BAHAN DAN METODE. Tempat dan Waktu. Bahan dan Alat. Metode Penelitian

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Watu Penelitian dilasanaan di laboratorium ultur jaringan Departemen Agronomi dan Hortiultura IPB Darmaga. Penelitian berlangsung dari bulan April sampai dengan September Bahan dan Alat Bahan yang digunaan dalam penelitian meliputi beberapa jenis media yaitu media MS (Murashige and Soog), media B5 (Gamborg B5), dan media WPM (Woody Plant Medium). Zat pengatur tumbuh yang digunaan meliputi jenis ausin (2.4 D, picloram, dan NAA) dan jenis sitoinin berupa BAP. Sumber esplan menggunaan melon H7 olesi Pusat Kajian Buah-Buahan Tropia Institut Pertanian Bogor. Esplan yang digunaan berupa biji muda yang berasal dari buah berumur 15 hari setelah penyerbuan dan hipootil yang berasal dari biji tua yang telah diecambahan. Bahan lain yang digunaan meliputi agar, gula, baterisida, fungisida, aquades steril, aret, plasti, alohol 70%, alohol 96%, lorox, betadin dan deterjen. Alat yang digunaan adalah autoclave, botol ultur, gelas piala, erlemeyer, timbangan, cawan petri, gelas uur, corong plasti, ph meter, laminar air flow cabinet, pinset, gunting, scalpel, lampu spirtus, botol sprayer, dan ra ultur. Metode Penelitian Penelitian dilasanaan dengan 2 percobaan. Masing-masing percobaan dilauan terpisah. Percobaan I Penelitian dilasanaan dengan menggunaan Rancangan fatorial yang disusun dalam Rancangan Aca Kelompo (RAK). Penelitian terdiri dari dua fator yaitu fator pertama media tanam terdiri dari tiga taraf yaitu MS, WPM, dan B5. Konsentrasi picloram sebagai fator edua terdiri dari empat taraf yaitu 0, 0.5, 1.0, 1.5 mg/l. Percobaan dilauan dengan 3 ulangan dan setiap ulangan

2 15 terdapat 5 botol. Setiap botol terdapat 5 esplan. Penanaman dilauan selama 3 hari. Kombinasi media dan picloram yang digunaan adalah sebagai beriut: Tabel 1. Kombinasi Media dan Konsentrasi Picloram Media Konsentrasi Picloram (mg/l) MS M1 M2 M3 M4 B5 B1 B2 B3 B4 WPM W1 W2 W3 W4 Model rancangan percobaan yang digunaan dalam penelitian adalah Yij i j ( αβ ) + δ ε ij = μ + α + β + + ij i = perlauan media tanam j = perlauan taraf onsentrasi picloram = 1, 2, 3 (ulangan) Dimana : = respon perlauan = nilai tengah = pengaruh perlauan media tanam = pengaruh perlauan taraf onsentrasi picloram ( αβ ) ij = interasi antara dua fator perlauan δ = pengaruh ulangan e- = pengaruh galat percobaan Data hasil pengamatan dianalisis dengan uji-f. Jia uji-f nyata dilanjutan dengan uji DMRT pada taraf 5%. Percobaan II Penelitian dilasanaan dengan menggunaan Rancangan fatorial yang disusun dalam Rancangan Aca Kelompo (RAK). Penelitian terdiri dari dua fator yaitu fator pertama taraf onsentrasi ausin (2.4 D dan NAA) masingmasing terdiri dari enam taraf yaitu 0, 1, 2, 3, 4, 5 mg/l. Konsentrasi BAP sebagai fator edua terdiri dari dua taraf yaitu 0 dan 0.1 mg/l. Percobaan dilauan

3 16 dengan 3 ulangan dan setiap ulangan terdapat 3 botol. Setiap botol terdapat 5 esplan. Penanaman dilauan selama 3 hari. Kombinasi perlauan adalah sebagai beriut: Tabel 2. Kombinasi Ausin (2.4 D dan NAA) dan BAP Ausin (mg/l) BAP (mg/l) Tanpa ausin 0 A0B0 A0B1 2.4 D 1 A1B0 A1B1 2 A2B0 A2B1 3 A3B0 A3B1 4 A4B0 A4B1 5 A5B0 A5B1 NAA 1 A6B0 A6B1 2 A7B0 A7B1 3 A8B0 A8B1 4 A9B0 A9B1 5 A10B0 A10B1 Model rancangan percobaan yang digunaan dalam penelitian adalah Yij i j ( αβ ) + δ ε ij = μ + α + β + + ij i = perlauan taraf onsentrasi 2.4 D dan NAA j = perlauan taraf onsentrasi BAP = 1, 2, 3 (ulangan) Dimana : = respon perlauan = nilai tengah = pengaruh perlauan taraf onsentrasi 2.4 D dan NAA = pengaruh perlauan taraf onsentrasi BAP ( αβ ) ij = interasi antara dua fator perlauan δ = pengaruh ulangan e- = pengaruh galat percobaan Data hasil pengamatan dianalisis dengan uji-f. Jia uji-f nyata dilanjutan dengan uji DMRT pada taraf 5%.

4 17 Pelasanaan Penelitian Sterilisasi Alat Alat yang digunaan dalam penelitian berupa botol ultur, pinset, scalpel, cawan petri, dan pisau. Alat dicuci menggunaan sabun sampai bersih lalu dieringan. Setelah itu alat diautolaf pada suhu C dengan teanan 1.1 gcm 2 selama 1 jam. Pembuatan Larutan Sto Pembuatan larutan sto bertujuan untu memudahan dalam pembuatan media. Larutan sto dibuat berdasaran omposisi pada masing-masing media. Komposisi media MS (lampiran 1), Woody Plant Medium (WPM) (lampiran 2), dan media B5 (lampiran 3). Pembuatan larutan sto selain Fe dimulai dengan penimbangan bahan imia sesuai dengan bobot per liter larutan sto yang aan dibuat. Setelah itu bahan imia dilarutan dengan aquades steril sampai larut. Setelah larut, larutan dimasuan e dalam labu taar lalu ditera sampai tanda tera. Sedangan pembuatan larutan sto Fe dimulai dengan penimbangan lalu FeSO 4.7H 2 O dan Na 2 EDTA dilarutan masing-masing dengan aquades steril. Setelah larut, Na 2 EDTA dipanasan di atas panci yang berisi air sampai berubah warna menjadi uning dan semua bahan larut. Setelah berubah warna, larutan FeSO 4.7H 2 O dimasuan e dalam larutan Na 2 EDTA sampai tercampur. Pemanasan hanya dilauan sampai terjadi perubahan warna menjadi uning namun tida sampai mendidih. Penyimpanan larutan sto dimasuan e dalam botol reagen dan disimpan pada suhu amar atau suhu ruang ultur. Pembuatan larutan sto zat pengatur tumbuh tergantung dari sifat zat pengatur tumbuh tersebut. Golongan ausin (picloram, 2.4 D dan NAA) merupaan zat pengatur tumbuh yang memilii sifat asam sehingga perlu dilarutan terlebih dahulu dengan KOH atau NaOH 1 N. Sedangan sitoinin (BAP) memilii sifat basa sehingga perlu ditambahan HCl untu melarutannya. Pembuatan larutan sto zat pengatur tumbuh tergantung dari onsentrasi yang aan dibuat. Setelah bahan imia ditimbang ditambahan KOH atau HCl beberapa tetes untu melarutan. Setelah larut, larutan dimasuan e dalam labu taar dan

5 18 ditera dengan aquades steril sampai tanda tera. Penyimpanan larutan sto zat pengatur tumbuh disimpan di dalam lemari es untu menjaga agar tida rusa. Pembuatan Media Pembuatan media dilauan dengan mengambil larutan dari setiap larutan sto media yang telah dibuat sesuai dengan volume yang diambil. Setelah semua larutan dimasuan e dalam labu taar ditambahan gula yang telah dilarutan dengan onsentrasi 30 g/l. Lalu ditera sampai tanda tera dengan aquades. Setelah itu dilauan penguuran ph dengan ertas ph indiator sampai ph media 6. Larutan media yang telah diuur ph dimasuan edalam panci lalu ditambahan agar dengan onsentrasi 7 g/l dan dimasa sampai mendidih agar semua bahan tercampur. Larutan media lalu dimasuan e dalam botol ultur seitar 25 ml per botol. Lalu botol ditutup dengan plasti dan diiat dengan aret gelang. Semua media diautolaf pada suhu C, teanan 1.1 gcm 2 selama menit. Media yang telah dibuat disimpan didalam ruang ultur. Penanaman Percobaan I Bahan tanam yang digunaan dalam percobaan I yaitu biji muda melon hibrida H7 olesi Pusat Kajian Buah-Buahan Tropia IPB. Biji berasal dari buah muda berumur 15 hari setelah penyerbuan. Buah (Gambar 4A) dicuci bersih dengan siat dibawah air mengalir lalu direndam dengan larutan fungisida dan baterisida dengan onsentrasi masing-masing 2 g/l selama 12 jam. Buah dibilas dengan air steril lalu direndam dengan larutan lorox 25% selama 20 menit. Buah dibilas dengan air steril lalu dibelah dan dipisahan biji dari daging buah. Biji (Gambar 4B) disterilisasi dengan lorox 10% selama 15 menit. Biji dibilas dengan air steril sebanya dua ali yang dicampur dengan 5 tetes betadin pada bilasan terahir. Setelah itu biji ditanam dalam media ultur. Biji yang telah ditanam disimpam dalam ruang gelap dengan suhu 20 0 C. Pengamatan dilauan 4 hari seali agar tida tertinggal fase perembangan embrio dari globular, hati, torpedo dan otiledon.

6 19 A B Gambar 4. (A) Buah Muda Berumur ±15 Hari Setelah Penyerbuan. (B) Biji Muda yang Telah Dibersihan Penanaman Percobaan II Bahan tanam yang digunaan dalam percobaan II yaitu biji tua yang berasal dari melon hibrida H7 olesi Pusat Kajian Buah-Buahan Tropia IPB. Sumber esplan yang digunaan yaitu hipootil yang berasal dari biji yang diecambahan secara in vitro. Biji melon direndam dengan air steril selama 12 jam. Biji yang telah direndam dimasuan edalam larutan lorox 10% selama 10 menit lalu dibilas 2 ali menggunaan air steril. Setelah itu biji direndam dengan larutan lorox 5% selama 5 menit dan dibilas dengan air steril sebanya 2 ali. Lalu biji melon diecambahan dengan media MS selama 15 hari di dalam ruang gelap. Biji yang telah berecambah (Gambar 5), hipootil dipotong sepanjang ±1 cm lalu ditanam di dalam media perlauan. Hipootil yang telah ditanam disimpan dalam ruang gelap dengan suhu 20 0 C dan dilauan pengamatan 3 hari seali. Gambar 5. Biji yang Berecambah Setelah Berumur 15 HST (Hari Setelah Tanam)

7 20 Pengamatan Metode pengamatan yang dilauan yaitu pengamatan langsung terhadap ultur. Fator-fator yang diamati dalam penelitian meliputi: 1. Persentase ultur yang ontaminasi 2. Persentase ultur yang membentu embrio somati 3. Persentase ultur yang membentu alus 4. Watu munculnya embrio somati 5. Persentase ultur beraar dan bertunas Pengamatan dilauan terhadap semua esplan. Esplan diamati satu per satu dan dicatat sesuai dengan respon yang muncul. Data setiap perlauan diperoleh dari data rata-rata tiap botol. Rata-rata tiap botol diperoleh dengan cara membagi esplan yang memberian respon dengan jumlah total esplan per botol. Data setiap ulangan diperoleh dengan menambahan hasil rata-rata tiap botol dibagi dengan jumlah total botol tiap ulangan. Jia terdapat botol hilang disebaban ontaminasi ataupun hal lain maa data ulangan diperoleh dengan menambahan hasil rata-rata tiap botol dibagi dengan jumlah botol yang masih ada. Hasil semua data disajian dalam persentase.