BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi dan Pusat Penelitian Kelapa Sawit (PPKS) Medan. 3.2 Bahan-bahan 3.2.1 Sampel Sampel yang diperiksa dalam penelitian ini adalah kerang darah (Anadara granosa) yang berasal dari perairan laut belawan. 3.2.2 Pereaksi Bahan yang digunakan semua pro analisis keluaran E.Merck, kecuali disebutkan lain, yaitu asam nitrat 65% b/b, asam sulfat 95% b/b, ammonium hidroksida 25% b/b, dithizon, kloroform, larutan jeruk nipis (dibuat sendiri), akuades (Lab. Kimia Farmasi Kuantitatif), akuabides (IKA), dan larutan standar Cd 1000 ppm. 3.3 Alat Alat-alat yang digunakan yaitu Spektrofotometer Serapan Atom (GBC Avanta ) dengan nyala udara asetilen, neraca analitik (Boeco Germany), neraca kasar, blender, spatula, penangas air, kaki tiga, bunsen gas, selang gas, dan alatalat gelas (pyrex).
3.4 Pembuatan Pereaksi 1. Larutan HNO 3 5N Larutan HNO 3 65% b/b sebanyak 340 ml diencerkan dengan air suling hingga 1000 ml (Ditjen POM, 1995). 2. Larutan Dithizon 0,005% b/v Dithizon sebanyak 5 mg dilarutkan dalam 100 ml kloroform (Vogel, 1990). 3. Larutan NH 4 OH 1N Ammonium hidroksida 25% b/b sebanyak 7,4 ml diencerkan dalam 100 ml air suling (Ditjen POM, 1995). 4. Larutan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia Swingle) Delapan buah jeruk nipis ( 285 gram) diperas, lalu air perasan jeruk nipis ( 160 ml) dicukupkan hingga 700 ml dengan akuades.
3.5 Rancangan Penelitian Cara Penelitian dilakukan berdasarkan bagan berikut ini: Kerang darah dengan kadar Cd tinggi Perebusan kerang darah dalam akuades selama 1 menit Perebusan kerang darah dalam akudes selama 15 menit Perebusan kerang darah dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit Perebusan kerang darah dalam larutan jeruk nipis selama 15 menit Kerang dengan kadar rendah Cd Kerang dengan kadar rendah Cd Kerang dengan kadar rendah Cd Kerang dengan kadar rendah Cd
3.6 Prosedur Penelitian 3.6.1 Pengambilan sampel Metode pengambilan sampel dilakukan secara sampling purposif yang dikenal juga sebagai sampling pertimbangan dimana pengambilan sampel dilakukan berdasarkan pertimbangan bahwa semua jenis kerang darah yang dijual di daerah Pantai Belawan adalah homogen. 3.6.2 Penyiapan Sampel Kerang darah sebanyak 2 kg dicuci bersih, dan dibagi menjadi 5 bagian. Bagian pertama (400 gram) dikeluarkan daging kerang dari cangkangnya, dicuci bersih, lalu ditiriskan selama 15 menit. Setelah itu diblender hingga halus. Sampel yang telah halus ditimbang sebanyak 10 gram (sampel tanpa perebusan). Bagian Kedua (400 gram) kerang dicuci bersih. Setelah kerang dicuci bersih, dididihkan akuades terlebih dahulu. Setelah akuades mendidih, dimasukkan kerang yang telah bersih kedalamnya dan direbus selama 1 menit. Setelah 1 menit, kerang diangkat dan ditiriskan hingga dingin lalu dikeluarkan daging kerang dari cangkangnya. Setelah itu diblender hingga halus. Sampel yang telah halus ditimbang sebanyak 10 gram (sampel dengan perebusan dalam akuades selama 1 menit). Bagian ketiga (400 gram) kerang dicuci bersih. Setelah kerang dicuci bersih, dididihkan akuades terlebih dahulu. Setelah akuades mendidih, dimasukkan kerang yang telah bersih kedalamnya dan direbus selama 15 menit. Setelah 15 menit, kerang diangkat dan ditiriskan hingga dingin lalu dikeluarkan daging kerang dari cangkangnya. Setelah itu diblender hingga halus. Sampel yang telah
halus ditimbang sebanyak 10 gram (sampel dengan perebusan dalam akuades selama 15 menit). Bagian Keempat (400 gram) kerang dicuci bersih. Setelah kerang dicuci bersih, dididihkan larutan jeruk nipis terlebih dahulu. Setelah larutan jeruk nipis mendidih, dimasukkan kerang yang telah bersih kedalamnya dan direbus selama 1 menit. Setelah 1 menit, kerang diangkat dan ditiriskan hingga dingin lalu dikeluarkan daging kerang dari cangkangnya. Setelah itu diblender hingga halus. Sampel yang telah halus ditimbang sebanyak 10 gram (sampel dengan perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit). Bagian kelima (400 gram) kerang dicuci bersih. Setelah kerang dicuci bersih, dididihkan larutan jeruk nipis terlebih dahulu. Setelah larutan jeruk nipis mendidih, dimasukkan kerang yang telah bersih kedalamnya dan direbus selama 15 menit. Setelah 15 menit, kerang diangkat dan ditiriskan hingga dingin lalu dikeluarkan daging kerang dari cangkangnya. Setelah itu diblender hingga halus. Sampel yang telah halus ditimbang sebanyak 10 gram (sampel dengan perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 15 menit). 3.6.3 Proses Destruksi Basah Untuk Kadmium (Modifikasi dari Haswell, 1991) Sampel kerang yang telah dihaluskan untuk setiap perlakuan, ditimbang masing-masing sebanyak 10 gram dalam erlenmeyer. Sampel yang telah diketahui beratnya selanjutnya ditambahkan H 2 SO 4 (p) sebanyak 5 ml. Lalu ditambahkan HNO 3 (p) sebanyak 20 ml dan diamkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, sampel di destruksi di penangas air hingga larutan sampel berwarna kuning jernih. Kemudian dipindahkan kedalam labu tentukur 100 ml dan ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides, lalu disaring dengan kertas saring whatman no.42
dengan membuang 10 ml larutan pertama hasil penyaringan. Larutan hasil destruksi ini digunakan untuk uji kualitatif dan uji kuantitatif logam Kadmium (Cd). 3.6.4 Analisa Kualitatif Kedalam tabung reaksi dimasukkan 2 ml larutan sampel, diatur ph=12 dengan penambahan ammonium hidroksida 1 N, ditambahkan 2 ml dithizon 0,005% b/v, dikocok kuat, dibiarkan larutan memisah. Terbentuk warna merah muda berarti sampel mengandung Cd (Fries, 1977). 3.6.5 Analisa Kuantitatif 3.6.5.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan berdasarkan pengaturan alat spektrofotometer serapan atom yang telah di standardisasi, yaitu panjang gelombang untuk logam Kadmium (Cd) 228,8 nm. 3.6.5.2 Penentuan Kurva Kalibrasi Logam Kadmium (Cd) Larutan standar Kadmium (Cd) (1000 mcg/ml) dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO 3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides (konsentrasi 100 mcg/ml). Larutan standar Kadmium (Cd) (100 mcg/ml) dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO 3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides (konsentrasi 10 mcg/ml). Larutan kerja Kadmium (Cd) dibuat dengan memipet 0,5; 1; 2; 4; 6 ml larutan baku 10 mcg/ml, dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml HNO 3 5N kemudian ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides
(larutan kerja ini mengandung 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; dan 0,6 mcg/ml) dan diukur pada panjang gelombang 228,8 nm. 3.6.5.3 Penentuan Kadar logam Dalam Kerang Darah Larutan sampel yang telah didestruksi diukur absorbansinya dengan spektrofotometer serapan atom pada panjang gelombang 228,8 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh berada dalam rentang kurva kalibrasi larutan baku Kadmium (Cd). Konsentrasi Kadmium (Cd) dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan linier dari kurva kalibrasi. Kadar logam kadmium (Cd) dalam sampel dapat dihitung dengan cara sebagai berikut: Kadar logam (mcg/g) 3.6.5.4 Uji Perolehan Kembali (Recovery Test) 3.6.5.4.1 Pembuatan Larutan Standar Larutan standar Kadmium (Cd) (1000 mcg/ml) dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan larutan kedalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO 3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides (konsentrasi 100 mcg/ml). Larutan standar Kadmium (Cd) (100 mcg/ml) dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan larutan kedalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO 3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides (konsentrasi 10 mcg/ml). 3.6.5.4.2 Prosedur Uji Perolehan Kembali (Recovery Test) Uji perolehan kembali dilakukan dengan cara menentukan kadar logam dalam sampel, selanjutnya dilakukan penentuan kadar logam dalam sampel setelah penambahan larutan standar yang jumlahnya diketahui dengan pasti.
Larutan standar yang ditambahkan yaitu 0,5 ml larutan standar Kadmium (Cd) (konsentrasi 10 mcg/ml). Uji perolehan kembali dilakukan terhadap sampel yang sama dan dianalisa dengan cara yang sama dengan pengerjaan sampel awal. Persen uji perolehan kembali dapat dihitung dengan persamaan berikut: = 3.6.5.5 Analisa Data Secara Statistik Untuk menentukan kadar logam di dalam sampel dengan interval kepercayaan 95%, α = 0,05, dk = n-1, dapat digunakan rumus: Kadar logam = μ = ( (α/2, dk) x SD / ) Keterangan : = Kadar rata-rata sampel SD = Standar deviasi dk = Derajat kebebasan (dk = n-1) α = interval kepercayaan n = jumlah pengulangan (Wibisono, 2005) Untuk menentukan standar deviasi dapat digunakan rumus: SD = (Sudjana, 2002) Untuk menentukan data diterima atau ditolak, dapat digunakan rumus: t hitung = Data diterima jika -t tabel t hitung t tabel Keterangan : Xi = Kadar Sampel n = jumlah pengulangan = Kadar rata-rata sampel (Sudjana, 2002)
3.6.5.6 Penentuan Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat diperoleh dari kalibrasi standar yang diukur sebanyak 6 sampai 10 kali, dan dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut (Harmita, 2004): Batas deteksi = Batas kuantitasi = Keterangan : SB = Simpangan Baku Simpangan Baku =
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Uji Kualitatif Untuk mengidentifikasi adanya logam berat di dalam kerang darah, maka dilakukan uji kualitatif dengan menggunakan pereaksi dithizon 0,005% b/v. Tabel 3. Hasil Uji Kualitatif Logam Kadmium (Cd) dengan Pereaksi Dithizon 0,005% b/v No Logam ph Reaksi dengan Larutan Dithizon Sampel Hasil KTP + KPA + 1 Cd 12 Merah Muda KPA 15 + KPJ + KPJ 15 + Keterangan : + :Mengandung Logam KTP :Kerang darah tanpa perebusan KPA :Kerang darah dengan perebusan dalam akuades selama 1 menit KPA 15 :Kerang darah dengan perebusan dalam akuades selama 15 menit KPJ :Kerang darah dengan perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit KPJ 15 :Kerang darah dengan Perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 15 menit Tabel diatas menunjukkan adanya logam berat Kadmium (Cd) yang terdapat di dalam kerang darah. Dimana dengan reaksi dithizon 0,005% b/v pada ph 12 menghasilkan warna merah muda. Warna yang terbentuk adalah karena terbentuknya kompleks logam dithizonat (Fries, 1997). 4.2 Hasil Uji Kuantitatif 4.2.1 Kurva Kalibrasi Logam Kadmium (Cd) Kurva kalibrasi logam Kadmium (Cd) dengan berbagai konsentrasi dapat dilihat pada gambar 2.
Absorbansi 0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Y = 0.3041X - 0.0047 Konsentrasi (mcg/ml) r = 0.9988 Gambar 2. Kurva Kalibrasi Logam Kadmium (Cd) Berdasarkan data kalibrasi logam Kadmium (Cd) pada gambar 2 diperoleh persamaan garis regresi yang linier yaitu: Y = 0,3041X - 0,0047 dengan nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9988 (data dapat dilihat pada lampiran 3). Contoh perhitungan persamaan regresi dapat dilihat pada lampiran 4. Nilai koefisien korelasi ini menunjukkan hubungan korelasi yang positif antara konsentrasi dengan absorbansi yang berarti dengan meningkatnya konsentrasi logam maka absorbansi juga meningkat (Rohman, 2007). 4.2.2 Analisa Kadar Logam Kadmium (Cd) dalam Kerang Darah Sebelum dan Sesudah Perebusan dalam Akuades dan Larutan Jeruk Nipis Selama 1 menit dan 15 menit Data hasil penetapan kadar logam Kadmium (Cd) dalam sampel, dapat dilihat pada tabel 4 dibawah ini. Konsentrasi logam Kadmium (Cd) dalam sampel ditentukan berdasarkan persamaan garis regresi linier kurva kalibrasi larutan standar Kadmium (Cd). Data dan perhitungan dapat dilihat pada lampiran 5 - lampiran 7.
Tabel 4. Data Kadar Logam Kadmium (Cd) Dalam Sampel No Logam Sampel Kadar Logam (mcg/g) KTP 2,2432 0,0060 KPA 2,0594 0,0449 1 Cd KPA 15 1,4967 0,0083 KPJ 0,9614 0,0143 KPJ 15 0,6678 0,0011 Keterangan : Data diatas rata-rata dari 6 kali pengulangan KTP :Kerang darah tanpa perebusan KPA :Kerang darah dengan perebusan dalam akuades selama 1 menit KPA 15 :Kerang darah dengan perebusan dalam akuades selama 15 menit KPJ :Kerang darah dengan perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit KPJ 15 :Kerang darah dengan perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 15 menit Dari data pada tabel 4 menunjukkan bahwa kadar rata-rata logam Kadmium (Cd) tanpa perebusan menggunakan akuades dan larutan jeruk nipis adalah 2,2432 0,0060 mcg/g. Nilai ini lebih besar daripada kadar logam Kadmium (Cd) setelah perebusan dalam akuades selama 1 menit (2,0594 0,0449 mcg/g) dan 15 menit (1,4967 0,0083 mcg/g). Begitu juga kadar logam Kadmium (Cd) akan semakin menurun setelah kerang darah direbus dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit (0,9614 0,0143 mcg/g) dan 15 menit (0,6678 0,0011 mcg/g). Menurut SNI 7387-2009, batas maksimum cemaran logam Kadmium (Cd) pada kerang (bivalvia) sebesar 1,0 mcg/g. Dengan demikian, kadar logam Kadmium (Cd) pada kerang darah tanpa perebusan telah melebihi ambang batas maksimum yang diperbolehkan. Dengan adanya perebusan selama 1 menit dan 15 menit dalam akuades, dapat menurunkan kadar logam Kadmium (Cd). Walaupun penurunan kadar logam Kadmium (Cd) dalam kerang darah tersebut masih belum efektif karena masih melebihi kadar maksimum yang diperbolehkan untuk kerangkerangan yaitu 1,0 mcg/g. Tetapi dengan diberikan perlakuan seperti merebusnya
dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit dan 15 menit, kadar logam Kadmium (Cd) menjadi lebih rendah dibawah kadar maksimum yang diperbolehkan. Sehingga larutan jeruk nipis ini efektif untuk menurunkan kadar logam Kadmium (Cd). Terjadinya penurunan kadar logam Kadmium (Cd) dalam kerang darah (Anadara granosa) setelah perebusan dengan akuades, disebabkan karena komponen metallothionine yang terdapat dalam daging kerang darah (Anadara granosa) mengalami degradasi (Nurjanah, dkk; 2005). Degradasi merupakan suatu pemecahan protein dari ikatan-ikatan yang terdapat di dalamnya. Salah satunya adalah Metallothionine, yang mempunyai kemampuan mengikat logamlogam yang dapat bersifat toksik seperti Kadmium (Anonim d, 2010). Terjadinya penurunan kadar logam Kadmium (Cd) dalam kerang darah (Anadara granosa) setelah perebusan dalam larutan jeruk nipis disebabkan karena dalam larutan jeruk nipis tersebut mengandung beberapa senyawa organik (seperti asam sitrat) yang memiliki kemampuan sebagai chelator (pengikat logam). Kadar logam Kadmium (Cd) akan terus menurun setelah kerang direbus dalam larutan jeruk nipis selama 15 menit. Hal ini disebabkan dengan direbus selama 15 menit, maka logam Kadmium (Cd) yang terdapat dalam kerang darah akan lebih banyak diikat oleh senyawa organik yang terdapat dalam jeruk nipis. Sehingga dapat dilihat bahwa kerang darah yang direbus dalam larutan jeruk nipis selama 15 menit kadarnya lebih rendah dibandingkan dengan kerang darah yang direbus dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit. Dengan demikian, salah satu cara yang dapat dilakukan oleh masyarakat untuk menurunkan kadar logam dari makanan yang berasal dari laut adalah
dengan cara di rebus dalam larutan jeruk nipis. Karena telah terbukti bahwa jeruk nipis dapat menurunkan kadar logam kadmium (Cd) yang terdapat dalam kerang darah. Dalam merebus kerang darah perlu juga diperhatikan alat yang digunakan. Karena jika alat yang digunakan untuk merebus terbuat dari bahan logam akan menyebabkan kadar logam Kadmium (Cd) dalam kerang darah akan bertambah bukan menurun. Alat yang digunakan untuk merebus kerang darah dalam penelitian ini adalah yang terbuat dari bahan kaca (beaker glass). Karena berdasarkan hasil orientasi dengan merebus kerang dengan alat yang terbuat dari logam (seperti panci berbahan logam), menyebabkan kadar logam Kadmium (Cd) pada kerang darah tersebut lebih besar daripada kadar tanpa perebusan. Hal ini dapat dilihat pada tabel 5. Tabel 5. Data kadar logam Kadmium (Cd) dengan perebusan menggunakan alat masak berbahan logam No Sampel Kadar rata-rata (mcg/g) 1 KTP 1,0879 2 KPA 15 menit 1,7627 3 KPJ 15 menit 1,9087 Dari tabel 5 tersebut, dapat dilihat bahwa kadar logam Kadmium (Cd) pada perebusan dalam larutan jeruk nipis lebih tinggi dibandingkan dengan perebusan dalam akuades dan tanpa perebusan. Hal ini disebabkan karena alat masak yang terbuat dari logam (panci, dsb) akan bereaksi kimia bila terkena asam cuka, asam jawa, asam jeruk, dan sebagainya (Silargan, 2009) serta logam Kadmium (Cd) dapat larut dan masuk kedalam makanan yang direbus menggunakan alat masak berbahan logam (Sartono, 2001). Sehingga kadar logam Kadmium pada kerang yang direbus dalam larutan jeruk nipis menggunakan alat masak yang berbahan
logam lebih tinggi daripada kerang dengan perebusan dalam akuades dan tanpa perebusan. 4.2.3 Uji Perolehan Kembali (Recovery Test) Hasil uji perolehan kembali logam Kadmium (Cd) dalam kerang darah setelah penambahan larutan standar kadmium (Cd) dapat dilhat pada lampiran 8. Contoh perhitungan persen uji perolehan kembali logam dalam sampel dapat dilihat pada lampiran 9. Persen uji perolehan kembali (recovery test) Kadmium (Cd) dalam kerang darah dapat dilihat pada tabel 6. Tabel 6. Persen Uji Perolehan Kembali (recovery test) Logam Kadmium (Cd) Dalam Kerang Darah. No Logam yang dianalisa Recovery rata-rata (%) 1 Cd 117, 11% Berdasarkan tabel diatas, dapat dilihat bahwa rata-rata hasil uji perolehan kembali untuk logam Kadmium (Cd) adalah 117,11%. Persen recovery tersebut menunjukkan ketepatan kerja pada saat pemeriksaan kadar logam dalam sampel. Menurut Miller (2005), suatu metode dikatakan teliti jika nilai recoverynya antara 80-120%. 4.2.4 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Dari hasil perhitungan diperoleh batas deteksi (LOD) untuk Kadmium (Cd) adalah 0,0306 mcg/ml. Sedangkan batas kuantitasinya (LOQ) sebesar 0,1019 mcg/ml. Perhitungan LOD dan LOQ dapat dilihat pada lampiran 10.
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian diperoleh kadar logam Kadmium (Cd) dalam kerang darah (Anadara granosa) tanpa perebusan sebesar 2,2432 0,0060 mcg/g. Kadar logam Kadmium (Cd) setelah perebusan dalam akuades selama 1 menit mengalami penurunan dari 2,2432 0,0060 mcg/g menjadi 2,0594 0,0449 mcg/g, begitu juga dengan yang direbus selama 15 menit mengalami penurunan dari 2,2432 0,0060 mcg/g menjadi 1,4967 0,0083 mcg/g. Kadar logam Kadmium (Cd) setelah perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit mengalami penurunan dari 2,2432 0,0060 mcg/g menjadi 0,9614 0,0143 mcg/g dan direbus selama 15 menit mengalami penurunan dari 2,2432 0,0060 mcg/g menjadi 0,6678 0,0011 mcg/g. Adanya perbedaan waktu perebusan pada kerang darah memberikan pengaruh yang berbeda terhadap penurunan kadar logam Kadmium (Cd). Setelah perebusan dalam akuades selama 1 menit dan 15 menit terjadi penurunan berturutturut sebesar 8,83% dan 33,23%. Perebusan dalam larutan jeruk nipis selama 1 menit dan 15 menit terjadi penurunan berturut-turut sebesar 55,95% dan 69,97%. 5.2 Saran Disarankan agar dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap penurunan kadar logam Kadmium (Cd) dengan variasi konsentrasi larutan jeruk nipis dan variasi waktu.
Disarankan agar dilakukan penelitian terhadap penurunan kadar logam Kadmium (Cd) dengan perebusan menggunakan asam-asam lain yang mengandung senyawa organik seperti asam jawa, asam cuka, dan sebagainya.