17 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Percobaan Penelitian dilaksanakan dari Februari 2011 sampai Januari 2012 di Laboratorium Kultur Jaringan 1, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian IPB. Eksplan (embrio muda) yang digunakan untuk penelitian diperoleh dari hasil pertanaman genotipe mutan di Kebun Percobaan Leuwikopo, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, IPB Darmaga Bogor. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan sebagai eksplan adalah embrio muda yang diambil dari dua genotipe mutan jagung generasi ke-7 (G3M7 dan G8M7), yang diperoleh dari pertanaman G3M6 dan G8M6 kemudian dilakukan penyerbukan sendiri. Eksplan (embrio muda) dalam penelitian ditentukan berdasarkan ukuran embrio dan tidak berdasarkan umur selfing (penyerbukan sendiri), hal ini disebabkan oleh penanaman jagung yang dilakukan di lapang. Penanaman di lapang mempengaruhi keberhasilan penyerbukan sendiri karena pembuahan di hari yang sama sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Eksplan embrio muda jagung pada genotipe G8M7 dengan panjang 0.3 cm diperoleh dari embrio yang berumur 12 hari setelah selfing (HSS), sedangkan embrio muda dengan panjang 0.4 cm diperoleh dari embrio yang berumur 13 HSS. Eksplan embrio muda jagung genotipe G3M7 dengan panjang embrio 0.3 cm diperoleh dari embrio berumur 12-13 HSS, sedangkan eksplan dengan panjang 0.4 cm berasal dari embrio berumur 14 HSS (Lampiran 4). Bahan yang digunakan untuk pembuatan media meliputi larutan stok makro dan mikro dari media dasar Chu (N6), dan Murashige dan Skoog (MS), zat pengatur tumbuh 2.4-D (2.4-Dichlorophenoxy Acetic Acid) dan picloram, sukrosa (gula pasir), asam amino L-arginin, L-glutamine, dan glycine serta D-mannitol. Media regenerasi menggunakan ZPT BAP (Benzyl Amino Purin) dan IAA (Indole Acetic Acid). Bahan-bahan lain yang digunakan adalah bahan untuk sterilisasi eksplan yaitu clorox, aquades steril, alkohol 70 % dan 96 %.
18 Alat-alat yang digunakan spiritus, korek api, bunsen, plastik penutup, karet gelang, plastik wrap, tissue, sudip, autoclave, botol kultur, oven, Laminar Air Flow (LAF), erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, petridish, botol kultur, pipet hisap, labu ukur, corong, timbangan analitik, kompor, tabung gas, alat diseksi (scalpel dan mata pisau, pinset, gunting), mikroskop diseksi, alat tulis, hand sprayer, kertas ph, kertas millimeter blok, masker, dan rak kultur. Metode Percobaan Percobaan 1 Penelitian menggunakan percobaan faktorial yang disusun secara acak kelompok. Pengelompokan berdasarkan hari tanam, karena hari tanam yang berbeda dengan eksplan yang sama menyebabkan kesegaran eksplan berbeda akibat adanya penyimpanan. Percobaan pertama terdiri atas 3 faktor. Faktor pertama yaitu genotipe, terdiri atas 2 genotipe mutan jagung generasi ketujuh (G3M7 dan G8M7). Faktor kedua adalah panjang embrio, yaitu 0.3 cm dan 0.4 cm. Faktor ketiga adalah 6 komposisi media kultur. Semua kombinasi perlakuan ditanam dalam 10 kelompok, sehingga terdapat 240 satuan percobaan (botol kultur). Setiap botol kultur ditanam 5 eksplan sebagai satuan amatan. Berikut adalah penjabaran komposisi media yang digunakan. N6A : garam Chu (N6) + vitamin B5 + 100 mg/l myoinositol + 2 ppm 2.4-D N6C : garam Chu (N6) + vitamin B5 + 100 mg/l myoinositol + 3 ppm 2.4-D N6F : garam Chu (N6) + vitamin B5 + 100 mg/l myoinositol + 6 ppm 2.4-D MS6 : MS + vitamin B5 + 6 ppm 2.4-D MS8 : MS + vitamin B5 + 2 ppm 2.4-D + 100 mg/l arginin + 2 mg/l glycine + 100 mg/l glutamin MS9 : MS + vitamin B5 + 1 ppm 2.4-D + 1 % mannitol Semua media dasar diberi tambahan gula pasir 3 % (30 g/l). Komposisi media MS dan Chu (N6) disajikan pada Lampiran 2 dan Lampiran 3. Model linier yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ijkl = µ + α i + β j + (αβ) ij + γ k + (αγ) ik + (βγ) jk + (αβγ) ijk + l + ε ijkl ;
19 Y ijkl = Nilai pengamatan pada faktor genotipe taraf ke-i, faktor ukuran eksplan taraf ke-j, faktor media ke-k, dan kelompok ke-l. µ = nilai tengah umum α i β j = Pengaruh taraf ke-i dari genotipe = Pengaruh taraf ke-j dari ukuran eksplan (αβ) ij = Pengaruh interaksi taraf ke-i dari genotipe dan taraf ke-j dari ukuran eksplan γ k = Pengaruh media ke-k (αγ) ik = Pengaruh interaksi taraf ke-i dari genotipe dan media ke-k (βγ) jk = Pengaruh interaksi taraf ke-j dari ukuran eksplan dan media ke-k (αβγ) ijk = Pengaruh interaksi taraf ke-i dari genotipe, taraf ke-j dari ukuran eksplan dan taraf ke-k dari media l ε ijkl = Pengaruh kelompok ke-l = Galat percobaan taraf ke-i dari genotipe, taraf ke-j dari ukuran eksplan, media ke-k, dan kelompok ke-l Data dianalisis menggunakan Uji Ragam dengan prosedur General Linier Model. Perlakuan yang berpengaruh nyata, diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) di antara perlakuan pada taraf 5% untuk mengetahui beda nilai tengah. Percobaan 2 Rancangan percobaan yang digunakan pada percobaan dua adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan satu faktor yaitu 3 kombinasi media. Tiap kombinasi diulang 10 kali, sehingga terdapat 30 satuan percobaan. Eksplan yang digunakan adalah genotipe G8M7. Berikut adalah penjabaran 3 komposisi media yang digunakan: P2M : MS + vitamin B5 + 2 ppm Picloram P2N : N6 + vitamin B5 + 2 ppm Picloram MS2 : MS + vitamin B5 + 2 ppm 2.4-D Model linier yang digunakan adalah sebagai berikut (Gomez dan Gomez, 1995): Y ij = µ + α i + j + ε ij ;
20 Y ij = Nilai pengamatan yang dihasilkan µ = nilai tengah umum α i j ε ij = Pengaruh media ke-i = Pengaruh kelompok ke-j = Galat percobaan Analisis data dilakukan menggunakan Uji Ragam dengan prosedur General Linier Model. Jika hasil analisis ragam yang diperoleh menunjukkan perlakuan berpengaruh nyata, maka dilakukan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT) di antara perlakuan pada taraf 5% untuk mengetahui beda nilai tengah. Pelaksanaan Percobaan Penanaman Bahan Eksplan Penelitian Bahan tanaman di lapang untuk menghasilkan embrio muda (generasi ke- 7) adalah mutan generasi ke-6 hasil radiasi sinar gamma pada dua galur yaitu G8 (SgPD/660/15) dan G3 (Gw92D343L4DMR PC3S4-56) yang telah diseleksi dan dimurnikan. Pengolahan lahan dilakukan dengan mencangkul, menggemburkan tanah, serta pemberian pupuk kandang. Biji setiap individu ditanam dalam barisan. Jarak tanam yang digunakan adalah 75 cm x 25 cm dengan 1 biji per lubang, terdapat 20 tanaman untuk tiap genotipe. Lubang tanam yang digunakan sedalam 5 cm dan telah ditaburi furadan. Penanaman dilakukan tiap minggu, dengan jumlah yang ditanam tiap minggu adalah 2 tanaman untuk masing-masing genotipe. Hal ini bertujuan untuk mengatur waktu antara panen di lapang dan penanaman embrio muda di kultur jaringan, sehingga dapat mengurangi waktu penyimpanan eksplan. Dosis pupuk yang digunakan untuk budidaya tanaman jagung yaitu urea 300 kg/ha, SP-18 200 kg/ha, dan KCl 150 kg/ha. Pupuk urea setengah dosis dan dosis penuh SP-18 dan KCl diaplikasikan bersamaan pada saat tanam. Setengah dosis urea sisanya diaplikasikan 4 minggu setelah tanam (MST). Penyulaman dilakukan saat 1 MST. Pemeliharaan berupa pengendalian gulma pada umur 3 dan 6 MST, pembumbunan pada 6 MST, pengendalian hama dan penyakit pada umur 4 dan 8 MST. Penyungkupan tassel dilakukan pada 50 HST. Sementara
21 penyungkupan bunga betina (tongkol) 1-3 hari setelah antesis bunga jantan. Sebelum penyungkupan tongkol, ujung tongkol dipotong. Setelah muncul rambut jagung (silk) yang merupakan tangkai putik maka penyerbukan sendiri dapat dilakukan. Panen jagung untuk mengambil embrio mudanya dilakukan pada 12-14 hari setelah selfing (HSS), yaitu saat warna jagung putih ke kuningan dan ukuran bijinya ± 0.5 cm dan ukuran embrio 0.3-0.4 cm. Sterilisasi Alat dan Botol Sebelum alat dan botol digunakan, terlebih dahulu semuanya dicuci bersih dengan sabun cuci atau detergen kemudian disterilkan dalam autoklaf selama 45 menit dengan tekanan 20 psi. Pembuatan Media Kultur Pembuatan media dasar MS dan N6 dilakukan dengan memipet media stok sesuai dengan volume pipet pada protokol yang telah ada. Setelah itu, ditambahkan 30 g gula pasir yang telah dilarutkan dalam aquades dan dimasukkan dan ditera dalam labu takar 1 liter. Kemasaman (ph) media di atur sebesar 5.7-5.8 sebelum di autoklaf, dengan penambahan beberapa tetes KOH 0.1 N atau HCl 0.1 N ke dalam media, kemudian ditambahkan agar sebanyak 6 g. Lalu media dipanaskan sampai agar-agar larut (sambil diaduk). Selanjutnya larutan media ditakar dan dimasukkan ke dalam botol yang sudah disterilkan sebelumnya sebanyak 20 ml setiap botol. Setelah itu botol ditutup dengan plastik, diikat dengan karet dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit dengan suhu 121 o C pada tekanan 17-18 psi. Setelah diautoklaf media disimpan dahulu selama 3-7 hari di ruang kultur. Media yang tidak terkontaminasi dipergunakan untuk inisiasi kultur. Sterilisasi Sumber Eksplan dan Penanaman in vitro Eksplan yang digunakan berupa embrio muda (immature embrio) yang dipanen 12-14 hari setelah selfing. Sebelum embrio dikeluarkan dari biji, semua biji jagung yang masih melekat pada tongkolnya (tanpa klobot) dicuci kemudian disterilisasi permukaannya dulu dengan larutan alkohol 96 % selama 10 menit lalu
22 dibilas satu kali. Setelah itu, direndam sambil dikocok dalam chlorox 20 % (v/v), masing-masing selama 10 menit. Selanjutnya biji dibilas dengan aquades steril sebanyak tiga kali. Embrio dikeluarkan dengan memotong bagian endosperma biji satu persatu, seperti pada Gambar 5. Embrio yang sudah diambil kemudian ditanam di dalam botol kultur dengan posisi aksis tunas dan akar menempel pada permukaan media. a b Gambar 5. Proses Pengambilan Embrio Jagung (a) Arah Pemotongan Kernel; (b) Pengeluaran Embrio dari Kernel Penanaman dilakukan di dalam LAF dan tiap botol kultur ditanam 5 buah eksplan. Selanjutnya botol kultur ditutup dengan plastik dan diikat dengan karet. Kemudian semua botol yang telah berisi eksplan ditempatkan dalam ruang gelap selama 2-4 minggu tergantung perkembangan embrio. Suhu ruang dijaga agar stabil 28 o C. Setelah masa inkubasi, koleoptil yang tumbuh di ujung kalus dipotong dan dibuang. Selanjutnya kalus dikulturkan kembali pada media pendewasaan (MS9= MS + 1 ppm 2.4-D + 1 % mannitol) selama 2 minggu di ruang terang dengan suhu 21-25 o C. Setelah masa pendewasaan embrio diregenerasikan pada media regenerasi. Pengamatan Pengamatan dilakukan selama 8 minggu. Pengamatan dilakukan pada seluruh eksplan. Adapun peubah-peubah yang diamati adalah:
23 a. Persentase eksplan mati dan terkontaminasi, serta penyebab kontaminasi. b. Hari pembentukan kalus yaitu dihitung berdasarkan hari setelah tanam (HST). c. Respon eksplan pada 7 hari setelah tanam (HST) berupa persentase eksplan yang mengalami pemanjangan koleoptil (K), pembentukan akar (A): pembentukan kalus lembut (soft callus) (Kl), dan kalus kompak (callus compact) (Kk) (Gambar 5). d. Morfologi kalus lembut, kalus kompak, dan kalus tipe I yaitu kalus yang kompak dan embriogenik (Gambar 6). K A Kk a b K Kl c d Gambar 6. Respon Perkembangan Eksplan (Embrio Muda) Jagung Umur 1 MST terdiri atas Pemanjangan Koleoptil (K); a) Pembentukan Kalus Kompak (Kk); b) Pembentukan Akar (A); c) Pembentukan Kalus Lembut (Kl); dan d) Kalus Embriogenik Tipe I Umur 3 MST e. Persentase eksplan membentuk kalus. Persentase kalus = f. Persentase kalus embriogenik. Persentase kalus embriogenik = embrio muda berkalus embrio muda yang ditanam 100% g. Pengamatan mikroskopik kalus/ kalus embriogenik. h. Diameter kalus diukur pada 2 MST. kalus embriogenik kalus yang ditanam 100%
24 i. Bobot kalus diukur pada 2-3 MST. j. Pengamatan warna kalus. Pengamatan warna kalus dikelompokkan ke dalam 4 kategori (Gambar 7). Kategori warna kalus didasarkan pada keberagaman kalus dari embrio muda yang diinduksi. Opaque merupakan istilah yang digunakan untuk menunjukkan kalus yang memiliki warna kekuningan dengan dominan putih (tidak transparan). Kalus ada yang berbentuk bulat tanpa nodul dan bulat bernodul. Translucent merupakan istilah yang digunakan untuk menunjukkan kalus yang berwarna kuning dan bening atau transparan. D Hijau A Opaque B Translucent C Coklat Gambar 7. Kualifikasi Warna Kalus yang Terbentuk pada Induksi Kalus dari Dua Genotipe Mutan Jagung (Keterangan: didasarkan pada keragaan kalus penelitian) k. Persentase eksplan membentuk organ tunas dan akar. l. Jumlah planlet yang berhasil diregenerasikan dari kalus embriogenik