METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Anggrek, Kebun Raya Bogor. Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2010 hingga Juni 2011. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tunas in vitro anggrek Phalaenopsis gigantea berumur 5 tahun dengan 4-5 daun dari Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman, Kebun Raya Bogor. Eksplan yang digunakan adalah eksplan daun dan pangkal batang. Eksplan daun P. gigantea (Tahap 1) ditanam dalam media dasar Murashige and Skoog dengan konsentrasi 50% (½ MS) ditambah gula (20 g/l), pepton (2 g/l), gelrite (2 g/l), dan kombinasi BAP dan NAA sebagai perlakuan. Eksplan daun P. gigantea (Tahap 2) ditanam dalam media dasar Murashige and Skoog dengan konsentrasi 50% (½ MS) ditambah gula (20 g/l), gelrite (2 g/l), dan BAP atau Thidiazuron (TDZ) sebagai perlakuan. Eksplan pangkal batang P. gigantea (Tahap 1) ditanam dalam media Knudson C (KC) ditambah gula (20 g/l), gelrite (2 g/l), arang aktif (2 g/l) dan bahan organik yaitu air kelapa (150 ml/l), taoge (30 g/l), ubi (30 g/l), dan pisang (30 g/l). Eksplan pangkal batang P. gigantea (Tahap 2) ditanam dalam media Murashige and Skoog dengan konsentrasi 50% (½ MS) ditambah gula (20 g/l), pepton (2 g/l), gelrite (2 g/l) dan kitosan. Bahan-bahan lain yang digunakan air destilata, betadine, alkohol 70% dan alkohol 95%. Alat yang digunakan adalah autoklaf, kompor gas, timbangan analitik, Laminar Air Flow Cabinet (LAF), botol kultur, petridish, pinset, pisau scapel, kertas tissue, lampu spirtus, labu ukur, gelas ukur, Erlenmeyer, dan label. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari empat percobaan, yaitu percobaan kultur daun dan pangkal batang P. gigantea masing-masing dua tahap. Alur percobaan dapat dilihat pada gambar 3.
16 Stok Kultur Tunas P. gigantea Media Hyponex Tahap 1 Kultur Daun Kultur Pangkal Batang Media: ½ MS + NAA + BAP Media: KC + kombinasi bahan organik Tahap 2 Kultur Daun Kultur Pangkal Batang Media: ½ MS+ BAP atau TDZ Media: ½ MS + Kitosan Gambar 3. Alur Percobaaan Kultur Daun Phalaenopsis gigantea (Tahap I) Percobaan kultur daun P. gigantea menggunakan sembilan taraf perlakuan yaitu media ditambah kombinasi zat pengatur tumbuh NAA dengan BAP. Eksplan yang digunakan adalah daun P. gigantea. Setiap perlakuan terdiri dari tiga ulangan, dengan tiap ulangan terdiri dari 10 botol kultur dan setiap botol ditanami satu eksplan. Adapun kombinasi media yang digunakan dalam percobaan kultur daun adalah: G1 = ½ MS G2 = ½ MS + 0,01 mg/l NAA G3 = ½ MS + 0,02 mg/l NAA G4 = ½ MS + 1 mg/l BAP
17 G5 G6 G7 G8 G9 = ½ MS + 1 mg/l BAP + 0,01 mg/l NAA = ½ MS + 1 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA = ½ MS + 2 mg/l BAP = ½ MS + 2 mg/l BAP + 0,01 mg/l NAA = ½ MS + 2 mg/l BAP + 0,02 mg/l NAA Kultur Pangkal Batang Phalaenopsis gigantea (Tahap 1) Percobaan ini terdiri atas empat taraf perlakuan yaitu kombinasi media dengan ditambah bahan organik. Eksplan yang digunakan pangkal batang P. gigantea. Setiap perlakukan terdiri dari tiga ulangan, dengan setiap ulangan terdiri dari 10 botol kultur dan setiap botol ditanami satu eksplan. Adapun kombinasi media yang digunakan dalam percobaan kultur pangkal batang adalah: G10 = Knudson C + Air Kelapa + Ekstrak Taoge G11 = Knudson C + Air Kelapa + Ekstrak Taoge dan Ubi G12 = Knudson C + Air Kelapa + Ekstrak Taoge dan Pisang G13 = Knudson C + Air Kelapa + Ekstrak Taoge, Ubi, dan Pisang. Kultur Daun Phalaenopsis gigantea (Tahap II) Percobaan kultur daun P. gigantea menggunakan tujuh taraf perlakuan yaitu media ditambah zat pengatur tumbuh BAP atau Thydiazuron (TDZ). Eksplan yang digunakan adalah daun P. gigantea. Setiap perlakuan terdiri dari tiga ulangan, dengan tiap ulangan terdiri dari lima botol kultur dan setiap botol ditanami satu eksplan. Adapun kombinasi media yang digunakan dalam percobaan kultur daun adalah: A1 = ½ MS A2 = ½ MS + 0,5 mg/l BAP A3 = ½ MS + 1 mg/l BAP A4 = ½ MS + 2 mg/l BAP A5 = ½ MS + 0,1 mg/l TDZ A6 = ½ MS + 0,2 mg/l TDZ A7 = ½ MS + 0,3 mg/l TDZ
18 Kultur Pangkal Batang Phalaenopsis gigantea (Tahap II) Percobaan ini terdiri atas lima taraf perlakuan yaitu kombinasi media dengan ditambah kitosan. Eksplan yang digunakan tunas P. gigantea. Setiap perlakuan terdiri dari tujuh ulangan, dengan setiap ulangan terdiri dari satu botol kultur dan setiap botol ditanami satu eksplan. Adapun kombinasi media yang digunakan dalam percobaan kultur pangkal batang adalah: A10 = ½ MS A11 = ½ MS + 5 ppm kitosan A12 = ½ MS + 10 ppm kitosan A13 = ½ MS + 15 ppm kitosan A14 = ½ MS + 20 ppm kitosan Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi Botol dan Alat Tanam Alat-alat yang digunakan dalam penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilisasikan dengan menggunakan autoklaf. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal sebelum dimasukan ke dalam autoklaf. Temperatur yang digunakan untuk sterilisasi adalah 121 o C pada tekanan 17,5 psi selama satu jam. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat disterilkan dengan dicelupkan dalam alkohol 95% dan dibakar. Media dan aquades juga disterilkan dalam autoklaf. Sterilisasi Lingkungan Kerja Lampu ultraviolet pada LAF cabinet dinyalakan selama 30-60 menit, agar kontaminan pada laminar dapat hilang. Sebelum memulai kerja, permukaan LAF cabinet dilap dengan menggunakan tisu yang telah disemprotkan alkohol 70%. Setelah melakukan kerja, permukaan LAF cabinet dibersihkan kembali dengan alkohol 70% atau dengan lampu ultra violet selama 30-60 menit.
19 Pembuatan Media Media yang digunakan dalam percobaan kultur daun P. gigantea (Tahap I) adalah media dasar ½ MS (Lampiran 1). Pembuatan media dilakukan dengan pemipetan stok media MS lengkap masing-masing 25 ml, kecuali vitamin 50 ml. Kemudian ditambah gula 20 g/l, pepton 2 g/l, gelrite 2 g/l, aquades, dan ditambah kombinasi NAA dan BAP untuk perlakuan kultur daun P. gigantea. Percobaan kultur pangkal batang P. gigantea (Tahap I) menggunakan media Knudson C. Pembuatan media dilakuan dengan pemipetan stok lengkap masing-masing. Media ditambah gula (20 g/l), arang aktif (2 g/l), dan bahan organik air kelapa (150 ml/l), ekstrak taoge (30 ml/l), ubi (30 g/l), dan pisang (30 g/l) sebagai perlakuan. Ekstrak taoge didapatkan dengan merebus taoge (30 g) yang sudah ditambah air 250 ml, kemudian air rebusan ditambahkan pada media. Ekstak ubi dan pisang didapatkan dengan menambahkan pisang (30 g) atau ubi (30 g) dengan air, kemudian dilakukan penghalusan dengan blender. Setelah pisang dan ubi menjadi halus, kemudian dilakukan penyaringan ekstrak dengan menggunakan kain saring. Percobaan kultur daun P. gigantea (Tahap II) menggunakan media ½ MS. Pembuatan media dilakukan dengan pemipetan stok lengkap masing masing 25 ml, kecuali vitamin 50 ml, kemudian ditambah gula 20 g/l, aquades, dan ditambah BAP atau TDZ sebagai perlakuan. Percobaan kultur pangkal batang P. gigantea (Tahap II) menggunakan media ½ MS. Pembuatan dilakuan dengan pemipetan stok lengkap masing masing. Media ditambah gula (20 g/l), arang aktif (2 g/l), dan bahan organik air kelapa (150 ml/l), taoge (30 g/l), ubi (30 g/l), dan pisang (30 g/l) sebagai perlakuan. Setiap perlakuan ditambahkan aquades hingga volume larutan 500 ml, kemudian ph larutan dihitung hingga ph 5,6. Larutan tersebut kemudian ditambahkan gelrite (2 g/l) dan dipanaskan di kompor gas hingga mendidih. Larutan media yang sudah dipanaskan dimasukan ke dalam botol kultur steril dan ditutup dengan menggunakan plastik dan karet. Media kemudian disterilisasikan
20 dengan autoklaf selama kurang lebih 15 menit dengan suhu 121 o C dan tekanan 17,5 psi. Setelah sterilisasi, media disimpan di ruang penyimpanan. Persiapan Eksplan Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksplan steril. Sebelum penanaman dilakukan, eksplan dipilah menjadi beberapa golongan, yaitu tunas muda, sedang dan tua. Ketiga golongan tunas dibagi sama rata, sehingga tunas pada setiap perlakuan lebih seragam. Pada percobaan kultur daun P. gigantea (Tahap I), bagian daun pada masing-masing tunas dipotong dan sisa batangnya dipisahkan. Potongan daun tersebut kemudian dimasukan ke dalam larutan betadine, agak kontaminan yang ada pada eksplan dapat hilang. Sedangkan pangkal batangnya ditanam langsung pada media Knudson C. Percobaan kultur daun P. gigantea (Tahap II) menggunakan eksplan steril. Kultur daun menggunakan potongan daun yang berasal dari tunas muda P. gigantea hasil tahap pertama, sedangkan sisa batang ditanam dalam media ½ MS tanpa atau dengan penambahan kitosan (kultur pangkal batang tahap II). Penanaman Penanaman dilakukan di Laminar Air Flow cabinet. Eksplan steril diletakan di atas petridish steril, selanjutnya dipotong menggunakan pisau skapel dan pinset sebanyak satu daun atau pangkal batang pada setiap botol media. Setelah penanaman selesai, botol media ditutup dengan menggunakan plastik dan diikat dengan karet gelang. Botol tanam kemudian disimpan di ruang penyimpanan. Pengamatan Variabel yang diamati pada percobaan kultur daun P. gigantea adalah sebagai berikut: 1. Persen Kontaminasi Jumlah eksplan yang terkontaminasi oleh bakteri atau cendawan dihitung setiap minggunya.
21 2. Waktu Tumbuh PLBs Waktu munculnya PLBs yang dihitung sejak eksplan ditanam. 3. Jumlah PLBs Jumlah PLBs yang terbentuk yang dihitung setiap minggu setelah muncul. 4. Jumlah PLBs yang Berkecambah Jumlah PLBs yang berkecambah yang dihitung pada akhir pengamatan. 5. Waktu Muncul Kalus Waktu munculnya kalus yang dihitung sejak eksplan ditanam. 6. Jumlah Eksplan Berkalus Jumlah eksplan yang berkalus pada akhir pengamatan. Variabel yang diamati pada percobaan kultur pangkal batang P. gigantea adalah sebagai berikut: 1. Persentase Hidup Eksplan Jumlah eksplan yang hidup pada akhir pengamatan. 2. Jumlah Daun Baru Jumlah daun yang terbentuk dihitung setiap minggu. 3. Waktu Muncul Daun baru Waktu daun yang muncul sejak pangkal batang ditanam. 4. Jumlah Tunas Baru Jumlah tunas baru yang terbentuk pada saat pengamatan. 5. Waktu Muncul Tunas Baru Waktu muncul tunas pertama sejak pangkal batang ditanam. 6. Jumlah Akar Jumlah akar yang terbentuk pada saat pengamatan. 7. Waktu Muncul Akar Waktu akar yang muncul sejak pangkal batang ditanam. 8. Panjang akar Panjang akar dihitung dari pangkal ke ujung akar pada akhir pengamatan
22 Analisis Data Percobaan-percobaan dalam penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor perlakuan komposisi media. Model aditif yang digunakan adalah: Y ij = µ + τ i + ε ij Keterangan: i = 1,2,..,t dan j= 1,2,..,r Y ij = Respon pertumbuhan terhadap komposisi media ke-i dan ulangan ke-j. µ = Rataan umum respon pertumbuhan. τ i ε ij = Pengaruh komposisi media ke-i. = Pengaruh galat dari komposi media ke-i dan ulangan ke-j. Analisis data pengamatan kuantitatif menggunakan uji F untuk melihat perbedaaan antara percobaan perlakuan terhadap pengamatan kuantitatif yang diamati. Uji lanjut dengan menggunakan uji perbandingan berganda Duncan (DMRT, Duncan Multiple Range Test) untuk menganalisis perlakuan mana yang berbeda nyata. Analisis data dengan menggunakan software Statistical Analysis System(SAS).