PENGARUH RADIASI TERHADAP PERTUMBUHAN Plasmodium falciparum STRAIN NF54 STADIUM ERITROSITIK

Transkripsi

1 PENGARUH RADIASI TERHADAP PERTUMBUHAN Plasmodium falciparum STRAIN NF54 STADIUM ERITROSITIK Darlina a, Harry Nugroho E.S. a, Dita M.E. b, dan Siti Nurhayati a a Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi - BATAN b Institut Sains dan Teknologi Nasional ABSTRAK PENGARUH RADIASI TERHADAP PERTUMBUHAN Plasmodium falciparum STRAIN NF54 STADIUM ERITROSITIK. Iradiasi gamma dapat digunakan untuk melemahkan parasit malaria P.falciparum untuk preparasi vaksin. Sebagai studi awal dalam pengembangan bahan dasar vaksin malaria dengan teknologi nuklir, dilakukan penelitian pengaruh radiasi gamma terhadap pertumbuhan P.falciparum NF54. P.falciparum NF54 merupakan strain yang memproduksi gametosit. Tujuan penelitian untuk mendapatkan dosis melemahkan P.falciparum NF54 pada stadium eritrositik. Pengaruh iradiasi terhadap pertumbuhan parasit dievaluasi dari persen parasitemia dan sebaran bentuk parasit. Pada penelitian digunakan sinar gamma dari Cobalt 60 dengan dosis radiasi 125 Gy, 150 Gy, dan 175 Gy dengan laju dosis 380,5 kgy/jam. Dari hasil penelitian disimpulkan bahwa radiasi dapat melemahkan parasit ditunjukkan dari ditemukannya bentuk parasit yang degeneratif, parasit yang tidak diradiasi parasitemianya meningkat hingga hari ke-5 (2,5%) pada parasit yang diradiasi pertumbuhannya terus menurun. Dosis 125 dan 150 Gy memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan 175 Gy dilihat dari grafik penurunan parasitemia. Pertumbuhan gametosit tidak ditemukan setelah radiasi Kata kunci: Malaria, vaksin, P. Falciparum NF54, parasitemia, iradiasi ABSTRACT RADIATION EFFECTS ON GROWTH Plasmodium falciparum NF54 ERITROSITIK STADIUM. Gamma irradiation can be used to weaken the malaria parasite for vaccine preparation. P.falciparum is the parasites that infect humans. P. falciparum strain NF54 was producing gametocytes. As a preliminary study in malaria vaccine development base material with nuclear technology, conducted on the effect of gamma irradiation dose on the growth of P.falciparum. The aim is to get a dose of weakened so that it can inhibit parasite growth. Effect of irradiation on the growth of the parasite were evaluated from the percent parasitemia and the distribution form of the parasite. In this study used doses of 125 Gy, 150 Gy, and 175 Gy with dose rate of Gy / hour. The results show that the discovery of post-radiation degenaratif parasites, parasites that are not irradiated its parasitemia increased until day 5 (2.5%) in the irradiated parasite growth continues to decline. 125 and 150 Gy doses give better results than 175 Gy that reduced parasitemia seen from the graph. Form of is the dominant form during the days of observation Key words: Malaria, vaccine, P.falciparum NF54, parasitemia, irradiation PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 97

2 I. PENDAHULUAN P.falciparum parasit malaria yang paling ganas menyerang manusia. Parasit ini dapat menyumbat aliran darah ke otak, menyebabkan mengigau, koma, serta kematian [1]. Di Indonesia, malaria tersebar di seluruh pulau dengan derajat endemisitas yang berbeda-beda. Spesies yang terbanyak dijumpai adalah P. falciparum dan P. vivax. Pada tahun 2003 malaria sudah tersebar di desa pada 226 kabupaten di 30 provinsi. Kondisi tersebut diperberat dengan semakin luasnya parasit yang resisten terhadap obat anti malaria yang selama ini digunakan dan nyamuk yang resisten terhadap insektisida. Kemampuan parasit untuk tahan terhadap obat baru dan kemampuan vektor nyamuk untuk tahan terhadap insektisida, membuat vaksin terhadap malaria sangat dibutuhkan [2]. Plasmodium mempunyai dua siklus hidup yaitu siklus aseksual pada vertebrata yang berlangsung di sel darah dan organ lainnya dan siklus seksual yang dimulai pada vertebrata dan selanjutnya pada nyamuk Anopheles. Di dalam tubuh nyamuk dan inangnya Plasmodium mempunyai empat stadium perkembangan yang setiap stadium dikarakterisasikan oleh perbedaan ekspresi antigen, misalnya CSP pada stadium sporozoit, MSP dan TRAP pada stadium eritrositik. Berdasarkan sasaran antigen yang sesuai dengan stadium perkembangan parasit dan fungsinya, vaksin malaria dapat dibedakan menjadi 3 jenis yaitu: 1) Vaksin pra eritrositik (vaksin anti infeksi), dengan target sporozoit, 2) Vaksin eritrositik stadium aseksual (vaksin anti penyakit), dengan target merozoit bebas atau yang berinvasi ke sel darah merah. 3) Vaksin eritrositik stadium seksual (vaksin penghambat transmisi), bertujuan untuk menghambat pertumbuhan atau fertilisasi stadium seksual parasit [3]. Proses patologi pada malaria adalah akibat siklus eritrosit. Siklus eritrositik dimulai dengan keluarnya merozoit dari skizon matang di hati masuk ke dalam sirkulasi darah. Merozoit masuk ke dalam eritrosit parasit membesar menjadi sel tunggal yang disebut tropozoit, mengalami pembelahan inti dan berkembang membentuk beberapa merozoit yang disebut proses skizogoni. Setelah proses skizogoni selesai, eritrosit akan pecah melepaskan merozoit ke dalam plasma selanjutnya akan menyerang eritrosit lain dan memulai proses baru. Beratnya penyakit malaria berhubungan dengan densitas parasit, serta berhubungan dengan kemampuan parasit bermultiplikasi baik di dalam hati maupun di dalam eritrosit. Siklus eritrositik ini menimbulkan tanda dan gejala karakteristik dan tidak mereda sampai hospes tersebut mati atau mengaktifkan respon imun yang mampumembunuh atau menekan pertumbuhan parasit [4]. Melemahkan (atenuasi) mikroorganisma patogen merupakan strategi untuk pengembangan vaksin sejak pertama kali vaksin ditemukan [Louis Pasteur]. Radiasi PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 98

3 gamma dapat digunakan untuk menginaktifkan mikroorganisma untuk preparasi vaksin, disamping metode inaktifasi secara pemanasan atau kimia [5]. Iradiasi gamma digunakan untuk melemahkan parasit malaria dalam stadium darah untuk preparasi vaksin stadium darah yang diharapkan dapat menghambat pertumbuhan dan perkembangan plasmodium di dalam eritrosit dan menyebabkan reduksi parsial parasitemia. Dari penelitian terdahulu telah diperoleh hasil Gy merupakan dosis untuk melemahkan P.berghei stadium eritrositik [6]. Pada penelitian ini akan digunakan Plasmodium falciparum dengan kisaran dosis radiasi 125 Gy 175 Gy dengan laju dosis 380,4 Gy/jam. Tujuan penelitian adalah untuk mendapatkan dosis yang optimal untuk melemahkan parasit P. falciparum NF54 stadium eritrositik. II. TATA KERJA Bahan uji Plasmodium falciparum strain NF54 diperoleh dari Lembaga biologi molekuler Eijkman Institute. Bahan kultur yang digunakan antara lain, RPMI (GIBCO), Gentamycin dan Hepes (SIGMA), serta serum dan sel darah merah manusia. Propagasi P.falciparum pada kultur in vitro: P.falciparum dalam bentuk cryo dicairkan dan dicuci dengan NaCl dengan beberapa konsentrasi, kemudian ditumbuhkan dalam kultur pada cawan petri yang berisi RPHS dengan hematokrit 4%. Medium pertumbuhan diperbaharui setiap hari [7]. Radiasi P.falciparum NF54 Kultur parasit yang parasitemianya sudah mencapai 5% dipindahkan ke tabung dan sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 7 menit untuk memisahkan parasit kemudian dibagi menjadi beberapa tabung sesuai dengan perlakuan yang diinginkan. Iradiasi dilakukan dengan menggunakan fasilitas IRPASENA di PATIR-BATAN dengan variasi dosis yaitu 0 (kontrol), 125 Gy, 150 Gy, dan 175 Gy, dengan laju dosis 380,5 Gy/jam. Parasit yang telah diradiasi, diinokulasikan ke dalam lempeng sumur uji yang berisi 2 ml medium lengkap dengan hematokrit 4 % dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 48 jam. Pengamatan Pengamatan jumlah parasit dilakukan pada awal inokulasi dengan membuat sediaan apus darah tipis. Apusan dibiarkan mengering kemudian difiksasi dengan metanol. Apusan diwarnai dengan 5 % larutan Giemsa dan dibiarkan selama 20 menit [7]. Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000x. Jumlah parasit yang hidup dihitung di bawah mikroskop. Persentase pertumbuhan (parasitemia) dihitung dengan cara menghitung jumlah PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 99

4 darah yang terinfeksi parasit pada zat uji dan kontrol terhadap sel darah merah. III. HASIL DAN PEMBAHASAN Dari hasil pengamatan kultur parasit yang akan diuji diperiksa jumlah parasitnya sebelum dan setelah radiasi melalui apusan tipis (Tabel 1). terlihat adanya penurunan jumlah parasit yang berbeda beda dari ketiga dosis. Dosis 150 Gy mengalami penurunan parasitemia yang terbanyak dibandingkan dengan kedua dosis yang lain. Pada kultur parasit paska radiasi terlihat ditemukannya parasit bentuk degeneratif yaitu mulai mengecilnya sitoplasma dengan inti yang terpulas lebih gelap atau gambaran inti yang piknotik pada apusan tipis Setelah dilakukan iradiasi dengan beberapa variasi dosis (125, 150, 175 Gy) hari ke-9. Pada Gambar 1 terlihat pertumbuhan P.falciparum yang tidak diradiasi terus meningkat hingga hari ke-5 mencapai 2,5%, kemudian menurun hingga hari ke-9 mencapai 1,4%. Pertumbuhan parasit yang diradiasi dengan dosis 175 Gy parasitemia sedikit fluktuasi tetapi pertumbuhan parasit cenderung menurun, hingga hari ke-9 pertumbuhan parasit 0,14%. Pada parasit yang diradiasi dengan dosis 150 Gy pertumbuhannya menurun tajam dari hari ke-2 mencapai 0.11% hampir tidak terjadi kenaikan pertumbuhan parasit hingga hari ke-9. Demikian juga pertumbuhan parasit yang diradiasi dengan dosis 125 Gy menurun tajam dari hari ke-2 hingga mencapai 0,19% dan hampir tidak terjadi kenaikan hingga hari terakhir pengamatan. dengan laju dosis 380,5 Gy/jam dilakukan pengkulturan kembali untuk melihat pertumbuhan parasit setelah iradiasi hingga Dosis radiasi (Gy) Tabel 1. Jumlah parasit sebelum dan setelah radiasi % parasitemia Sebelum iradiasi % parasitemia Setelah iradiasi Penurunan Parasit (%) Kontrol 0,75 0, ,93 0,74 0, ,4 0,8 0, ,15 0,88 0,27 PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 100

5 Dari Tabel 1 dan Gambar 1 terlihat adanya pengaruh radiasi terhadap parasit. Radiasi memberikan efek yang bersifat spesifik yaitu, dapat melemahkan dan mematikan sel sehingga pertumbuhannya akan terhenti atau terhambat. Grafik pertumbuhan parasit yang disajikan pada Gambar 1 menunjukkan bahwa dosis radiasi 150 Gy memberikan hasil yang optimum dibandingkan 125 Gy dan 175 Gy. Gambar 1. Pengaruh radiasi terhadap pertumbuhan semua bentuk P.falciparum stadium eritrositik Pada pengamatan sebaran bentuk morfologi P.falciparum yang tidak diradiasi dan yang diradiasi menunjukkan bahwa bentuk atau morfologi cincin (ring) dan tropozoit dari parasit merupakan bentuk yang selalu muncul dalam darah kultur sepanjang pengamatan sedangkan skizon sedikit yaitu di bawah 0,1% kecuali pada hari ke-5 yang mencapai 0,24%. Cincin merupakan bentuk yang dominan dengan angka pertumbuhan yang tertinggi 1,37% pada hari ke-5, bentuk tropozoit angka pertumbuhan tertinggi sekitar 1,18% pada hari ke-6 (Gambar 2). Pada sebaran morfologi parasit yang diradiasi dengan dosis 125 Gy menunjukkan bentuk atau morfologi cincin tetap merupakan yang dominan sepanjang pengamatan (Gambar 3). Pada awal pengkulturan bentuk cincin merupakan bentuk dominan dengan parasitemia 0,23%, angka parasitemia tropozoit 0,2% sedangkan skizon 0,07%. Di hari berikutnya pertumbuhan bentuk cincin cenderung menurun hingga hari ke-8 pertumbuhannya mencapai 0,09%. Pada hari ke-8 bentuk tropozoit pertumbuhannya sekitar 0,01% bahkan bentuk skizon pada hari ke-2 pertumbuhannya 0. Dengan demikian bentuk cincin merupakan bentuk yang dominan sepanjang hari pengamatan. PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 101

6 1,6 P a r a s i t e m i a (%) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, H a r i Cincin Tropozoit Skizon Gambar 2. Sebaran morfologi P.falciparum yang tidak diradiasi (kontrol) 0,25 P a r a s i t e m i a (%) 0,2 0,15 0,1 0,05 Cincin Tropozoit Skizon H a r i Gambar 3. Sebaran morfologi P.falciparum yang diradiasi dengan dosis 125 Gy Pada P.falciparum yang diradiasi dengan 150 Gy (Gambar 4), bentuk tropozoit merupakan bentuk yang dominan pada awal pengkulturan yaitu sekitar 0,33 %, bentuk cincin 0,23% dan skizon 0,076%. Hari berikutnya bentuk tropozoit turun menjadi 0,05%, bentuk cincin 0,1%, dan skizon 0%. Sepanjang pengamatan bentuk cincin merupakan bentuk yang dominan. PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 102

7 P a r a s i t e m i a (%) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, H a r i Cincin Tropozoit Skizon Gambar 4. Sebaran morfologi P.falciparum yang diradiasi dengan dosis 150 Gy 0,6 P a r a s i t e m i a (%) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Cincin Tropozoit Skizon H a r i Gambar 5. Sebaran morfologi P.falciparum yang diradiasi dengan dosis 175 Gy Pada P.falciparum yang diradiasi dengan dosis 175 Gy [Gambar 6], bentuk tropozoit merupakan bentuk yang dominan (0,53%), bentuk cincin sekitar 0,33%, bentuk skizon 0,12%. Hingga hari ke-2 bentuk tropozoit masih tetap yang dominan, tetapi hari berikutnya bentuk cincin merupakan bentuk yang dominan. Plasmodium sp merupakan protozoa obligat intraseluler (hemaprotozoa) yaitu parasit yang hidup dalam sel darah merah inangnya. Dalam satu siklus di dalam darah parasit mengalami 3 perkembangan yaitu merozoit (cincin), tropozoit dan skizon. Keseluruhan siklus aseksual eritrosit disebut periodesitas skizogoni yang lamanya berbeda beda pada masing spesies yaitu 48 jam untuk P.vivax, P.ovale, P.falciparum dan 72 jam untuk P.malariae. Setelah masuk ke dalam eritrosit merozoit bentuknya membulat seperti cincin tumbuh membesar, setelah 26 jam vakuola menghilang dan parasit berbentuk sel PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 103

8 tunggal dinamakan tropozoit. Tropozoit bentuk iregular dengan sitoplasma berbentuk ameboid dan adanya titik schufner yang merupakan ciri khasnya. Selanjutnya nukleus tropozoit membelah sampai 3-5 kali menjadi titik kecil, disusul dengan pembelahan sitoplasma, maka terbentuklah skizon (Proses skizogoni). Setelah pembelahan inti dan perbanyakan organella dan diikuti dengan pembelahan sitoplasma maka terbentuklah merozoit. Setelah pembentukan merozoit selesai, eritrosit akan ruptur dan melepaskan merozoit keluar [8]. Untuk setiap tahap perkembangan memerlukan waktu yang dibutuhkan berbeda beda. Proses perkembangan merozoit menjadi bentuk tropozoit membutuhkan waktu 26 jam. Perkembangan tropozoit hingga berubah menjadi skizon membutuhkan waktu 18 jam. Sedangkan proses perkembangan skizon hingga melepaskan merozoit 14 jam [9]. Dengan demikian proses skizogoni membutuhkan waktu yang paling singkat sehingga dalam pengamatan bentuk skizon merupakan bentuk yang paling sedikit ditemukan. Radiasi pengion memiliki ciri khusus karena kemampuannya untuk penetrasi sel dan jaringan sehingga memberikan energi pada sel dalam bentuk ionisasi. Target utama penyinaran adalah materi genetik atau DNA. Dalam pembuatan bahan vaksin, jenis radiasi yang biasanya digunakan adalah sinar gamma yang memiliki sifat daya tembus tinggi dan panjang gelombang pendek. Dosis iradiasi yang optimum akan menghancurkan DNA, sehingga membuat mikroorganisme tidak mampu melakukan replikasi [10]. Replikasi DNA selama stadium aseksual terjadi selama pematangan skizon yang diikuti dengan pembelahan mitotik. Skizon terbagi secara asinkron saat pembelahan nukleus, dengan membran nukleus bertindak sebagai dinding untuk setiap nucleus menjamin mereka akan terpisah satu sama lain dalam sel multinucleate [11]. Efek radiasi bersifat biphasic menunjukkan adanya komponen yang radioresisten dan radiosensitif. Sebuah campuran tropozoit dan skizon pengaruh radiasi lebih besar dibandingkan bentuk cincin, menunjukkan bahwa stadium eritrositik adalah lebih rentan selama fase G2 dan fase pembelahan terhadap radiasi [12]. Hal ini terlihat dari sebaran morfologi tropozoit dan skizon lebih rendah dibandingkan bentuk cincin. Secara keseluruhan radiasi akan mempengaruhi pertumbuhan semua bentuk parasit hal ini terlihat dari makin menurunnya pertumbuhan semua bentuk parasit walapun ada sedikit terjadi fluktuasi. Berbeda dengan pertumbuhan parasit pada kultur yang tidak diradiasi yang mengalami kenaikan pertumbuhan hingga hari ke-5. Terjadinya penurunan pertumbuhan parasit setelah hari ke- 5 karena tempat yang dgunakan yaitu sumur uji dengan kapasitas medium 2 ml tidak cukup memadai sebagai tempat pertumbuhan parasit. PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 104

9 Tabel 2. Pertumbuhan bentuk gametosit pada kultur yang tidak diradiasi dengan yang diradiasi Hari ke- % Parasitemia Kontrol (0 Gy) % Parasitemia 125 GY % Parasitemia 150 Gy % Parasitemia 175 Gy 0 1, , , , ,004 0, , , , , P.falciparum strain NF54 merupakan strain yang memproduksi gametosit [13]. Gametosit merupakan bentuk seksual pada stadium eritrositik. Gametosit akan berkembang menjadi sporozoit di dalam tubuh nyamuk. Nyamuk yang mengandung sporozoit di dalam kelenjar ludahnya merupakan vektor yang akan menularkan malaria. Pada kultur yang tidak diradiasi bentuk gametosit masih ditemukan dalam kultur walaupun jumlahnya menurun. Pada kultur yang diradiasi mulai dari hari ke-5 hingga hari terakhir pengamatan tidak ditemukan gametosit dalam kultur. Hal ini menunjukkan radiasi dapat menghambat pertumbuhan gametosit yang nantinya akan mencegah terbentuknya sporozoit di nyamuk sehingga tidak terjadi penularan dari nyamuk ke manusia. IV. KESIMPULAN Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa setelah radiasi terjadi penurunan jumlah parasit dan ditemukan parasit bentuk degeneratif. Parasit yang diradiasi pertumbuhannya terus menurun hingga di bawah 0,2 %. Dilihat dari pertumbuhan semua bentuk parasit serta pertumbuhan bentuk gametosit maka dosis radiasi 150 Gy merupakan dosis yang optimal untuk melemahkan P.falciparum NF54. Sebaran bentuk morfologi yang dominan pada parasit yang diradiasi maupun yang tidak diradiasi sepanjang pengamatan adalah bentuk cincin. PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 105

10 DAFTAR PUSTAKA 1. COX F., History of Human Parasitology, Clin. Microbiol. Rev. 15 (4), 2002, JAKARTA POST, Malaria cases in Indonesia increases to about 3M in 2007: Health Oficial Says, January 21, WORLD HEALTH ORGANIZATION, Initiative for Vaccine Research, State the art of vaccine research and development, (2005), 4. GILES HM, The malaria parasites, in Giles HM, Warrel DA (Eds), Bruce Chwatt, essential malariaology, 3th. Ed., Edward Arnold, London, 1993, BIELLO, D., Irradiated pathogens used to create potent vaccine, Science News, July 26, DARLINA dan TETRIANA, D., Daya infeksi Plasmodium berghei stadium eritrositik yang diiradiasi sinar gamma, Prosiding Pertemuan Ilmiah PTKMR Jakarta, LJUNGSTROM I., PERLAMAN,H.,. SCHILCHTHERLE, M., SHERE, A., and WAHLGREEN, M., Methods In Malaria Research, MR4/ATCC, Manassas Virginia, HARINASUTA T. & BUNNAY D: The Clinical Features of Malaria, In: Wernsdorfer WH. & Mc.Gregor SI (eds.) Malaria Principles and Practice of Malariology, Churchills Livingstone, London, Vol.1, 1988, SILANUT et. al. The Devlopment stages of Plasmodium falciparum post infection, American Journal of Pathology, 155: , 1999, 10. BENNETH, C., THATCHER, S., TOLMAN-HULSBERG, J., POWERS, M., MILWARDM H., NIELSEN, D., and TENG, D.H.F., Comparison of gammairradiated and triazol-treated RNA viruses using the joint biological agent identification and diagnostic, Idaho Technology Inc., Salt Lake City, UT, FATIMA de M., FERREIRA-DA-CRUZ, ANTONIO TEVA., In activation of Plasmodium falciparum parasites using g- irradiation, Mem.Inst., Oswaldo Cruz vol 92 no.1 Rio de Janeiro, TRIGG P.I., R.S. PHILLIPS and W.E. GUTTERIDGE, The effects of gamma radiation on Plasmodium knowlesi, International journal for parasitology vol.2 issue 1 March 1972, MILLER P., ATKINSON CT, AIKAWA M., HOLLINGDALE MR., COLLINS WE., Strain specificity in the liver-stage development of P.falciparum NF54 in primary cultures of new worl monkey hepatocytes. Am j Trop Med Hyg 45(2); , TANYA JAWAB 1. Penanya : Zubaidah Alatas Pertanyaan : Apa hubungan antara hasil yang diperoleh dari penelitian ini dengan bahan vaksin malaria tropika? Jawaban: Penelitian ini merupakan penelitian awal untuk menentukan dosis optimal yang dapat melemahkan P. falciparum, sehingga dapat digunakan sebagai dosis rujukan untuk melemahkan Plasmodium dari spesies yang lain. PTKMR-BATAN, BAPETEN, KEMENKES-RI dan Pusarpedal-KLH 106