosintesa osmoprotektan Biosintesa lapisan lilin Haake et al Karaba et al Zhang et al Aharoni et al C2H2 Zinc dst Pengaturan stomata Huang et al Finger WRKY BhWRKY1 Signaling oligosakarida famili Wang et al rafinosa NF-YA NFYA5 Pengaturan stomata Li et al. 2008, Cominelli et al Seo et al MYB MYB96 Pengaturan lapisan lilin kutikula AtMYB60 Pengaturan stomata Cominelli et al NAC SNAC Pengaturan stomata Hu et al ONAC045 Zheng et al bzip PtrABF Scavenging ROS Huang et al Dezar et al. 2005a HD-Zip Hahb4 Pengaturan perpanjangan sel atau pertumbuhan

8 16 HD-Zip HD-Zip atau homeodomain leucin zipper protein adalah faktor transkripsi yang unik pada tumbuhan. Protein HD-Zip memiliki ciri yang unik yaitu adanya homeodomain (HD) dan leucin zipper motif yang penting untuk proses pembentukan protein dimer. Homo ataupun heterodimerisasi protein diperlukan dalam proses pengikatan DNA. Faktor transkripsi HD-Zip ditemukan pada berbagai tumbuhan, mulai dari tumbuhan tingkat rendah lumut (Sakakibara et al. 2001), paku (Aso et al. 1999), hingga tumbuhan tingkat tinggi poplar (Populus tricocarpa) (Robischon et al. 2011), dari kelas monokotil seperti padi (Agalou et al. 2008) dan jagung (Whipple et al. 2011), maupun dikotil misalnya Arabidopsis (Henriksson et al. 2005), bunga matahari (Manavella et al. 2008), dan tumbuhan gurun Craterostigma plantagineum (Deng et al. 2002), tanaman C3 padi dan tanaman C4 jagung. Pusat bioinformatik China memprediksi secara total ada 1419 gen dari famili HD-Zip pada tanaman yang sudah diidentifikasi ( pku.edu.cn/ ). Pada Arabidopsis thaliana, misalnya, terdapat 56 gen HD-Zip, kemudian pada bunga matahari ada 15, sedangkan pada padi Indica dan pada padi Japonica secara berturut-turut adalah 46 dan 61 (Zhang et al. 2011). Gen HD-Zip ini dibagi kedalam empat sub-famili (I-IV) berdasarkan empat kriteria, yaitu; (1) konservasi domain HD-Zip yang menggambarkan spesifisitas pengikatan DNA, (2) struktur gen, (3) motif conserved tambahan, dan (4) berdasarkan fungsinya (Ariel et al. 2007). Perbedaan struktur protein dari masing-masing sub-famili diilustrasikan pada Gambar 2. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya pada berbagai tanaman menunjukkan gen HD-Zip memiliki fungsi yang sangat beragam (Tabel 3). Beberapa protein HD-Zip yang terkenal adalah GLABRA dari sub-famili IV dan PHABULOSA, CORONA dan REVOLUTA dari sub-famili III. Gen GLABRA penting dalam pembentukan trikoma (Rerie et al. 1994), sedangkan gen REVOLUTA, PHABULOSA dan CORONA berperan dalam perkembangan daun, jaringan pembuluh dan inisiasi jaringan meristem (Prigge et al. 2005). Akhir-akhir ini gen dari faktor transkripsi HD-Zip khususnya sub-famili I dan II banyak dipelajari terkait respon kekeringan. Pada tanaman gurun yang sangat

9 17 toleran kekeringan Craterostigma plantagineum telah diisolasi 5 gen HD-Zip (CpHB3, 4, 5, 6, 7) responsif kekeringan (Deng et al. 2002). Sebelumnya, Frank et al. (1998) telah mengisolasi 2 gen HD-Zip (CpHB1 & 2) responsif kekeringan dari spesies yang sama. Namun, belum ada laporan lebih lanjut mengenai fungsi atau mekanisme toleran yang diperankan oleh masing gen HD-Zip ini dalam merespon kekeringan. Pada Arabidopsis 26 gen HD-Zip dari sub-famili I dan II telah berhasil diisolasi. Empat (AtHB5, 6, 7, dan 12) diantaranya responsif terhadap kekeringan. Kekeringan menurunkan ekspresi gen AtHB5 dan 6, dan sebaliknya meningkatkan ekspresi gen AtHB7 dan 12 (Ariel et al. 2007). Overekspresi gen AtHB7 dan 12 mengakibatkan tanaman menjadi lebih pendek karena panjang sel berkurang (Hjellstrom et al. 2003; Olsson et al. 2004), namun belum membuktikan bahwa gen AtHB7 dan 12 meningkatkan ketahanan terhadap kekeringan. Penelitian yang menunjukkan bahwa gen HD-Zip meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekurangan air dilaporkan oleh Dezar et al. (2005a) menggunakan gen Hahb-4 (HD-Zip sub-famili I) bunga matahari. Overekspresi Hahb-4 dengan promoter CaMV35S menyebabkan tanaman lebih toleran kekeringan dengan tingkat survival yang lebih tinggi dari tetuanya. Hal ini menunjukkan potensi pemanfaatan gen HD-Zip dalam perakitan tanaman toleran kekeringan di masa mendatang. Pada tanaman padi gen HD-Zip baru dipelajari beberapa tahun terakhir ini. Hasil analisis in silico terhadap sekuen utuh genom padi yang dilakukan oleh Agalou et al. (2008) berhasil mengidentifikasi 26 gen HD-Zip sub-famili I dan II. Delapan (yaitu OsHox4, 6, 11, 19, 20, 22, 24, dan 27) dari 26 gen HD-Zip tersebut responsif kekeringan pada dua varitas padi Zhensan97 (padi sawah sensitif kekeringan) dan IRAT109 (padi gogo toleran kekeringan) berdasarkan hasil analisis ekspresi menggunakan real-time PCR. Overekspresi OsHox4 menggunakan promoter CaMV35S pada tanaman Arabidopsis dan padi meningkatkan ketahanan tanaman terhadap kekeringan. Namun, tanaman menjadi kerdil akibat ukuran sel yang pendek dan steril (Agalou et al. 2008). Hal ini mengindikasikan bahwa OsHox4 berperan dalam pemanjangan sel. Fungsi gen responsif kekeringan OsHox lainnya belum diketahui, sehingga analisis fungsi gen OsHox masih perlu dilakukan.

10 18 Gambar 2 Skema struktur protein unik dari setiap sub-famili HD-Zip. HD homeodomain, LZ leucin zipper, CPSCE asam amino konservatif Cys, Pro, Ser, Cys, Glu dengan sandi satu huruf, domain MEKHLA asam amino konservatif Met, Glu, Lys, His, Leu, Ala, N-term consensus ujung-n, SAD START-adjacent domain, START (steroidogenic acute regulatory protein-related lipid transfer ( Ariel et al. 2007). Tabel 3 Sub-famili HD-Zip dan fungsinya Sub-famili Fungsi HD-Zip I Respon terhadap cekaman abiotik, respon terdap ABA, de-etiolasi, sinyal cahaya biru HD-Zip II Respon terhadap keadaan pencahayaan,toleran naungan (Shade avoidance), respon terhadap auxin HD-Zip III Embriogenesis, pengaturan meristem, inisiasi organ lateral, polaritas daun, perkembangan jaringan pembuluh, transport auxin HD-Zip IV Differensiasi sel epidermis, akumulasi antosianin, perkembangan akar, pembentukan trikom Sumber: Ariel et al Analisis Fungsi Gen Tujuan jangka panjang dari proyek sekuensing genom adalah diketahuinya fungsi setiap gen yang ada di dalam genom dan bagaimana interaksinya dengan gen lain. Data ini sangat penting dalam memahami biologi tanaman pada level molekuler dan untuk memuliakan tanaman pada masa mendatang. Secara umum ada 2 pendekatan untuk melakukan analisis fungsi gen, yaitu dengan pendekatan forward dan reverse genetic (Peters et al. 2003). Forward genetic adalah pendekatan yang digunakan untuk mengidentifikasi gen yang bertanggung jawab menentukan fenotipe tertentu dalam suatu organisme. Sebaliknya reverse genetic meliputi pendekatan yang digunakan untuk mengetahui fenotipe dari suatu gen tertentu.

11 19 Forward genetic secara umum dilakukan untuk mengindentifikasi gen atau mutasi gen yang menentukan fenotipe mutan yang spesifik. Fenotipe mutan yang spesifik menjadi bahan dasar kajian dari forward genetic. Tanaman mutan diperoleh dari hasil mutasi alam atau mutasi buatan. Mutasi alam terjadi sangat jarang dan kemungkinannya sangat kecil sehingga untuk mendapatkan populasi mutan yang besar diperlukan induksi mutasi. Ada beberapa pendekatan yang digunakan untuk menginduksi mutasi pada tanaman, yaitu dengan menggunakan senyawa kimia (mis. EMS, NaN 3 ), radiasi ion (mis. sinar gamma), transformasi T-DNA atau dengan penyisipan transposon (Ramachandran & Sundaresan 2001; Walden 2002; Kim et al. 2006; Al-Qurainy & Khan 2009; Suprasanna et al. 2009). Identifikasi gen dari mutan hasil induksi dengan senyawa kimia atau iradiasi sinar gamma membutuhkan proses yang panjang dan memerlukan waktu dan tenaga yang banyak karena harus menggunakan teknik map-based cloning (Peters et al. 2003). Sebaliknya, identifikasi gen pada mutan yang diperoleh dengan transformasi T-DNA dan penyisipan transposon lebih mudah dan cepat dengan menggunakan sequen yang ada pada daerah T-DNA atau transposon sebagai pelacak. Namun, keberhasilan insersi T-DNA dan transposon biasanya tergantung pada genotipe tanaman yang digunakan dan hanya dapat dilakukan pada tanaman dimana sistem transformasinya sudah dikuasai dengan baik (Gepts et al. 2008). Secara ringkas tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi gen menggunakan teknik map-based cloning atau disebut juga positional cloning adalah; (1) membuat populasi mapping yang besar dengan menyilangkan tanaman mutan dengan tipe liarnya, (2) mengidentifikasi marka yang bertautan (linkage) erat dengan gen target, (3) mengidentifikasi pustaka YAC (yeast artificial chromosom) atau BAC (bacterial artificial chromosom) yang berhibridisasi dengan pelacak marka, (4) membuat atau mencari marker baru dari YAC atau BAC (biasanya sekuen dari ujung klon) yang berkosegregasi dengan gen target, (5) skrining ulang (jika diperlukan) dari klon YAC atau BAC yang berbeda untuk memperoleh marker yang berkosegregasi dengan gen target, (6) mengidentifikasi kandidat gen dari klon BAC atau YAC yang berkosegregasi dengan gen target, (7) melakukan komplementasi genetika, dengan transformasi kandidat gen ke

12 20 tanaman mutan, untuk memulihkan fenotipe tipe liar, dan terakhir (8) menyekuen gen dan mengidentifikasi sekuen untuk menentukan fungsinya (McClean 1998). Saat ini banyak teknik yang dikembangkan untuk memudahkan identifikasi gen pada tanaman menggunakan pendekatan insertional mutagenesis. Beberapa dari teknik tersebut adalah T-DNA tagging, transposon tagging, retrotransposon tagging, activation tagging, dan entrapmen tagging. Masing-masing memiliki keunggulan dan kelemahan (Jeon & An 2001; Ramachandran & Sundaresan 2001). DNA tagging atau gene tagging secara sederhana dapat diartikan sebagai penandaan atau pelabelan gen sehingga mudah dilacak. Pada dasarnya tahapan yang dilakukan untuk mengidentifikasi gen pada mutan hasil insertional mutagenesis adalah sama meskipun teknik insertional mutagenesis yang dipilih berbeda. Tahapan yang dilakukan meliputi (1) pembentukan populasi mutan yang besar menggunakan teknik transformasi tanaman, (2) karakterisasi molekuler mutan untuk mencari galur-galur dengan satu salinan, (3) penapisan galur mutan stabil dengan teknik PCR, (4) penapisan galur stabil dengan fenotipe yang diharapkan, (5) isolasi sekuen DNA yang mengapit daerah yang diberi label (mis. dengan thermal asymmetric interlaced (TAIL) PCR, adapter-ligated PCR, inverse PCR, atau plasmid rescue), (6) Sekuensing DNA yang mengapit daerah yang diberi label dan identifikasi sekuen untuk menentukan fungsinya dengan studi bioinformatik (Vandenbusschea et al. 2003). Pendekatan reverse genetic memanfaatkan data yang ada di pangkalan data hasil proyek sekuen genom, EST, atau transcript profiling. Reverse genetic dimulai dengan pemilihan gen target kemudian melihat pengaruh yang ditimbulkan terhadap fenotipenya akibat perubahan yang dibuat pada gennya. Secara umum pendekatan yang digunakan untuk mempelajari fungsi gen secara reverse genetika terdiri dari beberapa percobaan; (1) menghilangkan fungsi (loss of function) gen target, (2) meningkatkan fungsi (gain of function) gen target, (3) tracking dan (4) kajian ekspresi ( engineering) Percobaan untuk menghilangkan fungsi suatu gen melibatkan pembuatan atau manipulasi DNA secara in vitro dengan teknik tertentu sehingga gen tersebut menjadi tidak fungsional. Dalam menghilangkan fungsi suatu gen dikenal istilah

13 21 knockout dan silencing gen. Knockout gen menghilangkan fungsi gen dengan mengubah suatu sekuen gen menjadi tidak aktif sedangkan silencing gen menghilangkan fungsi gen dengan menghambat proses transkripsinya (Thorneycroft et al. 2001). Knockout dapat dilakukan diantaranya dengan insersi T-DNA atau transposon (Thorneycroft et al. 2001), sedangkan silencing dapat dilakukan dengan teknik RNAi (Kusaba 2004). Konstruk gen dari hasil modifikasi ditransformasikan kembali ke dalam genom tanaman untuk melihat pengaruhnya pada fenotipe yang dikendalikan. Kegiatan meningkatkan fungsi (gain of function) suatu gen adalah kebalikan dari loss of function. Kegiatan ini biasanya diparalelkan dengan loss of function untuk mendapatkan data atau hasil yang lebih komprehensif. Prosesnya sama seperti loss of function hanya konstruknya dirancang untuk meningkatkan fungsi gen. Umumnya dengan menambah ekstra salinan gen disertai dengan penggunakan promoter yang lebih kuat (Lloyd 2003; Cho & Hong 2006) Tracking dilakukan untuk menggali informasi tentang lokalisasi dan interaksi protein terkait. Salah satu cara untuk melakukan ini adalah menggabungkan sekuen gen aslinya dengan gen pelapor misalnya green fluorescent protein (GFP) yang memudahkan visualisasi produk modifikasi genetika dalam sel atau jaringan tanaman (Boulin et al. 2006; Ko et al. 2007). Kajian ekspresi bertujuan mengetahui dimana dan kapan protein tertentu dihasilkan. Dalam melakukan penelitian ekspressi gen, promoter gen target difusikan dengan suatu gen pelapor (mis. gus, atau GFP) dan ditransformasikan kembali ke dalam sistem tanaman. Expresi gen kemudian diamati pada berbagai sel atau jaringan, pada tahap pertumbuhan tertentu, atau pada kondisi lingkungan tertentu (Boulin et al. 2006; Ko et al. 2007). Transformasi Genetika Tanaman Transformasi genetika tanaman adalah salah satu teknik yang sangat penting dalam penelitian biologi molekuler dan pemuliaan tanaman. Transformasi genetika memungkinkan pemindahan dan penyisipan satu atau beberapa DNA/gen dari berbagai sumber (bakteri, fungi, hewan dan tumbuhan) ke dalam suatu genom tanaman. Teknik transformasi genetika pada tanaman secara umum dibagi ke

14 22 dalam 2 kelompok, yaitu teknik transformasi langsung (penembakan DNA, elektroporasi, mikroinjeksi, dan PEG), dan dengan bantuan bakteri Agrobacterium (Jahne et al. 1995; Komari et al. 1998; Tzfira & Citovsky 2006). Teknik transformasi secara langsung dapat diaplikasikan pada berbagai jenis tanaman, namun cenderung menyisipkan gen dengan jumlah salinan banyak pada satu lokus (Dai et al. 2001). Hal ini menyebabkan tingginya DNA rearrangement (penyusunan kembali) atau pembungkaman gen, sehingga dapat menimbulkan kesalahan dalam interpretasi data (Kohli et al. 1998; Reddy et al. 2003). Transformasi Agrobacterium merupakan teknik yang paling umum digunakan saat ini, karena memiliki kelebihan antara lain tidak memerlukan peralatan yang mahal, dapat diaplikasikan secara luas baik pada kelompok tanaman dikotil maupun monokotil, pola integrasi DNA lebih mudah diprediksi dan yang paling penting adalah kemungkinan untuk mendapatkan tanaman dengan satu salinan gen sangat tinggi (Roy et al. 2000; Dai et al. 2001). Tanaman homozigot dengan satu salinan gen sangat penting didalam pemuliaan tanaman dan kajian fungsi gen karena tanaman dianggap sudah stabil dan lebih mudah dalam interpretasi datanya. Secara alami Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor pada tumbuhan dari kelas dikotiledoneae. Dalam sistematika mikroorganisme Agrobacterium diklasifikasikan sebagai berikut: Kingdom : Bacteria Phylum : Proteobacteria Class : Alpha Proteobacteria Ordo : Rhizobiales Famili : Rhizobiaceae Genus : Agrobacterium ( Agrobacte rium) Tumor disebabkan oleh suatu plasmid Agrobacterium yang sangat besar yang kemudian disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing). Plasmid Ti mengandung T-DNA yang diapit oleh 23 pasang sekuen basa berulang dan satu set gen virulen (vira, virb, virc, vird, vire, virg, dan virh) yang diperlukan

15 23 untuk mengangkut T-DNA dari sel bakteri dan menyisipkannya ke dalam genom tanaman. T-DNA mengandung gen penyandi senyawa opine (octopin, nopalin, atau leucinopin) yang diperlukan oleh Agrobacterium dan gen penyandi hormon pertumbuhan tanaman yang mengakibatkan pertumbuhan sel tidak terkendali dan membentuk tumor. Proses transfer gen oleh Agrobacterium sudah banyak diulas sebelumnya diantaranya oleh Sheng dan Citovsky (1996) dan Tinland (1996). Hasil penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa T-DNA dapat dipisahkan secara fisik dari gen virulen menjadi dua plasmid yang terpisah yang kemudian dikenal dengan sistim biner (Hoekema et al. 1984). Sifat onkogenik tetap terpelihara selama kedua plasmid berada di dalam Agrobacterium yang sama. Selanjutnya setiap DNA asing yang disisipkan ke dalam T-DNA dapat ditransfer ke dalam sel tanaman. Hal ini sangat menguntungkan karena plasmid lebih kecil dan mudah dimanipulasi. Selanjutnya onkogen dapat dihilangkan dari T-DNA agar tanaman tumbuh normal, dan situs restriksi unik ditambahkan untuk memudahkan penyisipan gen asing (Riva et al. 1998; Lee & Gelvin 2008). Transformasi Agrobacterium kemudian digunakan secara luas pada tanaman dikotil, namun tidak pada monokotil karena tanaman dari kelompok ini bukan inang dari Agrobacterium. Keberhasilan transformasi dari kelompok monokotil pertama kali dilaporkan oleh Hiei et al. (1994) pada tanaman padi Japonica kultivar Tsukinohikasi, Asanohikari, dan Koshihikari. Dari berbagai eksplan yang diuji, kalus embriogenik dari skutellum umur tiga hari adalah bahan yang paling sesuai untuk infeksi Agrobacterium. Kalus diko-kultivasi dengan A. tumefaciens strain LBA4404 dan EHA101, masing-masing mengandung plasmid ptok233 atau pig121hm, selama tiga hari pada media mengandung 100 µm asetosyringon. Plasmid ptok233 dan pig121hm masing-masing mengandung gen penanda gus dan penyeleksi hpt. Hasil analisis berdasarkan gen β-glucuronidase (gus) dan gen penyeleksi hygromycin phosphotransferase (hpt) pada tanaman transgenik R1 dan R2 menunjukkan integrasi, ekspresi, dan pewarisan gen yang stabil (Hiei & Komari 1996). Meskipun efisiensi transformasi Agrobacterium masih dianggap rendah pada saat itu dan sulit untuk padi Indica, penelitian ini telah menginspirasi peneliti untuk meningkatkan efisiensi transformasi pada tanaman padi. Faktorfaktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi pada tanaman banyak

16 24 dipelajari, diantaranya pengaruh genotipe tanaman, strain Agrobacterium, plasmid, senyawa penginduksi gen virulen (vir), komposisi media, dan jaringan yang digunakan (Opabode 2006). Faktor lain yang juga penting menentukan keberhasilan transformasi tanaman adalah perlakuan osmotik pada eksplan, lama ko-kultivasi, kerapatan A. tumefaciens, pengeringan eksplan, perlakuan antinekrotik, suhu selama ko-kultivasi, penambahan surfaktan, media inokulasi dan ko-kultur, antibiotik dan agen penyeleksi yang digunakan. Saat ini transformasi tanaman padi Japonica sangat mudah dilakukan dengan efisiensi transformasi yang tinggi. Selanjutnya protokol transformasi untuk tanaman padi Indica juga sudah tersedia (Toki 1997; Saharan et al. 2004; Lin & Zhang 2005; Hiei & Komari 2006). Sejumlah sifat agronomi penting telah ditransformasi ke dalam genom tanaman padi dengan bantuan Agrobacterium untuk meningkatkan ketahanan cekaman biotik dan abiotik, dan meningkatkan kualitas nutrisinya (Roy et al. 2000). Higga saat ini Agrobacterium masih dianggap sebagai satu-satunya genus bakteri yang mampu melakukan transfer gen ke dalam genom tanaman dan digunakan secara luas pada tanaman termasuk padi. Namun, kebanyakan teknologi yang terlibat di dalamnya dilindungi oleh paten di berbagai belahan dunia, yang kebanyakan dipegang oleh perusahaan multi nasional. Hal ini dapat menjadi kendala dalam pemanfaatan teknik ini untuk pemuliaan tanaman (Jambresic 2005), sehingga ada upaya untuk mencari bakteri alternatif selain Agrobacterium. Adanya kenyataan bahwa gen virulen dan T-DNA yang terlibat dalam transfer gen tidak dipatenkan kemudian dimanfaatkan untuk merekayasa bakteri selain Agrobacterium untuk digunakan sebagai agen transfer gen. Ide ini pertama kali direalisasikan oleh Broothaerts et al. (2005) yang merekayasa bakteri dari golongan Rhizobia agar dapat dimanfaatkan sebagai agen transfer gen. Bakteri yang tergolong ke dalam kelompok Rhizobia adalah bakteri tanah yang sudah lama dikenal berasosiasi dengan tanaman membentuk bintil akar yang penting untuk proses fiksasi nitrogen dari udara (Weir 2011). Contoh bakteri yang tergolong ke dalam kelompok Rhizobia adalah Rhizobium, Mesorhizobium,

17 25 Ensifer/Shinorhizobium, dan Bradyrhizobium. Semua masuk dalam famili Rhizobiaceae. Proses transfer gen yang terjadi pada Rhizobia hasil rekayasa adalah dengan melibatkan gen virulen dan T-DNA dari Agrobacterium (Broothaerts et al. 2005). Ti plasmid dimodifikasi sehingga lebih mudah dimobilisasikan ke berbagai genus Rhizobia termasuk Rhizobium, Sinorhizobium dan Mesorhizobium. Bakteri ini kemudian diuji dengan mentransformasikannya ke tiga tanaman model dari latar belakang genetika yang berbeda, yaitu padi, tembakau dan Arabidopsis. Ketiga spesies ini mampu melakukan transfer gen pada ketiga tanaman model meskipun dengan efisiensi yang rendah. Efisiensi transformasi padi dengan S. meliloti hanya 0.6% berdasarkan uji GUS dibandingkan dengan 50-80% menggunakan Agrobacterium. Optimasi transformasi dengan memperhatikan faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan transformasi pada tanaman perlu dilakukan untuk meningkatkan efisiensi transformasi tanaman dengan bantuan Rhizobia. Frekuensi yang rendah transformasi Agrobacterium pada beberapa spesies atau kultivar yang sulit, secara perlahan dapat ditingkatkan dengan manipulasi pada 20 tahun yang lalu (Gelvin 2005). Hingga saat ini informasi tentang penggunaan bakteri selain Agrobacterium sebagai agen transfer masih sangat terbatas.