PREPARASI 99m Tc-HYNIC-TOC YANG AKAN DIGUNAKAN UNTUK PENCITRAAN TUMOR

Transkripsi

1 Widyastuti, dkk. ISSN PREPARASI 99m Tc-HYNIC-TOC YANG AKAN DIGUNAKAN UNTUK PENCITRAAN TUMOR Widyastuti, Laksmi A., Anna Roseliana, Yunilda, Cecep Taufik, Evi Sovilawati P2RR - BATAN ABSTRAK PREPARASI 99m Tc-HYNIC-TOC YANG AKAN DIGUNAKAN UNTUK PENCITRAAN TUMOR. 99m Tc- HYNIC-TOC telah diketahui dapat digunakan untuk pencitraan berbagai jenis tumor neuroendokrin dan tuberkulosis paru-paru, hal ini akan sangat membantu dalam penanganan tumor dan tuberkulosis terutama sebagai salah satu modalitas diagnosis. Telah dilakukan penandaan HYNIC-TOC dengan 99m Tc menggunakan EDDA sebagai koligan dan pembuatan kit kering HYNIC-TOC. Identifikasi 99m Tc-HYNIC- TOC dilakukan dengan HPLC fasa balik dengan pembanding HYNIC-TOC, sedangkan efisiensi penandaan diuji dengan kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis dengan 3 macam eluen yaitu aseton, dapar fosfat salin (PBS) ph 7 dan campuran ammonium asetat-metanol (1:1). Uji biodistribusi untuk melihat farmakokinetika 99m Tc-HYNIC-TOC dilakukan pada mencit sehat. Stabilitas kit pada penyimpanan suhu 4 C diamati dengan menguji kemurnian radiokimia kit yang ditandai dengan 99m Tc setiap bulannya. Identifikasi dengan HPLC menunjukkan kesamaan waktu retensi HYNIC-TOC yang belum dan sudah ditandai yaitu pada menit, sedangkan kromatogram kertas dan lapis tipis menunjukkan kemurnian radiokimia diatas 80%. Biodistribusi pada mencit sehat menunjukkan akumulasi yang tinggi pada saluran kemih sedangkan pada organ-organ lain relatif rendah. Stabilitas kit kering HYNIC-TOC pada penyimpanan suhu 4 C hanya bertahan selama 1 bulan, pada bulan kedua hasil pengujian kemurnian radiokimia menunjukkan penurunan yang cukup berarti yaitu dibawah 80%. Kata kunci : HYNIC-TOC, 99m Tc, penandaan, biodistribusi, tumor ABSTRACT PREPARATION OF 99m Tc-HYNIC-TOC TO BE USED AS TUMOR IMAGING AGENT. 99m Tc-HYNIC- TOC has been widely used as tumor imaging agent specifically for neuroendokrin tumor and also for lung tuberculosis, so it can become an alternative of diagnosis modality for tumor and tuberculosis. Labeling HYNIC-TOC with 99m Tc has been carried out using EDDA as co-ligands as well as preparation of HYNIC- TOC dry kits. Identification of 99m Tc-HYNIC-TOC was carried out using reversed phase HPLC, the results was compared with unlabeled HYNIC-TOC, whereas radiochemical purity was measured by thin layer chromatography (TLC) and paper chromatography (PC) using 3 eluants, i.e. acetone, phosphate buffer saline ph 7 and mixture of ammonium acetate and methanol (1:1). Biodistribution test of 99m Tc-HYNIC- TOC was carried out on normal mice to see its pharmacokinetic behaviour. Kit stability on storage at 4 C was observed by measuring its labeling efficiency with 99m Tc every month. The results of HPLC measurement showed similar retention time between labeled and unlabeled HYNIC-TOC (at minutes), and it radiochemical purity resulted from TLC/PC analysis was more than 80%. Biodistribution on normal mice showed high accumulation in kidneys and bladder whereas in blood and other organs the accumulation was low. The dry kits of HYNIC-TOC stored at 4 C was remain stable up to 1 month, but in the second month of storage the radiochemical purity decreased significantly to less than 80%. Keywords : HYNIC-TOC, 99m Tc, labeling, biodistribution, tumor PENDAHULUAN H ingga saat ini angka kematian akibat penyakit keganasan termasuk tumor dan kanker masih tinggi, dan belum dapat diatasi dengan optimal. Sebelum dilakukan pengobatan perlu dilakukan diagnosis yang pasti, dan lebih baik apabila dapat diketahui lebih dini. Untuk itu diperlukan metoda diagnosis yang sensitif, spesifik dengan biaya yang terjangkau agar penyakit ini dapat diketahui sejak dini, sehingga pengobatannya akan lebih mudah. Dalam beberapa dekade terakhir telah dikembangkan penandaan monoclonal antibody (MoAb) untuk pencitraan tumor, tetapi masih ada

2 36 ISSN Widyastuti, dkk. beberapa kendala antara lain immunogenisitas dari murin MoAb, reaktivitas silang dengan antigen lain, hilangnya immunoreaktivitas setelah proses konjugasi dan rendahnya uptake oleh tumor target (T/NT ratio rendah) serta blood clearance rendah dikarenakan berat molekulnya tinggi. Dengan ditemukannya reseptor peptida dan dapat disintesisnya secara kimia peptida berukuran kecil yang aktif secara biologis, merupakan suatu pendekatan baru dalam pengembangan radiofarmaka. Dalam beberapa hal peptida lebih baik daripada MoAb karena afinitas terhadap reseptor lebih besar, immunogenisitasnya rendah dan blood clearance relatif cepat karena berat molekulnya kecil [1,2]. Dalam banyak kasus penyakit kanker ditemukan sejumlah reseptor somatostatin yang dikelompokkan ke dalam 5 subtipe, sehingga memungkinkan bisa digunakan sebagai target untuk pencitraan tumor neuroendokrin. Salah satu analog somatostatin yang dilabel dengan radionuklida ialah octreotide, yang hanya dapat berikatan dengan reseptor subtipe 2, 3 dan 5 dan ditemukan antara lain pada kasus neuroblastoma dan tumor endokrin gastrointestinal [1]. Sediaan radiofarmaka berbasis peptida analog somatostatin kini sudah banyak digunakan antara lain ialah 111 In-DTPA-Octreotide dan 99m Tc- Hydra-zinonicotinamide-Tyr 3 -Octreotide ( 99m Tc- HYNIC-TOC). Peptida bertanda 99m Tc lebih menguntungkan dibandingkan peptida bertanda 111 In karena lebih murah, lebih mudah pengadaannya karena tersedia dalam bentuk generator 99 Mo/ 99m Tc dan sudah digunakan secara rutin di Rumah Sakit serta mem-punyai sifat peluruhan fisis yang lebih menguntung-kan [1,3]. Metoda penandaan peptida pada umumnya menggunakan metoda tidak langsung (menggunakan ligan penghubung yang berfungsi juga sebagai bifunctional chelator) dimana tidak ada proses pemutusan ikatan disulfida, karena pemutusan ikatan disulfida pada peptida yang berukuran relatif kecil dapat merusak keutuhan sifat biologinya. [2] Pembentukan 99m Tc-HYNIC-TOC memerlukan senyawa ligan lain untuk menstabilkan konfigurasi molekul kompleks tersebut yang disebut koligan, diantaranya yang dapat digunakan adalah trisin, EDDA (ethylenediaminediacetic acid), asam nikotinat dan sebagainya. Apabila digunakan trisin sebagai koligan efisiensi penandaan yang dihasilkan sangat tinggi (>98%), sedangkan apabila digunakan EDDA efisiensi yang dihasilkan relatif rendah (<60%). Sebaliknya bila digunakan trisin ikatan 99m Tc-HYNIC-TOC dengan protein plasma relatif tinggi hingga mencapai 30%, sedangkan bila digunakan EDDA ikatan dengan protein plasma hanya <10%. Oleh sebab itu pada pelabelan 99m Tc- HYNIC-TOC digunakan campuran trisin dan EDDA, yang mana trisin diperlukan untuk membentuk struktur kompleks 99mTc-HYNIC-TOC dengan efisiensi penandaan yang tinggi, dan melalui proses pemanasan trisin akan disubstitusi oleh EDDA, sehingga struktur akhir berbentuk 99m Tc-HYNIC-TOC-EDDA yang memberikan kestabilan in-vitro maupun in-vivo yang tinggi. [4] BAHAN DAN TATA KERJA Bahan dan Peralatan Bahan yang digunakan ialah Hidrazinonikotinamid-Tirosin 3 -octreotide yang disingkat HYNIC-TOC (Polatom, Polandia), ethylenediamine-diacetic acid (EDDA, Sigma), Trisin (Sigma), manitol (Merck), timah klorida dihidrat (Aldrich), Generator 99m Tc (BATEK), bahan-bahan kimia standar (Merck) misalnya asetonitril, asam tri-fluoroasetat, asam hidroklorida, natrium hidroksida, dan sebagainya, air bidestilata steril dan larutan NaCl 0.9% (IPHA), serta gas nitrogen (High Purity, medical grade). Alat alat yang digunakan ialah peralatan gelas, misalnya vial 2 cc, 5 cc dan 10 cc, tabung mikro, tabung reaksi, dan lain lain, pipet eppendorf berbagai ukuran, syringe berbagai ukuran, timbangan, ph-meter, kertas indikator ph, peralatan HPLC (Shimadzu) dengan kolom C18, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis, alat pencacah gamma (GIC & mini assay), dan lain lain. Tata Kerja Penandaan Tc99m-HYNIC-TOC (kit HYNIC- TOC Cara Basah) Kedalam vial dimasukkan 0.5 ml larutan EDDA dalam NaOH 0.1 N (20 mg/ml), 0.5 ml larutan trisin dalam dapar fosfat 0.2N ph 6 (40 mg/ml), 40 l larutan HYNIC-TOC dalam etanol 10% (0.5 mg/ml), 25 l larutan SnCl 2.2H 2 O dalam HCl 0.1N bebas oksigen (1 mg/ml) dan 5-10 mci larutan perteknetat Tc 99m yang fresh. Larutan reaksi dipanaskan dalam penangas air mendidih selama 10 menit. Karakterisasi danaanalisis Kemurnian Radiokimia

3 Widyastuti, dkk. ISSN Karakterisasi HYNIC-TOC yang belum maupun yang sudah ditandai dengan 99m Tc dilakukan menggunakan HPLC fasa balik (Reversed Phase HPLC) dengan eluen asetonitril dan air yang mengandung 0.1% asam trifluoroasetat dan dielusi secara gradien dengan pengaturan 0-3 menit 0% asetonitril, 3-13 menit 0-40% asetonitril, menit 40% asetonitril, menit 40-70% ase-tonitril, dan menit % asetonitril. Kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas dengan eluen aseton untuk menentukan % perteknetat 99m Tc bebas (Rf 1) dan kromatografi lapis tipis dengan eluen campuran ammonium asetat 0.25M ph 5.2 dengan metanol (1:1) untuk menen-tukan % 99m Tc koloid (Rf 0), serta kromatografi lapis tipis dengan eluen dapar fosfat-salin (PBS) ph 7 untuk menentukan % 99m Tc-koligan yang bercampur dengan perteknetat 99m Tc bebas (Rf 0.8). Dengan mengetahui % spesi 99m Tc yang merupakan pengotor, maka % 99m Tc-HYNIC-TOC dapat dihitung. Uji Stabilitas Kit Kering HYNIC-TOC Kit kering HYNIC-TOC dibuat dalam 2 kemasan vial, vial yang satu (vial A) berisi 20 g HYNIC-TOC, 20 mg trisin, 10 mg EDDA dan 25 g SnCl 2.2H 2 O, sedangkan vial yang lain (vial B) berisi larutan dapar fosfat 0.2 N ph 6. Kit A dibuat dengan cara yang sama dengan kit HYNIC-TOC cara basah tetapi tanpa penambahan larutan perteknetat 99m Tc. Stabilitas kit diuji dengan menganalisis kemurnian radiokimia hasil penandaan kit setiap bulan setelah kit kering HYNIC-TOC disimpan selama beberapa bulan di dalam lemari pendingin (suhu 4 C). Uji Biodistribusi Uji biodistribusi dilakukan dengan menyuntikkan 0.2 ml ( Ci) 99m Tc HYNIC-TOC pada mencit yang sehat. Setelah 1 jam hewan dikorbankan dan organ organ termasuk sampel darah dan tulang dicacah radioaktifitasnya. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengujian dengan HPLC untuk HYNIC-TOC yang belum ditandai memberikan waktu retensi pada 18 menit, sedangkan 99m Tc HYNIC-TOC memberikan waktu retensi pada 19 menit (pengukuran dilakukan menggunakan detektor radioaktif eksternal sehingga ada selisih waktu /keterlambatan antara deteksi menggunakan detektor UV dengan detektor radioaktif tersebut) dengan jumlah cacahan maksimum (Gambar 1 dan 2). Gambar 1. Kromatogram HPLC HYNIC-TOC yang belum ditandai.

4 38 ISSN Widyastuti, dkk. Gambar 2. Kromatogram HPLC 99m Tc HYNIC-TOC (berdasarkan hasil cacahan eluat HPLC). Hasil pengujian dengan KLT/ kromatografi suhu 4 C yaitu menjadi 71.8%, sehingga kertas untuk 99m Tc-HYNIC-TOC yang ditandai pengamatan hanya dilakukan hingga bulan ke-4 dengan metoda basah dan metoda kering berturutturut ialah 81.9 % dan 82.4 % (Tabel 1). Jumlah 65.5% (Tabel 1). dengan penurunan kemurnian radiokimia sebesar perteknetat (Tc bebas) yang masih cukup tinggi (lebih dari 5%) pada penandaan kit kering HYNIC- TOC sesaat setelah pembuatan menunjukkan jumlah reduktor (Sn +2 ) masih kurang, yang mungkin disebabkan oleh teroksidasinya Sn +2 menjadi Sn +4 selama proses pembuatan kit. Untuk mengatasi hal itu perlu diperhatikan teknik pembuatan kit terutama pada proses pengaliran gas nitrogen sehingga oksigen dari atmosfer dapat diusir sehingga kemungkinan teroksidasinya reduktor yang digunakan. dapat diminimalkan. Uji stabilitas kit kering HYNIC-TOC menun-jukkan penurunan % kemurnian radiokimia yang berarti setelah 2 bulan penyimpanan pada Hasil uji biodistribusi untuk 99m Tc-HYNIC- TOC menunjukkan radioaktivitas yang tinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan relatif rendah pada organ organ lain (Gambar 3). Tingginya perbandingan % radioaktivitas pada sistim ekskresi (ginjal dan kandung kemih) terhadap organ organ lain menunjukkan sifat farmakokinetika yang diharapkan dari sediaan penatah tumor atau infeksi, sehingga apabila terdapat tumor atau infeksi di dalam tubuh diharapkan akan diperoleh gambaran gamma kamera yang cukup jelas. Biodistribusi pada mencit yang diinduksi tumor tidak dapat dilakukan karena fasilitas yang diperlukan tidak tersedia. Waktu penyimpanan % TcO 4 - Tabel 1. Pengujian stabilitas kit HYNIC-TOC. Analisis kemurnian radiokimia dengan kromatografi kertas dan lapis tipis % TcO 2 %Tc-coligand %Tc-HYNIC-TOC 1 minggu bulan bulan bulan

5 Widyastuti, dkk. ISSN Gambar 3. Hasil uji biodistribusi 99m Tc-HYNIC-TOC pada mencit sehat. KESIMPULAN Pelabelan HYNIC-TOC dengan 99m Tc menggunakan koligan trisin dan EDDA demikian juga pembuatan kit HYNIC-TOC telah berhasil dilakukan walaupun hasilnya belum optimal dan masih dapat ditingkatkan. Stabilitas kit kering HYNIC-TOC hanya bertahan hingga satu bulan setelah disimpan pada suhu 4 C, hal ini sangat tidak efisien, sehingga perlu dicari formula atau kondisi pembuatan yang lebih baik yang dapat memberikan stabilitas kit yang lebih tinggi. Pengujian pada hewan percobaan yang sehat menunjukkan sifat farmakokinetika 99m Tc-HYNIC- TOC sesuai dengan yang diharapkan untuk sediaan radiofarmaka penatah tumor, tetapi pengujian pada hewan yang mengidap tumor tidak dapat dilakukan karena fasilitas laboratorium untuk menginduksi tumor pada hewan percobaan tidak tersedia di P2RR. DAFTAR PUSTAKA 1. D. BLOK, R.I.J. FEITSMA, P. VERMEIJ, et.al., Peptide Radiopharmaceuticals in Nuclear Medicine, Review article, Eur J Nucl Med (1999) Vol. 26, No. 11, pp SHUANG LIU, D. SCOTT EDWARDS, and JOHN A. BARRETT, 99m Tc Labeling of Highly Potent Small Peptides, Bioconjugate Chem. (1997), Vol. 8, No. 5, pp C.DECRISTOFORO, S.J. MATHER, Technetium-99m Somatostatin Analogues: Effect of Labeling Methods and Peptide Sequence, Eur J Nucl Med (1999) Vol.26, No. 8, pp C. DECRISTOFORO, L. M. ALAFORT, J. K. SOSABOWSKI, et.al, 99m Tc-HYNIC-[Tyr3]- Octreotide For Imaging Somatostatin-Receptor- Positive Tumors: Preclinical Evaluation and Comparison with 111In-Octreotide, J Nucl Med (2000) Vol. 41, No. 6, pp TANYA JAWAB Aslina Ginting Kenapa didalam abstrak dan isi tidak digambarkan hasil pencitraan tumor. Bagaimana mekanisme pencitraan tumor dengan menggunakan 99 TCHynic-TOC ini? Widyastuti Penelitian ini merupakan tahap awal dari pengembangan sediaan radiofarmaka berbasis peptide 99m TC-Hynic-TOC, dimana hasil penelitian ini baru sampai pada tahap preparasi sediaan dan biodistribusi pada hewan sehat, sedangkan uji klinis pada pasien penderita tumor neuroendokrin atau uji pencitraan tumor akan dilakukan pada tahap penelitian selanjutnya.

6 40 ISSN Widyastuti, dkk. Mekanisme pencitraan tumor berdasarkan pada ikatan antara TOC (analog somatostatin) dengan reseptor somatostatin sub tipe 2 dan 5 yang banyak ditemukan pada permukaan sel tumor. Terakumulasinya 99m TC-Hynic-TOC pada jaringan tumor memungkinkan pencitraan tumor dengan alat -kamera. Tunjung TOC secara umum (yang kami ketahui) adalah jaringan tumor dalam tubuh. Apa kegunaan Hynic disini mengingat dalam tata kerja harus disiapkan kit kering. Bagaimana penandaan tumor langsung menggunakan Tc tanpa kit kering Hynic-TOC. Widyastuti Hynic adalah suati ligand yang dapat mengikat Tc 99m sekaligus dapat berikatan dengan TOC (suatu peptida), jadi berfungsi sebagai penghubung. Tc 99m apabila dimasukkan langsung kedalam tubuh, akan terakumulasi pada organ-organ lain (misal tiroid, lambung, otot) yang dapat mengganggu pencitraan tumor. Filian Arbiyani Apa Tc 99m -Hynic-TOC? Bagaimana kalau yang terkena tumor kandung kemih atau ginjal? Mengapa waktu yang diberikan hanya satu jam? Widyastuti 99m Tc-Hynic-TOC adalah singkatan dari 99m Tc- HydrazinoNicotinamide-Tyrosine Octreotide, yaitu sediaan radiofarmaka berbasis peptida yang ditandai dengan Tc 99m, yang digunakan untuk pencitraan tumor neuroendokrin. Sulit untuk dideteksi apabila tumornya terdapat pada kandung kemih dan ginjal, jadi harus digunakan cara lain. Waktu 1 jam adalah umum untuk mengetahui distribusi sediaan radiofarmaka dalam tubuh.