4. HASIL DAN PEMBAHASAN Konsentrasi immunoglobulin Y (IgY) yang diperoleh dalam penelitian ini adalah 9,57 mg/ml dan immunoglobulin G (IgG) adalah 3,75 mg/ml. Pada penelitian ini, antibodi yang dilapiskan diencerkan 1:1000, sehingga besarnya protein IgY yang dilapiskan adalah 9,57 µg/ml dan IgG sebesar 3,75 µg/ml. Pelapisan antibodi dengan pengenceran 1:1000 tersebut merupakan konsentrasi yang cukup, karena menurut Stewart et al. (1990) konsentrasi suatu antibodi yang dilapiskan (coating) pada permukaan microplate berkisar 1-10 µg/ml. Konformasi pertama uji ELISA dilakukan dengan menggunakan IgY sebagai antibodi penangkap antigen ekskretori sekretori (ES) Fasciola gigantica diikuti IgG sebagai antibodi pendeteksi. Uji ELISA konformasi kedua menggunakan IgG sebagai antibodi penangkap ES Fasciola gigantica diikuti IgY sebagai antibodi pendeteksi. Pada kedua uji tersebut, batas nilai penentuan deteksi antigen ES Fasciola gigantica positif terdeteksi, dilihat dari perbedaan cut off pada masing-masing uji. Nilai cut off pada masing-masing uji dihitung dari rataan nilai absorbansi kontrol negatif yang ditambahkan dengan tiga kali nilai standar deviasi. Kontrol negatif yang digunakan adalah larutan PBS yang tidak menggunakan antigen ES Fasciola gigantica. Rataan nilai absorbansi hasil pengujian yang lebih besar dari nilai cut off merupakan hasil pengujian yang bernilai positif. Sebaliknya, rataan nilai absorbansi hasil pengujian yang lebih kecil dari nilai cut off merupakan hasil pengujian yang bernilai negatif. Nilai cut off pada ELISA konformasi pertama adalah 0,1026, yang didapatkan dengan menjumlahkan nilai absorbansi 0,0735 dengan 3 kali standar deviasi 0,0097. Nilai cut off pada ELISA konformasi kedua dengan IgG sebagai antibodi penangkap dan IgY sebagai antibodi pendeteksi adalah 0,1172, yang didapatkan dengan menjumlahkan nilai absorbansi 0,0648 dengan tiga kali standar deviasi 0,0175. Nilai cut off masing-masing pengujian dijabarkan pada Tabel 2.
Tabel 2 Nilai cut off konformasi uji ELISA Konformasi Antibodi Antibodi Nilai Standar penangkap pendeteksi absorbansi deviasi Cut off 1 IgY IgG 0,0735 0,0097 0,1026 2 IgG IgY 0,0648 0,0175 0,1172 Hasil pengujian ELISA konformasi pertama (Gambar 4) menunjukkan seluruh nilai absorbansi hasil pengujian positif karena berada di atas nilai cut off. Konsentrasi ikatan antigen antibodi yang terbentuk semakin mengecil seiring dengan penurunan konsentrasi IgG anti-fasciola gigantica sebagai antibodi pendeteksi. Nilai absorbansi yang paling tinggi berada pada konsentrasi IgG anti- Fasciola gigantica sebagai antibodi pendeteksi dengan pengenceran 1:100 yaitu 0,3970 ± 0,04298. Pada pengenceran 1:1000 nilai absorbansi menjadi 0,2927 ± 0,02586 dan nilai absorbansi yang terendah dengan pengenceran 1:10000 yaitu 0,1691 ± 0,02947. Gambar 4 Nilai absorbansi (OD) ELISA konformasi pertama dengan IgY sebagai antibodi penangkap dan IgG sebagai antibodi pendeteksi. Hasil pengujian ELISA konformasi kedua (Gambar 5) menunjukkan hasil yang fluktuatif. Nilai absorbansi tertinggi dicapai pada IgY sebagai antibodi
deteksi dengan pengenceran 1:100 yaitu 0,2275 ± 0,01985 dan bernilai positif karena berada di atas nilai cut off. Pada pengenceran 1:1000 dan 1:10000, nilai absorbansi menurun menjadi 0,0628 ± 0,00725 dan 0,0742 ± 0,0270. Kedua nilai absorbansi tersebut bernilai negatif karena berada di bawah nilai cut off. Gambar 5 Nilai absorbansi (OD) ELISA konformasi kedua dengan IgG sebagai antibodi penangkap dan IgY sebagai antibodi pendeteksi. Hasil pengujian ELISA konformasi pertama dengan menggunakan IgY sebagai antibodi penangkap memiliki sensitifitas yang lebih tinggi dibandingkan IgG sebagai antibodi penangkap. IgY masih dapat mendeteksi antigen ekskretori sekretori Fasciola gigantica dengan IgG sebagai antibodi pendeteksi hingga pengenceran 1:10000, sedangkan ELISA konformasi kedua, IgG hanya dapat menangkap antigen ekskretori sekretori Fasciola gigantica dengan IgY sebagai antibodi pendeteksi pada pengenceran 1:100. Perbedaan kemampuan ini disebabkan karena perbedaan konsentrasi immunoglobulin yang dilapiskan pada permukaan microplate. Hasil konformasi pertama uji ELISA (Tabel 3) menunjukkan pada pengenceran antibodi pendeteksi 1:100, IgY mampu menangkap antigen 3,87 kali dari nilai cut off. Pada pengenceran antibodi pendeteksi 1:1000 dan 1:10000, IgY mampu menangkap antigen 2,85 hingga 1,65 kali dari nilai cut off. Berbeda
dengan konformasi kedua uji ELISA (Tabel 4), IgG hanya mampu menangkap antigen 1,91 kali dari nilai cut off. Nilai tersebut diperoleh dari pengenceran antibodi pendeteksi 1:100. Pada konsentrasi antibodi pendeteksi 1:1000 dan 1:10000, IgG sudah tidak mampu menangkap antigen ekskretori sekretori Fasciola gigantica dan bernilai negatif. Tabel 3 Perbandingan hasil absorbansi uji ELISA konformasi pertama dengan nilai cut off Cut off 0,1026 Pengenceran IgG antibodi deteksi 1: 100 1:1000 1:10000 0,397 ± 0,04298 0,2927 ± 0,02586 0,1691 ± 0,02947 3,87 2,85 1,65 Tabel 4 Perbandingan hasil absorbansi uji ELISA konformasi kedua dengan nilai cut off Cut off 0,1172 Pengenceran IgY antibodi deteksi 1: 100 1:1000 1:10000 0,2275 ± 0,01985 0,0628 ± 0,00725 0,0742 ± 0,0270 1,91 0,54 0,63 Hasil pengujian tersebut menunjukkan bahwa optimasi yang baik diperoleh dari konformasi pertama yaitu IgY sebagai antibodi penangkap dengan pengenceran 1:1000 dan IgG sebagai antibodi pendeteksi dengan pengenceran 1:100. Konformasi tersebut mampu menghasilkan nilai absorbansi paling jauh dari nilai cut off yaitu 3,87 kali. Penelitian yang dilakukan oleh Estuningsih (2006), dengan menggunakan IgG anti-ekskretori sekretori Fasciola gigantica sebagai antibodi penangkap (1:1600) dan antibodi pendeteksi (1:1600), mampu menghasilkan nilai absorbansi 7 kali dari nilai cut off. Berdasarkan hasil tersebut, dapat diketahui bahwa IgY memiliki kemampuan sebagai antibodi penangkap dalam pengujian ELISA. Antibodi IgY memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai antibodi penangkap dalam berbagai pengujian ELISA. Dalam berbagai pengujian deteksi
fasciolosis dengan uji ELISA, belum ada pengujian yang menggunakan IgY sebagai antibodi penangkap ekskretori sekretori Fasciola gigantica. Menurut Silva dan Tambourgi (2010), IgY dapat mengenali lebih banyak epitop antigenik dibandingkan dengan antibodi yang diproduksi mamalia. Perbedaan kemampuan kedua immunoglobulin dalam menangkap antigen disebabkan karena perbedaan struktur kedua immunoglobulin tersebut. Struktur ini yang berpengaruh pada kemampuan IgY dalam menangkap antigen. Perbedaan struktur IgY dan IgG terletak pada bagian leher IgY yang disebut hinge. Struktur immunoglobulin terdiri dari empat rantai polipeptida dasar yang terdiri dari 2 rantai berat (heavy chain) dan dua rantai ringan (light chain) yang identik (Gambar 6). Setiap rantai terikat pada rantai berat melalui ikatan disulfide (S-S), demikian pula rantai berat satu dengan lainnya dihubungkan dengan ikatan S-S (Schade et al. 1999). Rantai berat IgY (65 105 Da) sering disebut dengan upsilon, υ, mempunyai satu bagian variable (V H ) dan empat bagian konstan (Cυ1, Cυ2, Cυ3, Cυ4), serta tidak memiliki daerah lengan. Rantai ringan (18 660 Da) tersusun atas satu bagian variable (V L ) dan satu bagian konstan yang tetap (C L ). Berbeda dengan IgG yang memiliki empat rantai pada rantai beratnya, yaitu tiga rantai konstan (Cγ1, Cγ2, dan Cγ3) dan satu rantai variable (V H ) (Schade et al. 1999). Pada struktur IgG, daerah Cγ2 dan Cγ3 berhubungan erat dengan daerah Cγ3 dan Cγ4, dan saat Cγ2 absen, maka digantikan oleh daerah lengan yang disebut hinge, yang menjadi keunikan struktur antibodi mamalia (Schade et al. 1999; Michael et al. 2010). Bagian leher (hinge) IgY tidak fleksibel seperti pada IgG (Warr et al. 1995). Pembatasan gerakan region hinge (Cυ2) dalam rantai berat membuat IgY menjadi tidak fleksibel. Selain itu, terdapat beberapa regio pada IgY yang berisi sisa proline dan glycin sehingga membatasi kefleksibelan IgY. Hal ini akan berpengaruh pada kemampuan antibodi untuk mempresipitasi ataupun mengaglutinasi antigen (Carlander 2002).
Gambar 6 Perbedaan struktur IgG manusia (A) dengan IgY (B). (Silva dan Tambourgi 2010) Sebagian besar fungsi efektor biologi immunoglobulin diaktifkan oleh region Fc yang merupakan perbedaan utama struktur IgG dan IgY. Regio inilah yang bertanggung jawab terhadap perilaku IgY ketika dikombinasikan dengan antigen. Regio Fc pada IgY tidak mengaktifkan faktor komplemen, tidak berikatan dengan protein A dan protein G, dan tidak berikatan dengan antibodi mamalia (Gao et al 2008; Chai dan Chen 2009; Michael et al. 2010). Faktor ini menyebabkan hasil negatif palsu maupun positif palsu pada pengujian immunologi dapat diminimalisasi. Antibodi IgY maupun IgG merupakan antibodi poliklonal. Antibodi poliklonal memiliki sifat yang relatif stabil dibandingkan dengan antibodi monoklonal. Antibodi poliklonal memiliki campuran kompleks antibodi dengan spesifisitas, afinitas, dan isotipe yang berbeda. Antibodi poliklonal bereaksi dengan sejumlah antigen determinan yang berbeda pada antigen. Reaktivitas multipel ini dapat mengakibatkan terbentuknya kompleks antigen antibodi yang besar yang memiliki aplikasi praktis dalam presipitasi antigen (Smith 1995). Antibodi poliklonal lebih mudah menimbulkan reaksi silang. Reaksi ini terjadi akibat kehadiran antibodi terhadap antigen selain antigen yang digunakan yang tidak berkaitan dan tidak relevan. Reaksi silang dapat terjadi karena epitop yang sama dimiliki oleh antigen yang berbeda atau epitop yang secara struktur
mirip atau memiliki keserupaan dengan epitop pembuat peka (priming epitop) yang dikenali oleh antibodi (Smith 1995). Struktur IgY yang lebih rigid dapat meminimalisasi terjadinya reaksi silang karena memiliki spesifisitas yang tinggi. Berbeda dengan IgG, karena strukturnya yang lebih fleksibel, sehingga antibodi ini memiliki sensitifitas yang tinggi. Hal inilah yang menjadi salah satu keunggulan penggunaan IgY dalam berbagai pengujian serologis. Jarak filogenetik yang jauh antara unggas dan mamalia, menjadikan unggas sebagai produsen potensial penghasil antibodi untuk melawan protein mamalia yang terkonservasi. Evolusi tersebut menunjukkan bahwa tidak ada reaksi silang imunologis antara IgY dengan IgG. Serum kelinci akan menghasilkan 1% hingga 5% antibodi untuk melawan antigen mamalia yang spesifik. Kuning telur unggas mampu menghasilkan 2% hingga 10% antibodi untuk melawan antigen mamalia yang spesifik. Selain itu, antibodi untuk melawan protein mamalia yang terkonservasi seringkali gagal dihasilkan dari respon imun kelinci, namun antibodi tersebut sering sukses dihasilkan dari sistem imun unggas (Carlander 2002). Keunggulan lain menggunakan IgY dalam pengujian serologis adalah IgY tidak bereaksi dengan faktor rheumatoid (RF) dan Human Anti-Mouse Antibodi IgG (HAMA). RF dan HAMA seringkali menyebabkan hasil positif palsu maupun negatif palsu dalam pengujian immunologi. RF merupakan autoantibodi yang bereaksi dengan bagian Fc pada IgG mamalia. RF ataupun HAMA dapat bereaksi dengan antibodi penangkap dan antibodi pendeteksi dalam uji ELISA sandwich. Reaksi dengan antibodi pendeteksi akan menghasilkan kompleks imun. HAMA juga akan bereaksi dengan antigen yang berikatan dengan epitop dan menghambat pengikatan antigen. Adanya RF dan HAMA ini akan meningkatkan sensitifitas pengujian ELISA. IgY tidak bereaksi dengan RF ataupun HAMA sehingga hasil pengujian negatif palsu ataupun positif palsu dapat ditekan (Larsson dan Sjoquist 1990; Carlander 2002; Zhang 2003; Michael et al. 2010).
Teknik ELISA dengan menggunakan IgY anti-fasciola gigantica sebagai antibodi penangkap dapat digunakan dalam teknik diagnosis kasus fasciolosis. Teknik ini diharapkan dapat menciptakan suatu bentuk kit ELISA yang dapat mendeteksi fasciolosis melalui feses ternak (coproantigen). Ekskretori sekretori Fasciola gigantica akan dikeluarkan oleh cacing bersamaan dengan feses ternak. Dengan demikian, melalui ekskretori sekretori yang terdapat dalam feses akan ditangkap oleh IgY anti-fasciola gigantica.