3. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian 3.2 Materi Hewan Coba Ekstrak kelopak bunga Rosela

Transkripsi

1 3. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Bagian Bedah dan Radiologi serta Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor (IPB) pada bulan Maret 2010 sampai September Materi Hewan Coba Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan hewan coba sebagai model. Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini yaitu 24 ekor mencit jantan (Mus musculus) dengan rata-rata umur 4 minggu dengan bobot awal gram. Mencit yang digunakan merupakan mencit strain ddy dan diberi pretreatment sebelum dikawinkan. Mencit jantan tersebut diperoleh dari pembiakan di Fakultas Kedokteran Hewan IPB Ekstrak kelopak bunga Rosela Penelitian ini menggunakan ekstrak kelopak bunga rosela dari petani rosela di Dramaga, Bogor, Jawa Barat. Ekstraksi kelopak bunga rosela dilakukan di Balitro (Balai Penelitian Tanaman Obat) Cimanggu, Bogor. Bunga dikeringkan di bawah sinar matahari dan dihaluskan. Tahapan selanjutnya, sebanyak 200 gram serbuk bunga diekstrak dengan etanol 96% pada suhu 40 C. Pembuatan ekstrak tanaman rosela meliputi proses maserasi dan evaporasi. Maserasi adalah proses perendaman simplisia menggunakan pelarut untuk memperoleh zat aktif dari simplisia tersebut. Proses maserasi dilakukan menggunakan pelarut etanol. Maserat yang telah diperoleh dipisahkan kemudian dievaporasi. Evaporasi merupakan proses pemekatan dengan cara menguapkan pelarut tanpa menjadi kering. Simplisia yang telah kering dihaluskan, lalu dilakukan maserasi dengan menambahkan etanol 70% hingga seluruh simplisia terendam oleh etanol dalam maserator. Maserasi dilakukan selama tiga hari dan tiap 24 jam ekstrak ditampung

2 25 dan pelarut diganti dengan yang baru. Setelah tiga hari, ekstrak yang telah diproses kemudian dipekatkan sehingga diperoleh ekstrak kental dengan bobot tetap. Kemudian diuapkan dengan rotary evaporator hingga didapat ekstrak kental seberat gram dengan rendemen 37.84%. Ekstraksi yang dilakukan dengan maserasi yang merupakan ekstraksi dengan cara dingin. Proses ekstraksi dengan cara dingin relatif lebih aman terhadap zat -zat yang terkandung di dalam simplisia jika dibandingkan dengan penggunaan ekstraksi cara panas karena kemungkinan zat yang terkandung dalam simplisia tersebut bersifat termolabil. Kemudian dilanjutkan dengan freeze drier agar hasil yang didapat konstan sesuai dengan hasil yang diinginkan (Rostinawati 2009). Maserasi dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman Obat Bogor dan evaporasi dilakukan oleh Laboratorium Bioteknologi di Fakultas Perikanan IPB Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam pemeliharaan mencit pada penelitian ini yaitu pelet (pakan mencit komersial), air mineral untuk minum mencit, NaCl fisiologis, anthelmentik (Albendazol ), antibiotik (Clavamox ), antifungal (Metronidazol ), dan akuades. Bahan-bahan yang digunakan untuk pewarnaaan histopatologis yaitu sebagai berikut: Larutan Mayers Hematoksilin, Larutan Eosin, alkohol dengan konsentrasi bertingkat (70%, 80%, 90%, 96%), xylol, eter, Buffered Neutral Formalin (BNF) 10%, parafin cair, albumin, metanol dan permount. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu adalah kandang mencit yang dimodifikasi yang dapat dilihat pada Gambar 13 (Box plastik dengan ukuran panjang 30 cm, lebar 20 cm, dan tinggi 15 cm dengan tutup yang terbuat dari anyaman kawat untuk tempat pemeliharaan mencit selama penelitian berlangsung; botol yang dilengkapi dengan saluran air sebagai tempat minum mencit), kertas label, sekam kering, timbangan digital, kapas, syringe, sonde lambung, kulkas, steroform, jarum pentul, cawan petri, peralatan bedah (pinset, skalpel dan gunting), pesawat Roentgen, dan apron. Peralatan untuk pembuatan dan pengamatan sediaan histopatologi terdiri atas tissue casset, automatic tissue

3 26 percessor, mikrotom, pencetak parafin, gelas objek, gelas penutup, mikroskop cahaya, dan alat fotografi mikro. 3.3 Prosedur Penelitian Aklimatisasi dan Pre- treatment Mencit Sebelum perlakuan semua mencit diaklimasi untuk menyesuaikan kondisi laboratorium penelitian selama 2 minggu. Mencit tersebut dikelompokkan menjadi 4 kelompok, setiap kelompok terdiri atas 6 ekor mencit. Setiap kelompok mencit dikandangkan dalam kandang yang dimodifikasi (Box plastik dengan ukuran panjang 30 cm, lebar 20 cm, dan tinggi 15 cm dengan tutup yang terbuat dari anyaman kawat untuk tempat pemeliharaan mencit selama penelitian berlangsung; botol yang dilengkapi dengan saluran air sebagai tempat minum mencit). Bentuk dan kondisi kandang dapat dilihat pada Gambar 13 berikut. Gambar 13 Kandang mencit dengan alas kandang berupa serbuk gergaji. Mencit jantan diberi pakan komersial dan minum secara ad libitum. Pakan komersial yang diberikan berbentuk pelet yang dibeli dari tempat penjualan pakan terdekat. Untuk menjaga kebersihan dan kesehatan mencit maka kandang dan alas sekam dibersihkan dan diganti setiap tiga hari sekali. Pre-treatment yang diberikan pada mencit berupa pencekokan anthelmentik (Albendazol ) 5% dengan dosis 10 mg/kg BB dengan dua kali pemberian, dengan selang dua minggu antara pemberian pertama dan kedua, antifungal (Metronidazol ) 50 mg/kg BB selama lima hari berturut-turut, antibiotik (Clavamox ) 125 mg/kg BB selama lima hari berturut-turut (Hrapkiewiez dan Mediana 2007).

4 Perlakuan Terhadap Hewan Percobaan Mencit dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan, yaitu, 1) kelompok kontrol (NaCl fisiologis 0.9 % atau saline) (K), 2) kelompok perlakuan primer (P), 3) kelompok perlakuan rosela (R), dan 4) kelompok perlakuan rosela primer (RP). Di bawah ini disajikan Tabel 4, pembagian kelompok mencit perlakuan. Tabel 4 Kelompok mencit perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini Kelompok mencit K P R RP Perlakuan Mencit kontrol yakni mencit yang tidak diberi radiasi dan NaCl fisiologis 0.9 % (saline) (n=6) Mencit primer yakni mencit yang diberi radiasi dan NaCl fisiologis 0.9 % (saline) (n=6) Mencit Rosela yakni mencit yang tidak diberi radiasi tetapi diberi ekstrak kelopak rosela (n=6) Mencit rosela primer yakni mencit yang diberi radiasi dan ekstrak kelopak rosela (n=6) Ket: cekok NaCl fisiologis 0.9 % (saline) pada kelompok kontrol dan ekstrak kelopak rosela dengan dosis 0.2 ml/ekor/ 2 hari. NaCl fisiologis 0.9 % (saline) dan ekstrak kelopak rosela diberikan secara per oral menggunakan sonde lambung. Semua kelompok diberi perlakuan berdasarkan pembagian kelompok di atas. Masa perlakuan berupa pencekokan rosela dan pemberian paparan radiasi selama 8 minggu. Setelah 8 minggu dilakukan nekropsi pada 3 ekor mencit dari masing-masing kelompok. Tiga ekor sisanya kemudian diberi masa pemulihan tanpa radiasi dan rosella selama 30 hari untuk kemudian dinekropsi. Hasil nekropsi dari masing-masing masa perlakuan akan dibandingkan secara histopatologinya Paparan Radiasi Kelompok mencit yang mendapat radiasi sinar-x primer dari mesin sinar- X VR-1020 Medical Corp. Japan, dengan jarak sumber radiasi terhadap mencit dalam kandang 100 cm pada berkas sinar utama. Pemaparan radiasi dilakukan 2 hari sekali dengan dosis perlakuan 0.2 msv/paparan, waktu paparan per detik selama delapan minggu dengan besar total paparan diukur dengan menggunakan pen dose MyDrse TM ALOKA CO. LTD Tokyo Japan. Setelah 8 minggu keseluruhan data besar dosis paparan radiasi sinar-x pada masing-masing kelompok dijumlahkan. Setelah 30 hari masa pemulihan dari

5 28 minggu ke-9 sampai minggu ke-12 kelompok mencit perlakuan tidak diberi paparan radiasi dan tanpa pencekokan Pemberian Ekstrak Rosela Mencit yang diterapi dengan ekstrak rosela adalah mencit kelompok R dan RP. Sebelum pemberian ekstrak rosela, mencit direstrain terlebih dahulu secara manual mulai dari belakang telinga sampai dengan dorsal punggung. Ekstrak rosela diencerkan dengan akuadest dengan komposisi 1.5 gram ekstrak dalam 200 ml aquadest, sehingga konsentrasi adalah 7.5 g/ml. Dosis yang digunakan adalah 50 mg/ml/berat badan atau 0.2 ml/ekor/dua hari dengan menggunakan sonde lambung (Akindahunsi dan Olelaye 2003; Ali et al. 2005). Sonde lambung digunakan secara hati-hati sehingga larutan ekstrak rosela tidak masuk ke dalam saluran pernapasan. Pemberian ekstrak rosela dilakukan setiap dua hari sebelum diradiasi dengan sinar-x. Cara pencekokan ekstrak kelopak bunga rosela dapat dilihat pada Gambar 14. Gambar 14 Pencekokan bahan perlakuan (NaCl dan ekstrak kelopak bunga rosela) pada mencit Nekropsi Setelah mencit kelompok perlakuan 8 minggu dan 12 minggu diberi perlakuan kemudian dilakukan nekropsi pada mencit. Pertama dilakukan penimbangan mencit lalu dianastesi dengan menggunakan kombinasi Ketamin 30 mg/kg dan Xylazine 5 mg/kg BB intra peritoneal. Mencit diberi anastesi dengan dosis over dosis (OD) hingga mati. Lalu mencit dinekropsi untuk kemudian diambil sampel usus yang telah ditentukan bagiannya. Kemudian bagian-bagian

6 29 usus yang telah diambil dibuka lumennya, setelah itu bagian ujung-ujung usus tersebut disteples pada kertas karton dengan pemukaan dalam dibagian atasnya. Fiksasi kesemua bagian usus yang telah diambil ke dalam larutan Buffer Neutral Formalin atau BNF 10% selama dua hari Pembuatan Sediaan Histopatologi Pembuatan sediaan histopatologi diawali dengan pemotongan tipis pada bagian usus yang telah diawetkan dalam larutan Buffer Neutral Formalin atau BNF 10% selama dua hari. Bagian usus dipotong dengan lebar 0.5 cm sehingga dapat dimasukkan kedalam Tissue Casset dan dikelompokkan sesuai kelompoknya. Dehidrasi dilakukan dengan cara merendam sediaan tersebut secara berturut-turut kedalam alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut II, xylol I, xylol II, parafin I dan parafin II. Proses perendaman pada setiap bahan dilakukan selama 2 jam dan berjalan secara otomatis dalam alat automatic tissue processor. Proses dilanjutkan dengan pencetakkan sampel organ dalam paraffin agar membentuk blok jaringan sehingga dapat dipotong menggunakan mikrotom setebal 5 µm. Potongan blok paraffin berbentuk pita (ribbon), diletakan di atas permukaan air hangat 45 C dengan tujuan untuk menghilangkan lipatan akibat pemotongan. Sediaan diangkat dari permukaan air dengan gelas objek yang telah diulasi larutan albumin yang berfungsi sebagai perekat. Sediaan selanjutnya dikeringkan dalam inkubator suhu 60 C selama 24 jam. Proses pewarnaan diawali dengan deparafinisasi ke dalam xylol sebanyak dua kali, masing-masing selama dua menit. Sediaan selanjutnya melalui proses rehidrasi. Proses rehidrasi dimulai dari alkohol absolut sampai ke alkohol 80%, yang masing-masing lamanya 2 menit. Sediaan selanjutnya dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Sediaan yang telah kering diwarnai dengan pewarnaan Mayer s Hemaktosilin selama 8 menit, dibilas dengan air mengalir, dicuci dengan pewarna Eosin selama dua menit. Sediaan kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebih sebelum akhirnya dikeringkan. Sediaan kemudian dicelupkan kedalam alkohol 90 % sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, xylol I selama 1 menit dan xylol II selama 2 menit. Sediaan ditetesi perekat

7 30 permount, ditutup dengan gelas penutup, dan dibiarkan kering sesuai dengan metode Bagian Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Sediaan siap dilihat dan setelah perekat kering diamati menggunakan mikroskop cahaya. Selain pewarnaan Hematoksilin-eosin (HE) seperti yang dijelaskan di atas, dilakukan pula pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) untuk melihat sel goblet lebih jelas. Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS) diawali dengan deparafinisasi, kemudian preparat dibilas dengan akuades lalu direndam kedalam larutan asam asetat 1% selama 5 menit dan dibilas kembali dengan akuades. Preparat selanjutnya dioksidasi dalam periodc acid 1% selama 5-10 menit, lalu bilas dengan akuades tiga kali masing-masing 5 menit. Preparat dimasukkan kedalam schiff reagent selama menit, dibilas lagi dengan air sulfit (10 % sodium bisulfat (NaHSO 3 ) 10 ml, 1 N HCl 10 ml dan akuadesilata 200 ml) dengan masing-masing 2 menit selama bilasan pada masing-masing larutan. Setelah itu preparat dibilas dengan air kran mengalir selama menit lalu dibilas dengan akuades. Terakhir dilakukan dehidrasi dengan xylol kemudian ditetesi perekat permount, ditutup dengan gelas penutup, dan dibiarkan kering sesuai dengan metode Bagian Patologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Sediaan siap dilihat dan setelah perekat kering diamati menggunakan mikroskop cahaya Pengamatan Histopatologi Pengamatan histopatologi dilakukan secara deskriptif maupun kuantitatif menggunakan mikroskop dengan perbesaran 200 kali (20x objektif dan 10x okuler) dan 400 kali (40x objektif dan 10x okuler) serta dibuat foto menggunakan digital eyepiece camera. Pengambilan foto dilakukan sebanyak 10 lapangan pandang pada masing-masing kelompok dengan tiga kali perulangan. Rata-rata luas lapang pandang pada foto dengan perbesaran 200 kali ialah µm 2 sedangkan pada foto dengan perbesaran 400 kali ialah µm 2. Pengamatan pada bagian usus tersebut ialah untuk melihat a) persentase kerusakan vili usus b) jumlah kripta usus c) jumlah sel goblet, dan d) tinggi vili usus. Untuk perhitungan jumlah sel goblet maka preparat histopatologi usus diberi pewarnaan khusus yakni Periodic Acid Schiff (PAS). Perhitungan menggunakan software Image J Launcher.

8 Analisis Data Dalam penelitian ini akan diperoleh data dalam bentuk foto, nilai hasil perhitungan kuantitatif perubahan histopatologi dari bagian usus. Nilai data kuantitatif, yang terdiri atas persentase kerusakan vili usus, jumlah kripta usus, jumlah sel goblet dan tinggi vili usus pada mukosa usus halus sebanyak 10 lapangan pandang, yang ditampilkan dalam bentuk Mean +/- Standar Deviation dan dilanjutkan dengan Ducan test untuk membandingkan antara kelompok. Kesimpulan dalam perbedaan hasil didapatkan dengan metode one-way ANOVA untuk menilai multi kelompok. Nilai P<0.05, ditetapkan hasilnya bermakna atau signifikan berbeda nyata. Secara singkat metode penelitian ini dapat digambarkan seperti diagram alur pada Gambar 15. Ekstraksi kelopak bunga rosela Persiapan dan aklimatisasi hewan coba Pengelompokan hewan coba Kelompok K (Kontrol), n=6 Kelompok P (Primer), n=6 Kelompok R (Rosela), n=6 Kelompok RP (Radiasi rosela), n=6 Pretreatment selama 2 minggu Albendazole 10 mg/kg Clavamox 125 mg/kg Metronidazole 50 mg/kg Perlakuan; pencekokan dan radiasi NaCl fisiologis, sinar- X dan ekstrak kelopak bunga rosela Kontinyu

9 32 Kontinyu Delapan minggu perlakuan kelompok n=3 Pemulihan selama empat minggu tanpa perlakuan kelompok n=3 Pembuatan dan pembacaan preparat histopat Alat bedah minor, Ketamin 30 mg/kg dan Xylazine 5 mg/kg BB intra peritoneal dan Buffered Neutral Formalin (BNF) 10% Alat bedah minor, Ketamin 30 mg/kg dan Xylazine 5 mg/kg BB intra peritoneal dan Buffered Neutral Formalin (BNF) 10% Perangkat lunak Image J Launcher Analisis statistik SAS 9.1 dan ANOVA Gambar 15 Alur penelitian yang telah dilaksanankan secara umum.