BAB III METODOLOGI PENELITIAN. Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik. Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

Transkripsi

1 BAB III METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis Penelitian Penelitian ini bersifat eksperimental laboratorik. B. Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. C. Subjek Penelitian Subjek penelitian didapatkan dari penelitian payung bidang neuroscience yang dikembangkan oleh dr. Nanang Wiyono M.Kes, dr. Brian Wasita Ph.D, dr. Ratih Puspita F., M.Sc. Subjek berupa tikus yang sudah diberikan perlakuan pemberian ekstrak Etanol Pegagan dengan berbagai dosis perlakuan (0, 150, 300, 600 mg/kg BB, dan fluoxetin 10 mg) 2 jam sebelum diinduksi stres. Stres imobilisasi diberikan 6 jam per hari selama 21 hari. Selanjutnya dari tikus diambil organ testis untuk diproses menjadi sediaan Blok Parafin. Kriteria inklusi: sediaan organ testis tikus yang telah diberi perlakuan. Kriteria eksklusi: sediaan organ yang rusak dan tidak dapat diproses lebih lanjut. 24

2 25 D. Teknik Pengambilan Sampel Sampel berasal dari tikus yang sebelumnya telah diberi perlakuan pemberian variasi dosis ekstrak Pegagan dan stres imobilisasi. Selanjutnya diambil jaringan testis yang diproses lebih lanjut menjadi sediaan Blok Parafin. Pengambilan sampel disesuaikan dengan kelompok percobaan pada perlakuan penelitian sebelumnya. E. Rancangan Penelitian Tikus yang telah diberi perlakuan Kontrol (KK) : tanpa stres dan tanpa ekstrak Etanol Pegagan Induksi Stres dan PGA (KS) Perlakuan dosis 1 (KP1) : stres dan ekstrak Etanol Pegagan 150 mg/kg BB Perlakuan dosis 2 (KP2) : stres dan ekstrak Etanol Pegagan 300 mg/kg BB Perlakuan dosis 3 (KP3) : stres dan ekstrak Etanol Pegagan 600 mg/kg BB Kontrol Positif (KP+) : stres dan Fluoxetin 10 mg Jaringan testis diambil sebagai model stres kemudian diproses menjadi sediaan Blok Parafin Pembuatan slide dari sediaan Blok Parafin dilanjutkan pengecatan sediaan dengan cat Hematoxylin Eosin (HE) Pengamatan gambaran histopatologis testis dengan derajat histopatologi menurut Priya dan Reddy (2012) dengan modifikasi Penilaian gambaran histopatologi testis Dibandingkan dengan uji statistik Gambar 3.1. Skema commit Rancangan to user Penelitian

3 26 F. Identifikasi Variabel Penelitian 1. Variabel bebas Yang menjadi variabel bebas adalah pemberian ekstrak Etanol Pegagan dengan variasi dosis perlakuan. 2. Variabel terikat Yang menjadi variabel terikat adalah gambaran histopatologi testis tikus yang diamati dengan melihat gambaran histopatologi testis dinilai dengan derajat histopatologi menurut Priya dan Reddy (2012) dengan modifikasi. 3. Variabel luar Variabel luar terdiri dari variabel yang dapat dikendalikan dan yang tidak dapat dikendalikan. a. Variabel luar yang dapat dikendalikan Tempat penyimpanan organ, lama penyimpanan, ruang penyimpanan, kualitas formalin buffer, pelarutan, dan fiksasi potongan preparat. b. Variabel luar yang tidak dapat dikendalikan Kondisi awal sediaan Blok Parafin. G. Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Variabel bebas: pemberian ekstrak Etanol Pegagan Ekstrak Pegagan adalah ekstrak yang berasal dari daun Pegagan yang dibuat dengan teknik maserasi etanol 70%. Pegagan diperoleh dan

4 27 diekstraksi di Lembaga Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) UGM. Ekstrak telah distandarisasi nonpesifik maupun spesifik. Ekstrak Pegagan diberikan pada tikus putih jantan galur Sprague Dawley dengan dosis I (150 mg/kg BB), II (300 mg/kg BB), III (600 mg/kg BB) selama 21 hari. Ekstrak diberikan melalui sonde lambung dengan menggunakan spuit yang telah dimodifikasi ujungnya. Skala pengukuran variabel adalah nominal. 2. Variabel terikat: Gambaran histopatologi testis tikus Derajat histopatologi testis tikus pada penelitian ini diamati dengan mengamati gambaran histopatologi testis berdasarkan derajat histopatologi (gambar 3.2) menurut Priya dan Reddy (2012) dengan modifikasi sebagai berikut: Derajat 1 Derajat 2 : Gambaran histologi testis normal (A). : Kerusakan ringan ditandai dengan adanya tubulus seminiferus yang atrofi, gangguan spermatogenesis yang ditandai dengan menipisnya epitel seminiferus dan peningkatan diameter lumen tubulus (B). Derajat 3 : Kerusakan sedang ditandai dengan adanya edema intratubulus dan jarak antartubulus yang melebar (C). Derajat 4 : Kerusakan berat ditandai dengan hilangnya integritas struktur testis normal (D). Skala pengukuran variabel ini adalah ordinal.

5 28 Gambar 3.2. Fotomikrograf Testis pada Tikus yang Diberi Stres Imobilisasi (Priya dan Reddy, 2012) 3. Variabel luar Variabel luar terdiri dari variabel yang dapat dikendalikan dan yang tidak dapat dikendalikan. Variabel luar yang dapat dikendalikan antara lain: tempat penyimpanan organ, teknik pengecatan dilakukan dengan metode HE, ruangan penyimpanan, lama penyimpanan, kualitas formalin Buffer, fiksasi hasil potongan preparat. Variabel luar yang tidak dapat dikendalikan antara lain keadaan awal sediaan Blok Parafin testis tikus putih tidak diperiksa pada penelitian ini sehingga mungkin saja ada tikus putih yang sebelum perlakuan testisnya sudah mengalami kelainan. H. Alat dan Bahan Penelitian 1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: 1) microtome; 2) freezer atau lemari es; 3) kaya obyek (object glass); 4) kaca

6 29 penutup (deck glass); 5) waterbath; 6) rak khusus pewarnaan; 7) pisau; 8) tissue cassete; 9) inkubator; 10) mikroskop cahaya medan terang; 11) kamera atau optic lamp. 2. Bahan. Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut: 1) testis tikus yang telah diberi perlakuan; 2) Parafin; 3) alkohol 50%, 70%, 90%, absolut; 4) xylol; 5) gliserin; 6) larutan Hematoksilin Mayer s; 7) larutan Eosin; 8) label; 9) HCl 1%; 10) kapas alkohol I. Cara Kerja Sediaan testis tikus yang telah diberi perlakuan sebelumnya selanjutnya diproses dengan langkah sebagai berikut: 1. Testis tikus dipotong dengan metode lamelasi. Selanjutnya dimasukkan ke dalam tissue cassete yang telah diberi label. 2. Proses dehidrasi a. Perendaman dengan alkohol 50% selama semalam b. Perendaman dengan alkohol 70% selama 0,5 jam c. Perendaman dengan alkohol 90% selama 1 jam d. Perendaman dengan alkohol absolut selama 1 jam 3. Proses clearing Perendaman dengan xylol selama 0,5 jam.

7 30 4. Proses impregnasi Merendam sediaan yang telah selesai didehidrasi dan clearing dengan menggunakan kombinasi Parafin dengan titik lebur 48 o C dan 58 o C pada suhu inkubator 60 o C selama semalam. Kombinasi Parafin ini bertujuan agar pita-pita Parafin yang telah dipotong di mikrotom dan dibentangkan pada waterbath yang berisi air hangat akan lebih mudah untuk mengembang/tidak melipat. 5. Pembuatan Blok Parafin Dalam pembuatan Blok Parafin sangat penting untuk diperhatikan orientasi sediaan dengan benar. Pada jaringan testis ini, dipilih 3 potong preparat yang representatif untuk dinilai gambaran histopatologinya. 6. Pemotongan Blok dan deparafinisasi Pemotongan Blok Parafin dilakukan dengan mikrotom. Ketebalan pita Parafin antara 3-5 µm. Kemudian pita Parafin dibentangkan pada waterbath yang berisi air hangat, setelah pitanya mengembang, ditangkap dengan obyek glass. Setelah itu dikeringkan pada inkubator. Deparafinisasi dilakukan dengan merendam slide dalam xylol selama 4x5 menit. Kemudian dibersihkan dengan menggunakan alkohol bertingkat selama 4x5 menit dimulai dengan alkohol konsentrasi tinggi. Rehidrasi diperlukan karena pewarnaan yang dipakai adalah berbasis air. Kemudian dicuci dengan air mengalir selama 5 menit.

8 31 7. Pewarnaan histopatologi dengan HE Setelah proses rehidrasi dan dicuci dengan air mengalir, slide dimasukkan dalam Hematoxylin Mayer s selama 10 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir kemudian clearing dengan menggunakan HCl 1% untuk membersihkan kelebihan hematoxylin. Slide dicuci kembali dengan air mengalir kemudian dimasukkan dalam eosin selama 30 detik. Setelah itu dicuci kembali dengan air mengalir dan dengan alkohol. Slide dikeringkan pada udara, clearing dengan xylol kemudian ditutup dengan deckglass. 8. Pengamatan histopatologi Pengamatan histopatologi sediaan testis dilakukan secara mikoskopis dengan mikroskop cahaya dilihat dengan perbesaran 100x, 400x, dan 1000x. Penilaian gambaran histopatologis dilakukan berdasarkan derajat histopatologi menurut Priya dan Reddy (2012) dengan modifikasi. Selanjutnya dari masing-masing testis dinilai derajat kerusakan histopatologinya. J. Teknik Analisis Data Statistik Data yang diperoleh akan diolah menggunakan software SPSS for Windows Selanjutnya diuji menggunakan uji statistik Kruskall- Wallis. Jika terdapat perbedaan yang bermakna, maka dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney. Derajat kemaknaan yang digunakan adalah p < 0,05 (Dahlan, 2007).