PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99m Tc PEPTIDA MENGGUNAKAN DUA JENIS SENYAWA HYNIC SEBAGAI LIGAND PENGHUBUNG

Transkripsi

1 116 ISSN Widyastut, dkk. PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99m Tc PEPTIDA MENGGUNAKAN DUA JENIS SENYAWA HYNIC SEBAGAI LIGAND PENGHUBUNG Widyastuti, Sri Aguswarini, Cecep Taufik, Anna Roseliana, Agus Ariyanto, Abdul Mutalib Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka BATAN ABSTRAK PERBANDINGAN METODA PENANDAAN 99m Tc-PEPTIDA MENGGUNAKAN DUA JENIS SENYAWA HYNIC SEBAGAI LIGAND PENGHUBUNG. Telah dilakukan penelitian terhadap 2 jenis senyawa HYNIC sebagai ligand penghubung pada penandaan 2 macam senyawa peptida yaitu BPTI dan TOC dengan 99m Tc. Penandaan peptida tersebut dengan 99m Tc dilakukan dengan menggunakan 2 macam metoda konjugasi, dimana untuk BPTI digunakan NHS-HYNIC sedangkan untuk TOC digunakan BOC- HYNIC, kemudian akan dibandingkan efisiensi penandaan kedua hasil konjugasi ini serta stabilitas peptida bertandanya. Hasil konjugasi diidentifikasi dengan HPLC fasa balik dan kemurnian radiokimia dianalisa dengan HPLC dan kromatografi lapis tipis/ kromatografi kertas. Uji biodistribusi dilakukan pada tikus normal untuk melihat sifat farmakokinetika peptida bertanda tersebut. Dilakukan juga uji stabilitas in vitro menggunakan cystein challenge sebagai simulasi stabilitas di dalam tubuh. Hasil pengujian dengan HPLC menunjukkan polaritas yang mirip antara kedua peptida yang belum dan yang sudah ditandai dengan 99mTc. Kemurnian radiokimia 99m 99m Tc-HYNIC-BPTI dan Tc-HYNIC-TOC yang dianalisis dengan kromatografi kertas/lapis tipis berturut-turut adalah % dan %. Hasil uji biodistribusi menunjukkan akumulasi tertinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan cacahan pada organ dan jaringan lainnya relatif rendah. Hasil uji stabilitas dalam cystein (cystein challenge) setelah satu jam inkubasi untuk kedua sediaan tersebut tidak menunjukkan penurunan kemurnian radiokimia yang berarti. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penggunaan NHS-HYNIC maupun BOC-HYNIC demikian juga perbedaan metoda 99m konjugasi tidak memberikan perbedaan yang berarti pada efisiensi penandaan Tc-peptida, tetapi metoda konjugasi menggunakan BOC-HYNIC memerlukan waktu pengerjaan yang lama serta jenis reagen yang lebih banyak. Kedua sediaan peptida tersebut mempunyai sifat farmakokinetika yang memenuhi syarat untuk digunakan sebagai perunut. Kata kunci : Peptida, 99mTc, ligan, penandaan ABSTRACT COMPARISON OF 99m Tc-PEPTIDE LABELING METHOD USING TWO KINDS OF HYNIC LIGAND AS LINKER. Experiment using 2 kinds of HYNIC in 99m Tc labeling on 2 kinds of peptides.i.e BPTI and TOC has been carried out. Labeling of these peptides with 99mTc were carried out using different conjugation methods and different kinds of HYNIC, for this purpose NHS-HYNIC was used for BPTI while BOC-HYNIC was used for TOC, and then their labelling efficiency and stability were compared. Labeling efficiency was analysed using RP-HPLC and paper chromatography and thin layer chromatography (TLC), and biodistribution study to examine their pharmacokinetic behavior was done 1 hour after injection on normal mice. HPLC results showed that all radiolabeled peptides have similar polarity as their unlabeled conjugates, and chromatography result (from both paper and TLC) showed that the labeling efficiency of 99m Tc HYNIC-BPTI and 99m Tc-HYNIC-TOC were 87.33% and 85.88% respectively. The cystein challenge 99m test for Tc-HYNIC-BPTI and 99m Tc-HYNIC-TOC after 1 hour did not give significant difference. Biodistribution study showed that all labeled peptides were accumulated mainly in kidney and bladder. Both NHS-HYNIC and BOC-HYNIC, as well as the different conjugation methods do not give significant difference in labeling efficiency of 99m Tc-peptides, but conjugation method using BOC-HYNIC is more time consuming and need more various reagents. It can be concluded that these peptide based radiopharmaceuticals have a good prospects to be used as imaging agents. Keywords: Peptide, 99mTc, ligand, labeling PENDAHULUAN P eptida berukuran kecil yang dilabel dengan Tc- 99m atau radioisotop pemancar γ lainnya telah diketahui mempunyai potensi sebagai perunut tumor dan beberapa penyakit lainnya dalam kedokteran nuklir. Peptida merupakan salah satu senyawa yang diandalkan dalam penelitian radiofarmaka dewasa ini, disebabkan oleh beberapa faktor antara lain mudah diperoleh dari hasil

2 117 ISSN Widyastut, dkk. sintesa, afinitas yang tinggi terhadap reseptor pada jaringan sasaran dan ukuran molekulnya kecil sehingga mudah diekskresi dari sistim peredaran darah (2,3). Ketersediaan Tc-99m di rumah-sakit rumahsakit dalam bentuk generator Tc-99m membuat para ilmuwan tertarik untuk dapat menandai peptida dengan Tc-99m, tetapi hasil yang diperoleh masih belum memuaskan. Hal ini disebabkan oleh tingginya aktivitas farmakologi dari beberapa jenis peptida yang digunakan. Oleh karena itu jumlah peptida yang digunakan harus sekecil mungkin, sehingga diperlukan efisiensi yang tinggi pada proses penandaan dan stabilitas kompleks yang tinggi pula. Untuk itu diperlukan suatu senyawa pengkhelat yang dapat mengikat Tc-99m sekaligus mengikat peptida yang disebut bifunctional chelator (BFC), dan salah satu senyawa BFC yang memenuhi syarat untuk itu ialah Hydrazino Nicotinamid (HYNIC) (1). Penandaan peptida dengan Tc-99m menggunakan HYNIC sebagai BFC berbeda dengan pengkhelat lainnya, karena disini Tc-99m berikatan dengan gugus hydrazino membentuk ikatan Tc-N yang kurang stabil, sehingga diperlukan suatu co-ligand untuk menstabilkan molekul tersebut, dimana salah satunya adalah trisin. Dalam penelitian ini akan dikaji hasil penandaan 2 macam peptida dengan Tc-99m menggunakan HYNIC sebagai BFC dan trisin sebagai co-ligand melalui serangkaian pengujian antara lain kemurnian radiokimia, stabilitas in vitro dan biodistribusi (untuk melihat sifat farmakokinetikanya). Peptida yang akan digunakan dalam penelitian ini ialah Tyr 3 -octreotide (TOC) dan BPTI. TOC merupakan analog somatostatin yang telah diketahui mempunyai afinitas yang tinggi pada tumor, sedangkan BPTI merupakan peptida yang mirip (ukuran maupun sifat farmakokinetika) dengan HNE-2, dimana HNE-2 telah dibuktikan pada beberapa publikasi internasional mempunyai sifat dapat terlokalisasi secara spesifik pada jaringan yang mengalami inflamasi/infeksi. Pada penelitian ini BPTI digunakan sebagai model pengganti HNE-2, karena BPTI tersedia di pasaran. BAHAN DAN TATA KERJA Bahan dan Peralatan Bahan yang digunakan ialah NHS-HYNIC (Polatom, Poland), BPTI (Aprotinin, Sigma A1153), Tricine (Sigma), buffer NH4-asetat 0.25 M ph 5.2, buffer fosfat-salin (PBS) 0.5 M ph 7.2, N,N-Dimetil formamida anhidrat (DMF, Aldrich), SnCl2.2H2O (Merck), Generator Tc-99m (BATEK), BOC-HYNIC (P2RR), BOC-TOC, O- (7-azabenzotriazolil)-1,1,3,3-tetrametiluronium heksaflorofosfat (HATU, Aldrich), N,N- Diisopropiletilamin (Aldrich), Tioanisol (Aldrich), asetonitril (Merck), Asam trifluoroasetat (Merck), air demin, air bidestilata steril (IPHA), larutan HCl 0.01 N, larutan NaOH 1 N, gas nitrogen, dan lain lain. Alat alat yang digunakan ialah peralatan gelas, misalnya vial 2 cc, 5 cc dan 10 cc, tabung mikro, tabung reaksi, dan lain lain, pipet eppendorf berbagai ukuran, syringe berbagai ukuran, kolom Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia), kolom Seppak C-18 (Waters), timbangan, ph-meter, kertas indikator ph, spektrofotometer UV dengan mikro kuvet, HPLC (Shimadzu) dengan kolom C18, peralatan kromatografi kertas/lapis tipis, alat pencacah gamma (GIC & mini assay), dan lain lain. Tata Kerja a. Konjugasi HYNIC-BPTI mg larutan BPTI dicampurkan dengan larutan NHS-HYNIC (dalam DMF bebas air), jumlah molar NHS-HYNIC 3 atau 5 kali molar BPTI, dan volume DMF tidak lebih dari 10 % volume total campuran reaksi. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu ruangan selama menit, kemudian dimurnikan melalui kolom Sephadex G-25 (PD-10) dengan eluen buffer NH 4 -asetat 0.25 M ph 5.2. Kadar konjugat ditentukan dengan spektrofotometer UV pada 280 nm, dan konjugat dapat disimpan pada -20 C bila tidak akan langsung digunakan. HYNIC-TOC 1.3 mg BOC-HYNIC, 2 mg HATU dan 5 mg diisopropiletiamin (DEA) dalam 300 µl DMF kering direaksikan selama 30 menit pada suhu ruangan. 60 µl dari larutan ini direaksikan dengan 1 mg BOC-TOC (yang telah dilarutkan dalam 20 µl DMF + 5 µl air) dan diinkubasi selama 1 jam. Perbandingan molar BOC-HYNIC dan HATU terhadap BOC-TOC kurang lebih 1.5 : 1. Larutan reaksi ditambah 5 ml air untuk menghentikan reaksi, kemudian dilewatkan ke dalam kolom SEPPAK C18 yang telah dikondisikan, dibilas dengan 5 ml air dan dielusi dengan 1 ml asetonitril.

3 Widyastut, dkk. ISSN Larutan reaksi diuapkan dalam vakum hingga volume 100 µl, kemudian ditambahkan 10 µl tioanisol dan 300 µl TFA dan diinkubasi selama 5 menit untuk menghilangkan gugus BOC (deproteksi) kemudian diuapkan hingga kering, dan dilarutkan dalam 100 µl etanol 50 %. Konjugat HYNIC-TOC dianalisa dengan HPLC fasa balik dengan eluen 0.1 % TFA/air dan asetonitril secara gradien. Konjugat disimpan pada -20 C bila tidak akan langsung ditandai. b. Penandaan Tc99m-HYNIC-peptida µg konjugat direaksikan dengan larutan trisin (100 mg/ml dalam air), 1-5 mci Tc99m dan 5-25 µl larutan SnCl2.2H2O (1 mg/1ml dalam HCl 0.01N bebas oksigen), dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar. c. Analisa Konjugat bertanda diidentifikasi dengan HPLC (dengan metoda yang sama dengan identifikasi konjugat tidak bertanda) dan tiap menit eluat ditampung dalam tabung reaksi dan diukur radioaktifitasnya. Kemurnian radiokimia diuji dengan kromatografi kertas dengan eluen aseton untuk menentukan % Tc99m bebas dan kromatografi lapis tipis dengan eluen campuran ammonium asetatmetanol (1:1) untuk menentukan % Tc99m koloid. d. Uji stabilitas dalam cystein 100 µl larutan peptida bertanda direaksikan dengan larutan 0.1 M cystein (dalam PBS ph 7.2), perbandingan molar peptida terhadap cystein dibuat 1 : 1000, diinkubasi pada suhu 37 C selama 0 jam, 1 jam dan 24 jam, kemudian dianalisa dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan eluen metil etil keton (MEK) untuk menentukan % Tc bebas (Rf=1), dan eluen PBS ph 7.2 untuk menentukan % Tc-peptida (Rf=0). Sebagai kontrol dilakukan pengerjaan yang sama tetapi tanpa menambahkan cystein. e. Uji biodistribusi Uji biodistribusi dilakukan dengan menyuntikkan 0.2 ml ( µci) peptida bertanda pada mencit. Setelah 1 jam hewan dikorbankan dan organ organ termasuk sampel darah dan tulang dicacah radioaktifitasnya. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengujian dengan HPLC untuk kedua peptida memberikan waktu retensi yang sama yaitu menit, sedangkan masing masing konjugatnya memberikan waktu retensi pada 17 menit, baik untuk konjugat bertanda maupun tidak bertanda. Hasil pengujian dengan KLT/ kromatografi kertas untuk Tc99m-HYNIC-TOC dan Tc99m- HYNIC-BPTI berturut-turut ialah % dan %. Hasil pengujian dengan cystein (cystein challenge) setelah 1 jam untuk kedua jenis peptida bertanda tidak menunjukkan penurunan % yang berarti, hal ini menunjukkan kedua senyawa ini akan stabil di dalam tubuh setelah 1 jam. Pengamatan lebih dari 1 jam belum sempat dilakukan. Hasil uji biodistribusi untuk kedua peptida bertanda menunjukkan radioaktifitas yang tinggi pada ginjal dan kandung kemih, dan relatif rendah pada organ organ lain, sedangkan adanya radioaktifitas pada lambung menunjukkan % Tc99m bebas yang masih cukup tinggi. Tingginya perbandingan % radioaktifitas pada sistim ekskresi (ginjal dan kandung kemih) terhadap organ organ lain menunjukkan sifat farmakokinetika yang diharapkan dari sediaan penatah tumor atau infeksi, sehingga apabila terdapat tumor atau infeksi di dalam tubuh diharapkan akan diperoleh gambaran gamma kamera yang cukup jelas. Peptida bertanda DATA HASIL PENGAMATAN Tabel 1.Data kemurnian radiokimia % Tc bebas MEK, Rf=1 % Tc koloid NH4Ac/MeOH Rf=0 % Tc-Hynic-peptida perhitungan Tc99m-HYNIC-TOC Tc99m-HYNIC-BPTI

4 119 ISSN Widyastut, dkk. Tabel 2. Uji Stabilitas dalam cystein Waktu pengamatan (jam) % Tc-HYNIC-TOC % Tc-HYNIC-BPTI Gambar 1. Uji biodistribusi 99m Tc-HYNIC-BPTI dan 99m Tc-HYNIC-TOC Gambar 2. Kromatogram HPLC 99m Tc-HYNIC-BPTI KESIMPULAN DAN SARAN Gambar 3. Kromatogram HPLC Tc99m-HYNIC-TOC

5 Widyastut, dkk. ISSN Hasil pengujian yang telah dilakukan terhadap kedua jenis HYNIC-peptida baik yang menggunakan NHS-HYNIC maupun BOC-HYNIC memberikan hasil yang tidak jauh berbeda tetapi metoda yang menggunakan BOC-HYNIC memerlukan waktu pengerjaan yang lebih lama dan rumit serta memerlukan lebih banyak jenis reagen. Sejauh ini stabilitas in vitro untuk kedua sediaan peptida bertanda tidak menunjukkan perbedaan yang berarti, tetapi masih perlu dilakukan pengamatan pada interval waktu yang lebih panjang untuk memperkuat kesimpulan ini. Dan untuk membuktikan lebih jauh keunggulan metoda yang satu terhadap metoda yang lainnya perlu dilakukan juga uji stabilitas masing masing konjugat terhadap waktu penyimpanan. Uji biodistribusi pada hewan normal yang telah dilakukan hanya untuk mengetahui farmakokinetika dari kedua sediaan peptida bertanda, dan dapat disimpulkan bahwa kedua jenis sediaan ini dapat digunakan untuk penatah kelainan organ (kecuali kelainan ginjal dan kandung kemih). Untuk membuktikan bahwa sediaan ini dapat digunakan untuk menatah tumor perlu dibuktikan lebih lanjut melalui uji biodistribusi pada hewan yang menderita tumor. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa HYNIC dapat digunakan sebagai ligand penghubung ( linker ) antara Tc99m dan peptida, dan dapat dipilih peptida lain yang sesuai dengan tujuan pemakaian, misalnya HNE2 untuk penatah inflamasi atau ubiquicidin (UBI1) untuk penatah infeksi. DAFTAR PUSTAKA 1. I. VIRGOLINI, T. TRAUB, C. NOVOTNY, et al, New trends in peptide receptor radioligands, Q.J.Nucl.Med 2001; 45: T.M. BEHR, M. GOTTHARDT, A. BARTH, et al, Imaging tumors with peptide-based radioligands, QJ Nucl Med 2001;45: CLEMENS DECRISTOFORO and STEPHEN J. MATHER, Preparation, 99mTc-Labeling, and in vitro Characterization of HYNIC and N3S Modified RC-160 and [Tyr3]Octreotide, Bioconjugate Chem., Vol. 10, No. 3, ERNEST K.J. PAUWELS, V. RALPH MCCREADY, JAN H.M.B. STOOT, et al, The mechanism of accumulation of tumourlocalising radiopharmaceuticals, Eur J Nucl Med (1998) 25: CLEMENS DECRISTOFORO, STEPHEN J. MATHER, Technetium-99m somatostatin analogues: effect of _abelling methods and peptide sequence, Eur J Nucl Med (1999) 26: MARY RUSCKOWSKI, TONG QU, JAMES PULLMAN, et al, Inflammation and Infection Imaging with a 99mTc-Neutrophil Elastase Inhibitor in Monkeys, J Nucl Med, Vol. 41, No. 2, Feb. 2000, CHARLES B. SAMPSON, Textbook of Radiopharmacy: Theory and Practice, Third Edition, Gordon and Breach Science Publishers. TANYA JAWAB Tumpal Pandiangan Bagaimana cara membandingkannya dan mana yang terbaik untuk diimplementasikan? Widyastuti Kedua metode dibandingkan efisiensi pelabelannya, stabilitas in-vitro (dalam serum dan fosfat buffer salin) dan efektivitasnya sebagai pencitra tumor, serta kepraktisan dalam proses pengerjaan. Yang terbaik adalah metoda menggunakan NHS-Hynic karena lebih praktis dan efisien, sedangkan parameter lainnya yang dibandingkan tidak memberikan perbedaan yang berarti. Gina Mondrida Kenapa uji biodistribusi dilakukan pada tikus yang sehat, bukan pada tikus yang menderita tumor? Uji stabilitas in-vivo kenapa tidak dilakukan? Widyastuti Uji biodistribusi pada tikus sehat dimaksudkan untuk melihat sifat farmakokinetik sediaan Tc99mpeptida, yang mana apabila sebagian besar terakumulasi pada saluran kemih dan ginjal dan hanya sebagian kecil yang terakumulasi pada organ lain, hal ini menunjukkan sifat farmakokinetik yang baik/sesuai dengan kegunaan sebagai penatah tumor. Uji biodistribusi pada tikus yang sakit (menderita tumor) seharusnya dilakukan tetapi fasilitas laboratorium untuk menginduksi tumor belum tersedia.karena uji stabilitas in-vitro yang dilakukan dalam serum manusia segar dan dapar fosfat-salin sudah mewakili kondisi in-vivo.

6 121 ISSN Widyastut, dkk.

7 Widyastut, dkk. ISSN