3 METODE PENELITIAN. Gambar 3 Garis besar jalannya penelitian

Transkripsi

1 3 METODE PENELITIAN 3. 1 Waktu dan tempat penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Protozoologi, Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Waktu penelitian pada bulan Oktober Maret Alur Penelitian Gambar 3 Garis besar jalannya penelitian 3. 3 Metode Persiapan hewan coba Hewan coba yang digunakan adalah mencit dari galur DDY dengan jenis kelamin jantan. Berat badan sekitar 25 gram atau berusia sekitar 2 bulan. Isolat P.berghei diperoleh dari Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan,

2 18 Kementerian Kesehatan, RI. Sebanyak 0,1 ml suspensi diinfeksi secara intra peritoneal pada mencit donor. Pengamatan angka parasitemia pada mencit donor dilakukan setiap hari mulai hari kelima setelah inokulasi. Pengamatan dilakukan dengan membuat preparat darah apus tebal dan tipis. Pada saat tingkat parasitemia mencapai lebih dari 1x10 4 /µl darah (Dewi et al. 1996), darah mencit donor tersebut diambil dari jantung dan diinfeksikan kepada mencit sebagai hewan coba Penentuan dosis obat Sesuai takaran jamu yang digunakan masyarakat (dosis empiris) yaitu 2 sendok teh diseduh dalam satu gelas air. Infusa dibuat dengan memanaskan campuran tersebut menggunakan panci khusus. Larutan dipanaskan diatas air mendidih selama 15 menit dengan suhu kurang lebih 90 o C (Depkes RI 1995). Hasil yang diperoleh lalu disaring dan dikeringkan di dalam oven. Setelah kering, timbang padatan yang tersisa dan digunakan sebagai acuan dosis uji yaitu dosis pada manusia yang digunakan secara empiris oleh masyarakat Kalimantan Timur sebesar 0,196 mg/kg BB dewasa. Dosis ini kemudian dikonversi menjadi dosis pada mencit dengan berat badan 25 gr, dan diperoleh dosis 0,625 mg Pembuatan simplisia Akar tanaman kayu kuning dikoleksi dalam keadaan segar dari hutan wilayah Kecamatan Samboja, Kabupaten Kutai Kartanegara, Kalimantan Timur pada bulan Juli Bagian-bagian lain dari tanaman seperti daun, batang dan buah juga dikoleksi untuk keperluan identifikasi tanaman. Bagian akar C. fenestratum dipisahkan kemudian dibersihkan dari kotoran. Setelah bersih bagian tumbuhan dicacah dan dikeringkan dengan diangin-anginkan, selanjutnya digiling dan ditimbang. Serbuk kering direndam dengan etanol 80% perbandingan 1 kg akar menggunakan 6 liter etanol dan diaduk dengan stirrer selama 3 jam lalu didiamkan selama 24 jam kemudian disaring dengan kertas saring (Harborne 1987). Filtrat yang ada ditampung. Pengulangan dilakukan sampai didapatkan filtrat yang jernih. Filtrat dipekatkan dengan rotary evaporator menjadi ekstrak. Ekstrak ditimbang untuk mengetahui rendemen ekstrak.

3 19 Hal yang sama dilakukan juga pada ekstraksi dengan air, pelarut yang digunakan adalah aquadest. Hasil maserasi akar tanaman C. fenestratum seberat 1 kg setelah dikeringkan diperoleh sebagai rendemen, yaitu perbandingan berat ekstrak yang diperoleh dengan berat simplisia awal. Rumus menghitung rendemen adalah sebagai berikut : Rendemen = (Berat ekstrak / Berat sampel kering) x 100% (Souri et al dalam Muhtadi 2008) Penapisan fitokimia Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui komponen kimia yang terdapat pada tumbuhan dengan menggunakan metode Cuilei (1984). Penapisan fitokimia serbuk simplisia dilakukan terhadap golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, kuinon, steroid-triterpenoid Pemeriksaan alkaloid Sebanyak 5 gram simplisia dilembabkan dengan 5 ml amonia 25% dan digerus dalam mortir. Setelah ditambah 20 ml kloroform, bahan digerus lagi kuat-kuat dan disaring. Filtrat berupa larutan organik digunakan untuk percobaan selanjutnya. Untuk mengetahui kandungan unsure kimianya, maka sebagian larutan ini diteteskan pada kertas saring yang telah ditetesi pereaksi Dragendorff. Terbentuknya warna merah atau jingga pada kertas saring menunjukkan adanya alkaloid. Sisa larutan organik diekstraksi dua kali dengan asam klorida dengan perbandingan tertentu (1:10 v/v). Ke dalam dua tabung reaksi yang masing-masing berisi 5 ml larutan ini ditambahkan beberapa tetes pereaksi Dragendorff dan Mayer. Terbentuknya endapan merah bata dengan pereaksi Dragendorff atau endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukkan adanya alkaloid Pemeriksaan flavanoid Sebanyak 10 gram simplisia ditambahkan 100 ml air panas, dipanaskan sampai mendidih selama 5 menit dan disaring. Ke dalam 5 ml filtrat ditambahkan serbuk

4 20 magnesium, 1 ml asam klorida pekat, dan 2 ml larutan amil alkohol dikocok kuat dan dibiarkan memisah. Adanya kandungan flavanoid ditunjukkan dengan adanya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol Pemeriksaan saponin Sebanyak 10 ml larutan percobaan yang berasal dari pemeriksaan flavonoid dimasukkan ke dalam tabung reaksi, dikocok kuat secara vertikal selama 10 detik. Terbentuknya busa setinggi 1 sampai 10 cm yang stabil tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang pada penambahan setetes asam klorida 2 N menunjukkan adanya saponin Pemeriksaan tannin Sebanyak 10 gram simplisia dalam 100 ml air dididihkan selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Filtrat dibagi menjadi tiga bagian. Ke dalam filtrat pertama ditambahkan larutan besi(iii) (feri)-klorida 1%, timbulnya warna hijau biru atau hitam menunjukkan adanya tanin. Pada filtrat kedua ditambahkan larutan gelatin, terbentuknya endapan putih menunjukkan adanya tanin. Ke dalam filtrat ketiga ditambahkan pereaksi Steasny (campuran formaldehida 30% dengan asam klorida pekat 2:1), kemudian dipanaskan dalam penangas air. Terbentuknya endapan warna merah muda menunjukkan adanya tanin katekat. Kemudian endapan disaring, filtrat dijenuhkan dengan natrium asetat dan ditambahkan beberapa tetes besi(iii) feri-klorida 1%. Terbentuknya warna biru tinta menunjukkan adanya tanin galat Pemeriksaan kuinon Sebanyak 1 gram simplisia dalam 10 ml air dididihkan selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring. Natrium hidroksida 1 N ditambahkan ke dalam 5 ml filtrat. Terbentuknya warna merah menunjukkan adanya kuinon.

5 Pemeriksaan steroid/triterpenoid Sebanyak 5 gram simplisia dimaserasi dalam 20 ml eter selama 2 jam kemudian disaring. Sebanyak 5 ml filtrat diuapkan dalam cawan penguap sampai kering. Ke dalam residu ditambahkan dua tetes asam asetat glasial dan setetes asam sulfat pekat. Terbentuknya warna merah-ungu menunjukkan adanya triterpenoid, dan jika terbentuk warna hijau-biru menunjukkan adanya steroid Uji efektivitas ekstrak Penelitian ini adalah penelitian observasional dengan desain quasi eksperimental secara in vivo. Pada penelitian ini digunakan hewan coba yang dikelompokan sebagai kelompok kontrol dan kelompok perlakuan.. Pada kelompok perlakuan, satu kelompok diberi pengobatan ekstrak etanol akar tanaman kayu kuning, dan kelompok lainnya diberi ekstrak air akar tanaman kayu kuning. Kelompok kontrol terdiri dari kontrol positif (pengobatan dengan klorokuin) dan kontrol negatif (tanpa pengobatan atau hanya pelarut/pga (Pulvis Gum Arabic) 3%. Tiap kelompok perlakuan terdiri dari 5 ekor mencit (Mus musculus) jantan. Mencit yang digunakan adalah mencit putih jantan dari galur DDY berumur 2-3 bulan dengan berat badan rata-rata 25 gram /ekor. Pakan dan air minum diberikan secara adlibitum. Mencit diinokulasi dengan 0.1 ml darah yang mengandung 1x10 P. berghei secara intra peritoneal. Mencit dikelompokkan menjadi 8 kelompok (6 kelompok perlakuan dan 2 kontrol), masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit, yaitu : 1) Kelompok kontrol negatif, adalah kelompok mencit yang diinfeksi P. berghei dan diberi larutan PGA (Pulvis Gum Arabic) 3% 2) Kelompok kontrol positif, mencit terinfeksi dan diobati dengan Klorokuin 3) Kelompok perlakuan ekstrak etanol dosis 0,625 mg/25 gr BB = 25 mg/kg BB (E1) 4) Kelompok perlakuan ekstrak etanol dosis 1,25 mg/25 gr BB = 50 mg/kg BB (E2) 5) Kelompok perlakuan ekstrak etanol dosis 3,75 mg/25 gr BB = 150 mg/kg BB (E3) 6) Kelompok perlakuan ekstrak air dosis 0,625 mg/25 gr BB = 25 mg/kg BB (A1) 7) Kelompok perlakuan ekstrak air dosis 1,25 mg/25 gr BB = 50 mg/kg BB (A2) 4

6 22 8) Kelompok perlakuan ekstrak air dosis 3,75 mg/25 gr BB = 150 mg/kg BB (A3) Setelah mencit positif, dilakukan pengobatan menggunakan sonde lambung sekali dalam sehari dengan pemberian dua dosis sekaligus dan dilakukan selama tiga hari berturut-turut. Saat pemberian pengobatan disebut hari ke-0, ke-1 dan ke- 2. Pengamatan angka parasitemia dilakukan dengan membuat preparat apus darah tebal dan tipis yang diambil dari vena ekor pada hari ke 0, 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21, dan 28 setelah pemberian ekstrak (Tuti et al. 2007) Pembuatan Preparat Hapusan Darah Tebal dan Tipis Pembuatan preparat darah dilakukan dengan meneteskan 1 tetes darah ke atas gelas obyek, kemudian dibuat sediaan apus tipis dan tebal, darah dibiarkan sampai kering pada suhu kamar. Pada bagian sediaan darah tipis dilakukan fiksasi dengan metanol absolut selama 1 detik, kemudian diwarnai dengan larutan Giemsa secara standar (5% larutan Giemsa selama 30 menit), terakhir dibilas dengan menggunakan air mengalir. Sediaan darah diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali menggunakan minyak immersi. Pembacaan diawali pada sediaan darah tebal untuk melihat sediaan darah positif atau negatif. Kepadatan parasit dihitung berdasarkan jumlah eritrosit yang terinfeksi dalam 1000 eritrosit, dihitung menggunakan rumus Persen parasitemia (%) = ( eritrosit terinfeksi / ± 1000 eritrosit ) x 100% (Kakkilaya 2002). Rumus untuk menentukan penghambatan pertumbuhan parasit adalah : Persen penghambatan (%) = 100% - (( uji parasitemia/ kontrol parasitemia) x 100%) (Souri et al dalam Muhtadi 2008) Analisa Hasil Hasil yang diperoleh diuji dengan Analysis of Variance (ANOVA) dan jika ada perbedaan dilakukan uji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT), menggunakan software SPSS versi Data ditampilkan dalam bentuk tabel dan diagram.