PENGARUH RADIASI GAMMA TERHADAP PROFIL PROTEIN Plasmodium berghei STADIUM ERITROSITIK

Transkripsi

1 PENGARUH RADIASI GAMMA TERHADAP PROFIL PROTEIN Plasmodium berghei STADIUM ERITROSITIK Devita Tetriana*, Darlina*, Armanu**, dan Mukh Syaifudin* ) *) Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi *)Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi ABSTRAK PENGARUH RADIASI GAMMA TERHADAP PROFIL PROTEIN Plasmodium berghei STADIUM ERITROSITIK. Malaria merupakan salah satu penyakit akibat infeksi parasit yang utama di dunia. Salah satu bagian sel yang berperan sebagai faktor virulensi adalah protein. Protein tersebut sekaligus dapat dijadikan sebagai kandidat vaksin malaria. Tujuan pada penelitian ini akan dipelajari kandungan dan profil protein P. berghei stadium eritrositik hasil iradiasi sinar gamma yang akan dimanfaatkan untuk pengembangan vaksin malaria dipelajari kandungan dan profil protein Plasmodium berghei stadium eritrositik pasca iradiasi gamma. Setelah kultur P. berghei diiradiasi dengan variasi dosis sinar gamma 150, 175, dan 200 Gy, dilakukan analisis terhadap kandungan protein dengan metode Lowry, dan profil protein dianalisis dengan SDS-PAGE dengan konsentrasi gel 10% dan berat molekul standar kda. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kandungan protein P. berghei semakin menurun sebanding dengan kenaikan dosis radiasi, dengan kadar teringgi pada kontrol yaitu 490 mg/ml dan terendah pada dosis radiasi 200 Gy yaitu 315 mg/ml. Dosis radiasi gamma 150 Gy menyebabkan perubahan profil protein yaitu hilangnya protein pada kisaran 15 kda. Pada dosis radiasi 175 dan 200 Gy tidak tampak adanya perbedaan profil protein sehingga perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis 2 dimensi untuk mengetahui pengaruh iradiasi gamma terhadap profil protein dengan berat molekul yang sama. Kata kunci : malaria, Plamodium berghei, radiasi gamma, protein ABSTRACT THE EFFECT OF GAMMA RAYS TO PROTEIN PROFILE OF ERYTHROCYTIC STAGE OF Plasmodium berghei. Malaria is the one of the most important parasite diseases in the world. One of cell components affecting its virulence factors is proteins. These proteins are also can be used as candidate of malaria vaccine. In this research the protein profile of irradiated Plasmodium berghei post irradiation with gamma ray was studied. After in vivo culture of P. berghei was irradiated with gamma rays at dose variations of 150, 175, and 200 Gy, protein concentrations of parasites were analyzed by Lowry method and their profiles were studied with SDS-PAGE at 10% gel concentration and the range of standard molecular weight was kda. The results showed that protein concentration was decreased by increasing of irradiation dose, the highest concentration is 315 mg/ml for 0 Gy and the lowest concentration is 215 mg/ml for 200 Gy. Irradiation with 150 Gy altered protein profiles where the 15 kda protein was not appeared but there was no different protein profiles found at higher dose (175 and 200 Gy). Keywords : malaria, Plamodium berghei, gamma irradiated, protein 282

2 PENDAHULUAN Malaria merupakan salah satu penyakit infeksi parasit yang utama di dunia. Setiap tahun juta kasus malaria menyebabkan 2 juta kematian 1. Penyebab malaria adalah parasit dari genus Plasmodium. Ciri utama genus ini adalah siklus hidup terjadi dalam dua inang yang berbeda. Siklus seksual terjadi dalam tubuh nyamuk Anopheles betina, yang bertindak sebagai vektor perantara penyebaran parasit. Siklus aseksual terjadi dalam tubuh manusia 2. Penyebaran penyakit malaria dapat dikendalikan dengan beberapa cara, yaitu mencegah kontaminasi dari lingkungan, memutuskan siklus hidup parasit, mengendalikan perkembangan vektor perantara dengan menggunakan insektisida, mencegah terjadinya infeksi, dan mencegah pematangan parasit melalui kemo-profilaksis dan vaksinasi 3. Masalah yang timbul saat ini adalah munculnya resistensi plasmodium terhadap obat malaria dan insektisida. Selain itu, pemanasan global turut berperan dalam meningkatnya kasus malaria. Di dunia, mulai terjadi peningkatan transmisi malaria pada daerah dataran tinggi atau pegunungan 4. Salah satu alternatif untuk pencegahan penyakit tersebut adalah dengan pembuatan vaksin malaria yang memanfaatkan teknik nuklir. Strategi ini sedang dikembangakan oleh WHO dalam program Roll Back Malaria 5,6. Teknik nuklir digunakan untuk melemahkan Plasmodium dengan menggunakan sinar gamma. Keuntungan penggunaan tenknik ini adalah memiliki efektifitas dalam peningkatan respon imun dibandingkan dengan teknik konvensional seperti pemanasan atau kimia 7. Salah satu cara pengendalian malaria yang mulai dikembangkan di dunia adalah vaksinasi. Empat macam tipe vaksin adalah (1) vaksin inaktif dari organisme patogen yang dimatikan, (2) vaksin aktif dari organisme yang dilemahkan, (3) vaksin dengan subunit protein hasil rekombinasi, dan (4) vaksin asam nukleat. Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh protozoa dan umumnya vaksin untuk protozoa adalah vaksin aktif dengan menggunakan radiasi sinar gamma untuk melemahkan organisme target 4. Sasaran dari vaksin malaria adalah tahap perkembangan plasmodium yang berbeda yaitu: pre-eritrosit, aseksual dan seksual 1,2,4. Vaksin pre-eritrosit ideal untuk penduduk di daerah non endemis atau pengunjung yang akan masuk ke daerah endemis karena vaksin ini dapat memberikan perlindungan hingga 90%. 283

3 Vaksin ini dihasilkan dengan melemahkan parasit stadium sporozoit menggunakan sinar gamma dosis Gy 8. Vaksin stadium eritrositik dibagi berdasarkan fungsinya yaitu sebagai anti-komplikasi dan anti-invasi. Vaksin stadium aseksual bertujuan untuk menghambat perkembangan merozoit dan mengurangi angka kesakitan pada daerah endemis. Sedangkan vaksin seksual bertujuan untuk mencegah atau mengurangi transmisi parasit ke inang baru (anti-invasi) 4. Plasmodium berghei adalah protozoa yang menyebabkan penyakit malaria pada rodensia. Penelitian berbagai aspek imunologis malaria banyak menggunakan P. berghei dan mencit sebagai hospesnya karena dengan model ini ada kemungkinan dilakukan manipulasi pada hospes sehingga dapat dipelajari perubahan imunologis yang terjadi selama infeksi malaria 9. Salah satu bagian sel yang berperan sebagai faktor virulensi adalah protein 10. Genom plasmodium penyebab malaria tersusun dalam 14 kromosomnya dan berada dalam inti sel dan sebagian lainnya terletak di mitokondria serta hanya sebagian kecil yang berada di apicoplast. Ukuran genom P. falciparum misalnya hampir mencapai 23 Mbp. Dari hasil pembacaan sekuen genom ini diketahui P. falciparum memiliki sekurangnya gen penyandi berbagai macam protein yang berfungsi dalam proses metabolisme, fungsi transport materi organik dari dan ke dalam sel, fungsi dasar kehidupan seperti replikasi-perbaikan-rekombinasi DNA yang disebut sebagai gen house-keeping, dan lain-lain 11. Parasit malaria juga memiliki jumlah gen yang mengkode enzim yakni protein yang berfungsi sebagai biokatalis dan protein transport yang jauh lebih sedikit jumlahnya dibandingkan dengan organisme bersel satu non-parasit 12. Bila sel terkena sinar gamma akan mengalami kerusakan secara langsung atau tidak langsung. Efek langsung adalah terjadinya pemutusan ikatan senyawa-senyawa penyusun sel. Efek tidak langsung terjadi karena materi sel terbanyak adalah air yang apabila terkena sinar gamma akan mengalami hidrolisis dan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas akan menyebabkan kerusakan materi sel 13. Perubahan intensitas (konsentrasi) protein dapat disebabkan oleh kerusakan yang diakibatkan oleh iradiasi sinar gamma, baik pada struktur maupun ikatan proteinnya. Perubahan struktur dapat diakibatkan oleh denaturasi maupun degradasi protein. Hal ini terjadi 284

4 karena adanya perubahan yang diakibatkan oleh iradiasi gamma, baik pada stuktur maupun ikatan proteinnya. Perubahan struktur dapat diakibatkan oleh denaturasi protein, degradasi protein, maupun perubahan DNA. Perubahan DNA dapat menyebabkan sintesis protein tertentu meningkat atau dihasilkannya protein baru. Tujuan pada penelitian ini akan dipelajari kandungan dan profil protein P. berghei stadium eritrositik hasil iradiasi sinar gamma yang akan dimanfaatkan untuk pengembangan vaksin malaria. BAHAN DAN METODE PENELITIAN A. Strain P. berghei. P. berghei strain ANKA yang diperoleh dari Laboratorium Malaria, Lembaga Biologi Molekuler Eijkman dibiakkan secara in vivo dalam tubuh mencit Swiss di Laboratorium Hewan Bidang Biomedika PTKMR-BATAN. B. Iradiasi Plasmodium berghei dengan Sinar Gamma. Kultur P. berghei stadium eritrositik ditempatkan di dalam microtube. Selanjutnya dilakukan iradiasi gamma dengan dosis 150, 175, dan 200 Gy di Iradiator IRPASENA PATIR-BATAN dengan laju dosis 360,9 Gy/jam. C. Pengukuran protein P. bergehei stadium eritrositik dengan Metode Lowry Setelah diiradiasi gamma kandungan protein dalam kultur diukur. Sampel dipecah terlebih dahulu dengan melarutkan kultur ke dalam aseton (1 : 1) dan disonifikasi selama 15 menit. Ke dalam 1 ml sampel ditambahkan 5 ml larutan Lowry I dan dibiarkan selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan Lowry II dan dibiarkan selama 30 menit. Dilakukan pembacaan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 700 nm. D. Karakterisasi Profil Protein Plasmodium berghei. Profil protein dianalisis dengan menggunakan metode elektroforesis satu dimensi SDS-PAGE dengan sistem buffer Laemmli dan konsentrasi gel poliakrilamid 10% (BioRad). Kultur iradiasi sebanyak 20 μl ditambahkan 10 μl aseton dan disonikasi selama 15 menit. Kemudian ditambahkan buffer sampel Laemli sebanyak 20 μl dan dipanaskan selama 15 menit dalam air mendidih. Setelah itu disentrifugasi pada 8000 rpm selama 5 menit. Sebanyak 5 μl filtrat sampel dan standar dimasukkan ke dalam kolom gel dan dielektroforesis pada kondisi 200 V dan 40 ma selama 90 menit. Gel diwarnai dengan commassie R-250 (BioRad) selama 1 285

5 jam lalu didestaining dengan destaining solution commassie R-250 (BioRad) selama 24 jam. Hasil yang diperoleh dianalisis untuk menentukan jumlah pita. HASIL DAN PEMBAHASAN Para peneliti telah mengidentifikasi sejumlah protein yang diproduksi oleh parasit yang bertanggung jawab terhadap keparahan penyakit (Gambar 1). Mereka berharap protein ini dapat dijadikan sebagai target pembuatan vaksin sehingga dapat menyelamatkan ribuan anak-anak penderita malaria. Temuan tersebut memfokuskan diri pada sejumlah protein yang ditemukan pada permukaan sel darah merah yang terinfeksi parasit. Protein tersebut diketahui membantu parasit malaria bertahan hidup dalam tubuh manusia dengan menghentikan pembuangan sel darah dalam limpa dan oleh karenanya memungkinkan parasit untuk melakukan reproduksi 13. Parasit malaria menghasilkan berbagai macam protein, bergantung pada apakah seseorang yang terinfeksi tersebut adalah berusia muda (anakanak) atau dewasa dengan respon kekebalan yang telah berkembang dengan baik. Pada saat tubuh manusia melawan parasit, tubuh mengembangkan respon imun terhadap parasit dengan memproduksi antobodi melawan protein malaria. Hal ini menurunkan sejumlah protein yang dihasilkan oleh parasit dan tetap hidup, dan akhirnya menyebabkan parasit memproduksi protein yang kurang berbahaya. Para ilmuwan berharap vaksin yang didasarkan pada protein yang hanya pada malaria anakanak dapat mempercepat proses ini akan tetapi mereka belum sepenuhnya berhasil mengidentifikasi protein yang terlibat. Salah satu yang ditemukan adalah PfEMP1 yang menyebabkan sel terinfeksi menjadi stuck dalam pembuluh darah atau dihilangkan dalam limpa. Sel darah terinfeksi terdegradasi yang menyebabkan demam 14. Dari penelitian ini diketahui bahwa iradiasi dengan dosis berbeda pada P. berghei stadium eritrositik menunjukkan adanya perubahan kadar protein total (Gambar 2). Kadar protein mengalami penurunan sebanding dengan peningkatan dosis iradiasi. Kadar protein pada dosis iradiasi 150 Gy adalah 435 mg/ml dan pada dosis iradiasi 200 Gy adalah 315 mg/ml. Hal ini diduga karena iradiasi menyebabkan terjadinya pemutusan rantai protein. Hasil statistik menunjukkan adanya pengaruh dosis iradiasi terhadap kandungan protein. 286

6 Pfs25 Pfs230 STARP SALSA SSP-2 CSP-1 Sporozoit Stadium hepatik Dalampembuluh darah (3-5 Dalamsel hati menit) (1-2 minggu) Pre-eritrositik Stadium seksual Stadium merozoit Dalamtubuh nyamuk (10 14 hari) Dalam sel darah merah (2 hari/siklus) LSA-1 EXP-1 LSA-3 AMA-1 RAP-1 SERA-1 MSP-2 MSP-3 EBA-175 Pfg27 Pfs27 Pfs45/48 Pfs16 Pfs28 MSP-1 MSP-5 Pf55 RAP-2 RESA GLURP EMP-1 MSP-4 Pf35 Gambar 1. Beberapa macam protein Plasmodium sp pada setiap stadium perkembangan 4. Protein (mg/ml) Dosis (Gy) Gambar 2. Kandungan protein P. berghei stadium eritrositik pasca iradiasi gamma Perubahan kadar protein diduga menyebabkan perubahan kadar antigen protein. Perubahan tersebut diketahui dengan mengamati profil protein setelah dilakukan elektroforesis. Profil protein dari darah yang terinfeksi P. berghei yang diiradiasi dan tidak diiradiasi memiliki jumlah pita sebanyak 13 buah dengan berat molekul berkisar antara kda. Darah yang tidak mengandung P. berghei hanya memiliki 10 pita. Pasca iradiasi dosis 150 Gy terlihat bahwa kultur mengalami kehilangan protein pada kisaran 15 kda. Hasil analisis 287

7 menunjukkan bahwa iradiasi dosis 150 Gy menyebabkan adanya perubahan profil protein, sedangkan dosis 175 dan 200 Gy tidak merubah profil (Gambar 3). Protein pada dosis 175 dan 200 Gy tidak menunjukkan adanya perbedaan jumlah pita tetapi tampak adanya perbedaan ketebalan pita yang menunjukkan adanya perbedaan protein pada p.i yang berbeda. Perbedaan p.i. ini akan tampak apabila profil protein dianalisis menggunakan 2 dimensi. A B C D E Std 200 kda 97.4kDa 66 kda 45 kda 31 kda 21.5 kda 14.4 kda Gambar 3. Profil protein kultur P. berghei hasil iradiasi sinar gamma. A: darah tanpa P. berghei; B: kultur P. berghei (0 Gy); C: kultur P. berghei (150 Gy); D: kultur P. berghei (175 Gy); E: kultur P. berghei (200 Gy) 288

8 Suatu materi hidup seperti sel, bila terkena sinar gamma akan mengalami kerusakan secara langsung atau tidak langsung. Efek langsung adalah terjadinya pemutusan ikatan senyawasenyawa penyusun sel. Efek tidak langsung terjadi karena materi sel terbanyak adalah air yang apabila terkena sinar gamma akan mengalami hidrolisis dan menghasilkan radikal bebas. Radikal bebas akan menyebabkan kerusakan materi sel 15. Perubahan intensitas (konsentrasi) protein dapat disebabkan oleh kerusakan yang diakibatkan oleh iradiasi sinar gamma, baik pada struktur maupun ikatan proteinnya. Perubahan struktur dapat diakibatkan oleh denaturasi maupun degradasi protein. Hal ini terjadi karena adanya perubahan yang diakibatkan oleh iradiasi gamma, baik pada stuktur maupun ikatan proteinnya. Perubahan struktur dapat diakibatkan oleh denaturasi protein, degradasi protein, maupun perubahan DNA. Perubahan DNA dapat menyebabkan sintesis protein tertentu meningkat atau dihasilkannya protein baru. Protein yang terdenaturasi mengalami dua kemungkinan, yaitu pengembangan rantai peptida dan pemecahan protein menjadi unit yang lebih kecil tanpa disertai pengembangan molekul. Terjadinya kedua jenis denaturasi ini tergantung pada keadaan molekul. Yang pertama terjadi pada rantai polipeptida, sedangkan yang kedua terjadi pada bagian-bagian molekul yang bergabung dalam ikatan sekunder. Denaturasi protein, dimungkinkan terjadi degradasi protein. Degradasi protein dapat menyebabkan protein tersebut kehilangan fungsinya sebagai protein dan degradasi struktur dapat berasal dari hilangnya gugus samping 16. Hasil-hasil di atas menunjukkan bahwa iradiasi gamma sebagai metode untuk melemahkan Plasmodium berpotensi besar dalam pembuatan vaksin. Keuntungan vaksin ini adalah memberikan imunitas humoral yang tinggi bila booster diberikan, tidak menyebabkan mutasi atau reversion, dapat digunakan untuk pasien immunodefisiensi, cocok digunakan untuk daerah tropis tetapi vaksin jenis ini membutuhkan biaya yang lebih tinggi karena membutuhkan booster 17. KESIMPULAN DAN SARAN Kandungan protein P. berghei akan semakin menurun seiring dengan kenaikan dosis iradiasi tetapi tidak merusak protein secara total sehingga protein ini dapat dijadikan sebagai salah 289

9 satu bahan antigen vaksin. Sinar gamma dengan dosis 150 Gy menyebabkan adanya perubahan profil protein yaitu dengan terjadinya kehilangan protein pada kisaran 15 kda. Profil protein pada dosis 175 dan 200 Gy tidak tampak adanya perbedaan jumlah pite tetapi terdapat perbedaan ketebalan pita yang menunjukkan adanya perbedaan protein pada p.i yang berbeda. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis 2 dimensi untuk mengetahui pengaruh iradiasi gamma terhadap profil protein dengan berat molekul yang sama. DAFTAR PUSTAKA 1. WORLD HEALTH ORGANIZATION, Initiative for Vaccine Research, State the art of vaccine research and development, 2005, 2. DEPARTEMEN KESEHATAN, Mengendalikan penyakit malaria dan mulai menurunnya jumlah kasus malaria dan penyakit lainnya pada GUNAWAN, S., Malaria: Epidemiologi, patogenesis dan manifestasi klinis, edited by Harijanto, Penerbit Buku Kedokteran EGC, pp ANONIMUS. Parasite control, Nature reviews/immunology. Nature publishing group GROTH, S., KHAN, B., ROBINSON, A., & HENDRICHS, J., Nuclear sciences figths malaria. Radiation and molecular techniques can play targeted roles, IAEA Bulletin 43/2/2001, pp (2001). 6. ABEKU, T.A., Response to malaria epidemics in Africa, Emerging Infectious Diseases Vol. 13, No.5, pp (2007) 7. WORLD HEALTH ORGANIZATION / ROLL BACK MALARIA. Malaria early warning systems concepts, indicators and partners. A framework for field research in Africa. Geneva : The organization HOFFMAN, S.L., GOH, M.L., LUKE, T.C., Protection of humans against malaria by immunization with radiation-attenuated Plasmodium falciparum. The Journal of Infectious Diseases, 185 : WIJAYANTI, M.A., SOERIPTO, N., SUPARGIYONO., FITRI, L.E., Pengaruh Imunisasi Mencit Dengan Parasit Stadium Eritrositik Terhadap Infeksi Plasmodium berghei. Berkala Ilmu Kedokteran. Vol 29, No. 2: GOFFAUX, Secretion of Virulence Factors by Escherichis coli. Laboratorie de Bacteriologie, Faculte de Medicine Veterinaire, Universite de Liege. Belgium THEISEN, M., SOE, S., BRUNSTEDT, K., FOLLMANN, F., BREDMOSE, L., ISRAELSEN, H., MADSEN, S.M., and DRUILHE, P., A Plasmodium falciparum GLURP MSP3 chimeric protein; expression in Lactococcus lactis, immunogenicity and induction of biologically active antibodies, Vaccine 22 (9-10), , BASTOS, M.S., DA SILVA- NUNES, M., MALAFRONTE, R.S., HELLENA, E., HOFFMANN, E., WUNDERLICH, G., MORAES, S.L., and FERREIRA, M.U., Antigenic polymorphism and naturally acquired antibodies to 290

10 Plasmodium vivax merozoite surface protein 1 in rural Amazonians. Clinical and Vaccine Immunology, : , SHI, Q., LYNCH M.M., ROMERO M.; and BURNS J.M., Enhanced protection against malaria by a chimeric merozoite surface protein vaccine, Infection and immunity, 75(3), , DARUSSALAM, M., Radiasi dan Radioisotop: Prinsip Penggunaannya dalam Biologi, Kedokteran dan Pertanian. Tarsito. Bandung WINARNO, H., Lipid A-Pusat Aktif Endotoksin, Struktur Kimia dan Bioaktivitasnya. Jurnal Cermin Dunia Kedokteran. 103: SYAIFUDIN, M., Indikator Biokimia Sel terhadap Radiasi Pengion. Buletin ALARA, Pusat Penelitian dan Pengembangan Keselamatan Radiasi dan Biomedika Nuklir. Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Vol. 4, GAFFAR, A., Parasitology: Blood and Tissue. University of South California, gy/blood-proto.htm. 291

11 292