STUDI AWAL PENGEMBANGAN VAKSIN MALARIA DENGAN TEKNIK NUKLIR : PENGARUH IRADIASI GAMMA PADA Plasmodium berghei TERHADAP DAYA TAHAN MENCIT

Transkripsi

1 STUDI AWAL PENGEMBANGAN VAKSIN MALARIA DENGAN TEKNIK NUKLIR : PENGARUH IRADIASI GAMMA PADA Plasmodium berghei TERHADAP DAYA TAHAN MENCIT Darlina dan Devita T Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BATAN Jl. Lebak Bulus Raya No. 49, Jakarta ABSTRAK STUDI AWAL PENGEMBANGAN VAKSIN MALARIA DENGAN TEKNIK NUKLIR : PENGARUH IRADIASI GAMMA PADA Plasmodium berghei TERHADAP DAYA TAHAN MENCIT. Pemanfaatan irradiasi gamma untuk menghasilkan vaksin malaria sampai saat ini masih diteliti. Penelitian untuk pengembangan vaksin malaria banyak menggunakan model Plasmodium berghei dengan mencit sebagai hospes. Tujuan penelitian adalah mencari dosis iradiasi yang melemahkan Plasmodium berghei sehingga mencit yang terinfeksi dapat bertahan hidup lebih lama. Penelitian ini merupakan studi awal untuk mendapatkan bahan dasar vaksin malaria. P. berghei stadium eritositik yang diiradiasi dengan sinar gamma kemudian diujikan ke mencit melalui penyuntikan secara intraperitoneal. Efek iradiasi pada Plasmodium berghei terhadap daya tahan mencit diamati dengan melihat gejala klinis yang timbul, penurunan berat badan, dan lama hidup mencit paska infeksi. Hasil menunjukkan bahwa mencit yang diinfeksi dengan Plasmodium berghei yang dilemahkan dengan dosis iradiasi 150 dan 175 Gy tidak menunjukkan gejala klinis dan penurunan berat badan yang berarti serta umurnya lebih panjang, disamping itu 175 Gy merupakan dosis optimal yang melemahkan Plasmodium berghei dan mencit mampu bertahan hidup lebih lama setelah imunisasi ulang. Kata kunci: Iradiasi gamma, Plasmodium berghei, vaksin, malaria ABSTRACT PRELIMINARY OF VACCINE MALARIA DEVELOPMENT WITH NUCLEAR TECHNIC : THE EFFECT OF GAMMA IRRADIATION ON Plasmodium berghei TO RESISTANCE of MICE. The gamma irradiation benefit for produce malaria vaccine is still studied until now. Generally the research on malaria vaccine developments by using Plasmodium berghei and the mice as model. This research was conducted to know an optimal dose of gamma irradiation that has parasite inhibition growth and the effect of irradiated P. berghei erithrocytic stage to mice life span, as a basic study to get malaria vaccine candidate. To reach out of this study s aim, irradiated P. berghei were inoculated to mice. The effect of radiation dose at Plasmodium berghei was evaluated with observation the clinic symptom, the reduce body weight, and the mortality of infected mice. The result showed that mice which was infected Plasmodium berghei irradiated with dose 150 and 175 Gy give the better outcome than another radiation dose, the infected mice was not showed the significant of clinic symptom and reducing in body weight, and the longer periode of life in this group. The results showed that 175 Gy was the attenuated-irradiated dose and repeated immunization could increase mice life span. Key words: Gamma irradiation, Plasmodium berghei, vaccine, malaria 299

2 1. PENDAHULUAN Malaria merupakan salah satu penyakit yang tersebar luas dan paling banyak menimbulkan kematian. Penyakit ini disebabkan oleh infeksi protozoa obligat intraseluler (hemaprotozoa) dari genus plasmodium. Malaria dapat menyerang mulai dari hewan melata, pengerat (rodensia), primata, burung, dan manusia. Dasar biologi plasmodium yang menyerang rodensia sama dengan plasmodium yang menyerang manusia baik siklus hidup maupun morfologinya, genetik dan pengaturan genome, fungsi dan struktur kandidat vaksin antigen target [1]. Oleh karena itu penelitian terhadap berbagai aspek parasitologi, imunologi, dan pengembangan vaksin malaria banyak menggunakan parasit rodensia dan mencit sebagai hospes. Selain itu penelitian interaksi parasit dengan hospesnya (in vivo) dapat dilakukan dengan parasit rodensia. Plasmodium berghei adalah hemoprotozoa yang menyebabkan penyakit malaria pada rodensia, terutama rodensia kecil. Plasmodium berghei banyak digunakan dalam penelitian pengembangan biologi parasit malaria pada manusia karena tersedia teknologi pembiakan secara in vitro dan pemurnian pada tahapan siklus hidup, pengetahuan pada susunan genom dan pengaturannya. Bahkan secara molekuler, Plasmodium berghei sama seperti plasmodium menginfeksi manusia,[2]. Dengan Model ini dapat dilakukan manipulasi pada hospes, sehingga dapat dipelajari perubahan imunologis yang terjadi selama infeksi. Upaya pengembangan vaksin malaria masih terus dilakukan karena pemberantasan malaria sampai saat ini masih menghadapi berbagai kendala diantaranya semakin luasnya plasmodium yang resisten terhadap obat anti malaria dan nyamuk vector yang resisten terhadap berbagai insektisida. Salah satu alternatif solusi masalah tersebut adalah tindakan pencegahan terhadap infeksi malaria dengan cara imunisasi [3]. Vaksin malaria yang secara efektif mampu melindungi tubuh terhadap infeksi dan komplikasi saat ini belum ditemukan. Berbagai metode imunisasi sudah pernah dicoba pada beberapa binatang percobaan dengan tujuan untuk mendapatkan proteksi yang optimal terhadap infeksi malaria. Vaksin malaria yang sudah pernah diteliti adalah vaksin terhadap 3 stadium perkembangan plasmodium yaitu vaksin terhadap sporozoit, vaksin terhadap parasit stadium eritrositik bentuk aseksual dan bentuk seksual. Vaksin malaria stadium eritrositik ditujukan untuk menghambat perkembangan parasit di dalam eritrosit.serta mengurangi manifestasi klinis yang timbul. Vaksin tersebut umumnya hanya menyebabkan reduksi parsial parasitemia [3]. Pemanfaatan iradiasi gamma untuk menghasilkan suatu immunogen yang potensial sudah banyak diteliti. Pemberian immunogen yang diiradiasi sinar gamma ternyata dapat menghasilkan antibodi yang dapat menahan serangan infeksi parasit [4].. Yadev telah membuktikan bahwa pemberian immunisasi lebih dari satu kali Plasmodium berghei yang telah diiradiasi sinar gamma menghasilkan mencit yang lebih tahan hidup dan mempunyai kekebalan yang lebih besar terhadap penyakit malaria, dibandingkan dengan satu kali imunisasi. Hoffman menyatakan bahwa dosis optimal untuk melemahkan P. falciparum stadium sporozoit adalah antara Gy. Dosis optimal dan efektivitas sinar gamma untuk stadium eritrositk belum diketahui [4]. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh dosis radiasi pada Plasmodium berghei terhadap daya tahan mencit yang terinfeksi. Dosis radiasi diberikan kepada Plasmodium berghei stadium eritrositik. Daya tahan hidup mencit dievaluasi dengan mengamati gejala klinis dan lama hidup mencit. Dipelajari pengaruh dosis radiasi terhadap Plasmodium berghei pada stadium eritrositik adalah sebagai studi awal untuk mempelajari bahan dasar vaksin. 2. BAHAN DAN TATA KERJA Hewan percobaan yang digunakan mencit (Swiss Webster) dewasa berumur sekitar 2 3 bulan dengan berat badan gram yang diperoleh dari Lembaga Gizi. Mencit diberi makan pelet dan minum air secara ad libitum. Plasmodium berghei ANKA diperoleh dari Departemen Kesehatan Jakarta. Parasit yang digunakan Plasmodium berghei ANKA. Pembiakan parasit dilakukan dengan cara menginfeksikannya ke dalam tubuh mencit. Setiap hari dilakukan pemeriksaan darah dengan cara memotong ujung ekornya. Dibuat hapusan tebal dan tipis menggunakan pewarna Giemsa. Bila jumlah P. berghei sudah cukup banyak, mencit segera dianastesi dengan eter dan darahnya diambil langsung dari jantung dengan menggunakan alat suntik 1 ml. 300

3 Gambar 1. Inokulasi Plasmodium berghei yang telah diirradiasi pada mencit secara intraperitoneal Darah dicampur dengan antikoagulan (citrat phospat dextrose atau CPD) dan ditampung dalam tabung eppendorf. Selanjutnya dilakukan iradiasi dengan variasi dosis 0, 75, 100, 125, 150, 175 Gy menggunakan Irradiator Gamma Cell 220. Iradiasi ini dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi - BATAN. Sebelum dilakukan irradiasi jumlah P. berghei dihitung per 1 ml dengan menggunakan hemasitometer. Inokulasi P. berghei sebanyak 0,2 0,3 ml (± 1 x 10 6 parasit) dilakukan secara intraperitoneal pada setiap mencit (Gambar 1). Inokulasi ke dua (Booster) dilakukan dalam selang waktu 2 minggu. Pengamatan dilakukan pada hari ke-1 hingga 29 meliputi angka ke matian (mortalitas) dari mencit dan gejala klinis yang muncul (berat badan dan keadaan fisik). 3. HASIL DAN PEMBAHASAN Mencit mulai memperlihatkan gejala klinis seminggu setelah inokulasi pertama. Gejala klinis anemia seperti selaput lendir mata, moncong, jari kaki dan ekor yang menjadi pucat, terlihat pada mencit yang terinfeksi dengan Plasmodium berghei yang telah diiradiasi dengan dosis 0, 75, 100, 125 Gy (Tabel 1). Anemia terjadi karena sel darah merah yang mengandung parasit yang mengalami hemolisis akibat fragilitas osmotik yang meningkat. Faktor lain yang menyebabkan anemia karena autohemolisis osmotik dari eritrosit yang berparasit maupun yang tidak berparasit. Hemolisis ini terjadi sebagai respon antigen-antibodi. Autoimun menyebabkan destruksi eritrosit yang terinfeksi maupun yang tidak terinfeksi [5]. Setelah sel darah merah pecah skizon atau bentuk plasmodium dalam darah akan keluar dan masuk ke dalam saluran kapiler organ dalam seperti ginjal, usus, hati dan limpa bahkan jaringan otak. Plasmodium yang menyerang ginjal menyebabkan glomerulonefritis akut. Gejala klinis ini terlihat dari cara berjalan kiposis dari mencit yang terinfeksi Plasmodium berghei telah diiradiasi dengan dosis 0, 75, 100, 125 Gy. Cara berjalan kiposis ini merupakan salah satu cara menahan rasa sakit di dalam rongga perut [6]. Berbeda pada mencit yang diinfeksi dengan Plasmodium berghei yang diiradiasi pada dosis 150 dan 175 Gy. Mencit ini tidak memperlihatkan gejala klinis, tetapi masih dalam kondisi normal dan aktif. Setelah seminggu paska infeksi mencit akan menjadi lesu, lemah, dan bulu berdiri serta kehilangan nafsu makan dan minum sehingga kekurangan cairan tubuh, dan terjadi penurunan berat badan. Rerata berat badan mencit mengalami fluktuatif, tetapi setelah hari ke 11 hingga menjelang kematian, berat badan mengalami penurunan. Berbeda pada mencit yang diinfeksi dengan Plasmodium berghei yang diiradiasi dengan dosis 150 dan 175 Gy, terlihat rerata berat badan mengalami kenaikan sampai hari ke-29, hal ini mungkin karena dosis radiasi yang diberikan menimbulkan efek melemahkan Plasmodium berghei sehingga bagaikan mencit yang tidak terinfeksi. (Gambar 2). Tabel 1. Gejala klinis yang muncul pada mencit setelah satu minggu paska infeksi DOSIS RADIASI (Gy) GEJALA KLINIS Kontrol Kepucatan selaput mata Kepucatan moncong dan kaki Bulu berdiri Keterangan : + = menunjukkan gejala klinis - = tidak menunjukkan gejala klinis 301

4 Daya tahan hidup mencit ditunjukkan selain dari gejala klinis juga dari angka mortalitas mencit. Iradiasi dapat menimbulkan efek melemahkan Plasmodium berghei sehingga mencit yang diinfeksi Plasmodium berghei yang dilemahkan dapat memberikan respon imun dan meningkatkan daya tahan hidupnya. Daya tahan hidup mencit diperlihatkan grafik pada Gambar 3. Rata-rata berat badan (g/ekor) Waktu (hari) 0 Gy 75 Gy 100 Gy 125 Gy 150 Gy 175 Gy Gambar 2. Rerata berat badan mencit yang terinfeksi Plasmodium berghei paska irradiasi Mencit yang diinfeksi dengan Plasmodium berghei yang tidak diiradiasi (0 Gy) mempunyai rerata daya tahan hidup 12 hari paska inokulasi. Kematian lebih cepat ini disebabkan Plasmodium berghei tidak lemah sehingga dapat berkembang biak serta menginfeksi mencit dengan cepat dan menyebabkan kematian. Day a Tahan ( hari) Inokulasi I Dosis (Gy) Inokulasi II Gambar 3. Pengaruh dosis irradiasi pada Plasmodium berghei terhadap lama hidup mencit yang terinfeksi Mencit yang diinokulasi Plasmodium berghei yang diiradiasi 75 Gy mempunyai rerata daya tahan hidup 18 hari paska inokulasi pertama dan 3 hari paska inokulasi kedua. Mencit yang diinokulasi Plasmodium berghei yang diiradiasi 100 Gy mempunyai rerata daya tahan hidup 19 hari paska inokulasi pertama dan 4 hari paska inokulasi kedua. Mencit yang diinokulasi Plasmodium berghei yang diradiasi 125 Gy mempunyai rerata daya tahan hidup 23 hari paska inokulasi pertama dan 7 hari paska inokulasi kedua. Hal ini menunjukan radiasi sedikit memberikan efek melemahkan, dan ini terlihat dari semakin besar dosis iradiasi yang diberikan kepada parasit semakin lama daya tahan hidup mencit. Namun demikian efek radiasi tersebut belum cukup menurunkan viabilitas parasit sehingga efek inokulasi ke dua tidak seperti yang diharapkan dapat menimbulkan respon imun tetapi menyebabkan parasit bertambah virulen. Mencit yang diinokulasi Plasmodium berghei dengan dosis radiasi 150 Gy mempunyai rerata daya tahan hidup 28 hari paska inokulasi pertama dan 11 hari paska inokulasi kedua. Mencit yang diinokulasi dengan Plasmodium berghei dengan dosis radiasi 175 Gy mempunyai rerata daya tahan hidup terpanjang yaitu 29 hari paska inokulasi pertama dan 12 hari paska inokulasi kedua. Dari data di atas dapat dilihat dosis 150 dan 175 Gy lebih efektif melemahkan Plasmodium berghei sehingga viabilitas parasit menjadi rendah dan mencit dapat bertahan hidup lebih lama. Beberapa strain mencit laboratorium yang terinfeksi Plasmodium berghei menyebabkan kematian dalam waktu 1 hingga 3 minggu paska infeksi dan beberapa binatang menunjukkan komplikasi serebral. Faktor luar tambahan dapat mempengaruhi virulensi dari parasit. Plasmodium berghei yang diberi perlakuan tertentu menunjukan penurunan virulensi. Sebagai contoh isolat NK65 yaitu Plasmodium berghei yang dihasilkan dari iradiasi menunjukan penurunan parasitemia pada mencit yang diinokulasi isolat tersebut [7]. 4. KESIMPULAN Pengaruh iradiasi gamma pada Plasmodium berghei terhadap daya tahan mencit menunjukkan bahwa iradiasi dapat melemahkan Plasmodium berghei sehingga virulensi menurun. Semakin tinggi dosis iradiasi semakin turun viabilitas Plasmodium berghei dan menurunnya viabilitas Plasmodium berghei akan semakin menurunkan virulensinya, sehingga peluang hidup mencit yang terinfeksi semakin besar. Hal ini terlihat pada mencit 302

5 yang diinokulasi Plasmodium berghei yang diirradiasi dengan dosis 150 dan 175 Gy umurnya paling panjang dan kondisinya paling sehat. Pada inokulasi ke dua (ulangan) Plasmodium berghei yang telah diiradiasi diharapkan dapat meningkatkan imunitas mencit. Plasmodium berghei yang diiradiasi dengan dosis 75 sampai 125Gy memberikan hasil yang sebaliknya, hal ini menunjukkan dosis yang diberikan belum cukup untuk melemahkan parasit. Pada inokulasi ke-2 Plasmodium berghei yang telah diiradiasi dengan dosis 150 dan 175 Gy terlihat memberikan hasil yang diharapkan hal ini menunjukan dosis iradiasi yang diberikan cukup untuk melemahkan parasit. Dosis radiasi 175 Gy merupakan dosis yang optimal untuk melemahkan Plasmodium berghei pada stadium eritrositik. Studi ini untuk mendukung pengembangan bahan dasar vaksin malaria. 5. DAFTAR PUSTAKA 1. WARDIARTO, Parasitologi Biologi Parasit Hewan, Gajah Mada University Press, Jogyakarta, (1989). 2. JEKTI, R.P., E.SULAKSONO, S. SUNDARI Y, Pengaruh Pasase Terhadap Gejala Klinis Pada Mencit Strain Swiss Derived yang Diinfeksi Plasmodium berghei ANKA, Cermin Dunia Kedokteran, 106, WIJAYANTI, M.A., N. SOERIPTO, SUPARGIYONO, dan L.E. FITRI, Pengaruh Imunisasi Mencit dengan Parasit Stadium Eritrositik Terhadap Infeksi Plasmodium berghei, Berkala Ilmu Kedokteran Vol 2, (1997), HOFFMAN, S.L., GOH, M.L., LUKE, T.C., Protection of Humans against Malaria by Immunization with Radiationattenuated Plasmodium falciparum Sporozoites. The Journal of Infectious Diseases 185, (2002), HARIJANTO P. N., Malaria, Epidemiologi, Patogenesis, Manifestasi Klinis dan Penanganan, EGC, Jakarta, (2000). 6. AIKAWA, M., GITIERREZ. Y., Malaria Pathology, Vector Studies and Culture, Academic Press, New York, (1980). 7. CELLUZI, C.M., et al., Immunology 85, (1995), DISKUSI Nanny. K.-PTNBR - BATAN: Apakah dosis iradiasi yang diperoleh (175 Gy) itu masih memberikan efek terhadap pembentukan antibodi anti malaria di dalam tubuh hewan uji? ini penting karena tujuan akhirnya untuk pembentukan vaksin? Darlina : Untuk menguji apakah dosis iradiasi yang diberikan pada P. berghei memberikan efek pembentukan antibodi harus dilakukan uji tantang dan uji imunoassays. Pada penelitian, kami belum melakukan uji imunoassays, maupun uji tantang. Kami akan melakukan pengujian efek pembentukan antibodi pada penelitian tahun ini. Yanti-PTKMR - BATAN : Pada grafik pengaruh dosis iradiasi P. berghei ada inokulasi ke-2. Pada hari ke berapa dilakukan inokulasi ke-2 dan apa tujuan inokulasi ke-2 tersebut? Darlina : Inokulasi ke-2 dilakukan pada hari ke-15 setelah inokulasi pertama. Tujuan dilakukan inokulasi ke-2 adalah untuk Booster yaitu, memacu respon imun. Selain itu juga untuk menguji apakah dosis radiasi yang diberikan cukup untuk melemahkan P. berghei sehingga dapat memberikan respon imun. Jika tidak, maka yang terjadi akumulasi infeksi P. berghei. 303