BAB III METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 1 faktor perlakuan, yaitu penambahan sukrosa dalam media kultur in vitro yang terdiri atas 5 variasi konsentrasi (20, 22,5, 25, 30 dan 40 g.l -1 ). Setiap perlakuan dilakukan pengulangan sebanyak 6 ulangan. B. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan, Jurusan Pendidikan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Yogyakarta dari bulan Februari sampai Juni 2017. C. Variabel Penelitian Pada penelitian ini variabel respon atau terikat berupa pengamatan fenotipe tanaman meliputi jumlah daun, jumlah akar, panjang daun, panjang akar, diameter pseudobulb, jumlah pseudobulb dan tinggi tanaman yang diamati setiap minggu selama 10 minggu setelah subkultur. Variabel bebas dari penelitian ini adalah variasi penambahan konsentrasi sukrosa pada medium kultur (medium NP), yaitu : P0 (kontrol) = 20 g.l -1 + 0 g.l -1 = 20 g.l -1 P1 = 20 g.l -1 + ( x 20) g.l -1 = 22,5 g.l -1 P2 = 20 g.l -1 + ( x 20) g.l -1 = 25 g.l -1 31
P3 = 20 g.l -1 + ( x 20) g.l -1 = 30 g.l -1 P4 = 20 g.l -1 + (1 x 20) g.l -1 = 40 g.l -1 A. Bahan dan Alat Penelitian Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman Anggrek Dendrobium antennatum yang berumur 10 bulan sejak berkecambah dari biji. Tanaman Dendrobium antennatum tersebut sebelumnya ditanam di media pra perlakuan, yaitu media NP dengan penambahan air kelapa sebanyak 150 ml. Bahan untuk pembuatan media dasar (media NP) meliputi larutan stok makronutrien, mikronutrien, stok besi (Fe), stok vitamin, myoinositol, sukrosa, agar, air kelapa dan aquadest steril. Komposisi media dasar NP disajikan pada Lampiran 1. Bahan sterilisasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah alkohol 70% dan 96%. Alat yang digunakan dalam pembuatan media meliputi botol kultur dengan kapasitas volume 300 ml, timbangan analitik, gelas ukur, ph stik, erlenmeyer, pengaduk, tisu, pipet, hot plate, magnetic stirrer dan autoclave. Alat yang digunakan untuk penanaman adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), pinset, scapel, cawan petri, lampu bunsen, korek api, kertas saring steril, sarung tangan dan masker. Alat-alat yang digunakan untuk penyimpanan adalah rak kultur yang dilengkapi dengan lampu neon dengan intensitas penyinaran sepanjang hari. 32
B. Prosedur Kerja Dalam penelitian ini terdapat serangkaian prosedur atau tahapan kerja yang meliputi : 1) Persiapan alat dan bahan, 2) Penanaman, 3) Pemeliharaan tanaman. Berikut ini adalah tahapan-tahapan kerja yang dilakukan selama penelitian berlangsung : 1. Persiapan Alat Peralatan yang akan digunakan dalam pembuatan media dicuci dengan deterjen sampai bersih kemudian disterilkan menggunakan autoclave pada suhu 121 o C dengan tekanan 1 atm selama 30 menit. Alat-alat yang perlu disterilkan yaitu pinset, cawan petri, scapel, erlenmeyer dan botol kultur. 2. Pembuatan Media Tahap awal dalam pembuatan media adalah pembuatan larutan stok. Larutan stok berfungsi untuk mempermudah pembuatan media sehingga tidak perlu menimbang bahan setiap kali membuat media. Larutan stok yang dibuat antara lain stok makronutrien, mikronutrien, vitamin dan stok besi (Lampiran 1). Media dibuat dengan cara memasukkan atau memipet larutan stok berdasarkan konsentrasi yang dibutuhkan untuk membuat 1 liter media. Stok yang dimasukkan yaitu stok makronutrien (200 ml.l -1 ), stok mikronutrien (2,5 ml.l -1 ), stok vitamin (5 ml.l -1 ) dan stok besi (5 ml.l -1 ). Setelah semua larutan stok dimasukkan kemudian ditambah dengan myo-inositol (100 mg) dan air kelapa sebanyak 150 ml. 33
Larutan diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer hingga larutan tercampur rata/homogen. Pada media pra (sebelum) perlakuan ditambah dengan sukrosa sebanyak 20 g.l -1. Selanjutnya larutan ditambah dengan aquades hingga volumenya mencapai 1000 ml, kemudian dilakukan pengukuran ph dengan ph meter hingga mencapai ph 6 menggunakan NaOH 1 N. Setelah ph mencapai 6, media ditambah dengan agar sebanyak 7 g dan dimasak hingga agar larut dan tercampur. Media dituang ke dalam botl kultur ukuran 300 ml kemudian di autoclave selama 15 menit. Media yang sudah di autoclave disimpan dalam ruangan dengan suhu 19 o C. Tahapan pembuatan media perlakuan hampir sama dengan pembuatan media pra perlakuan. Perbedaannya terletak pada penambahan sukrosa yang dimasukkan ke dalam media. Media perlakuan merupakan media NP dengan modifikasi jumlah atau konsentrasi sukrosa sebesar 20, 22,5, 25, 30 dan 40 g.l -1. 3. Persiapan Bahan Tanaman Dendrobium antennatum sebelumnya ditanam pada media pra perlakuan, yaitu media New Phalaenopsisi (NP) dengan penambahan air kelapa 150 ml dan sukrosa sebanyak 20 g.l -1. Dendrobium antennatum ditanam di media pra perlakuan selama 1 bulan (dari bulan Februari sampai bulan Maret 2017). Setelah 1 bulan ditanam di media pra perlakuan, tanaman Dendrobium antennatum disubkultur ke media perlakuan untuk meningkatkan pertumbuhan pseudobulb. 34
4. Penanaman Penanaman dilakukan di dalam Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) yang telah disterilkan dengan menyemprot seluruh bagian LAF menggunakan alkohol 70% dan menyinarinya dengan paparan sinar UV selama 24 jam. Dendrobium antennatum yang ditanam dalam media pra perlakuan sebanyak 7-10 tanaman per botol, sedangkan pada media perlakuan, tanaman ditanam sebanyak 2 per botol (total tanaman yang ditanam pada media perlakuan adalah 30). 5. Penyimpanan/Pemeliharaan Tanaman Tanaman Dendrobium antennatum yang telah ditanam baik dalam media pra perlakuan maupun media perlakuan disimpan dalam rak kultur dengan intensitas penyinaran lampu selama 24 jam/hari dan suhu 16-19 o C. C. Teknik Pengumpulan Data Pengamatan tanaman dalam media perlakuan dilakukan setiap seminggu sekali selama 10 minggu. Peubah yang diamati antara lain : 1. Jumlah daun Daun yang dihitung adalah daun yang telah terbuka penuh, dihitung dari daun paling bawah sampai dengan daun paling ujung. 2. Jumlah akar Akar yang dihitung adalah seluruh akar yang muncul pada tanaman, dari akar yang baru muncul sampai dengan akar yang sudah tua. 35
3. Panjang daun dan akar Panjang daun dan akar diukur dari daun dan akar yang paling panjang (Gambar 5). 4. Jumlah pseudobulb Pseudobulb yang dihitung adalah semua pseudobulb (tunas) yang muncul baik di ketiak daun, di pangkal batang sampai dengan tunas yang muncul di dekat akar tanaman. 5. Diameter pseudobulb Diameter pseudobulb diukur dari pseudobulb (batang) terbesar (Gambar 5). 6. Tinggi tanaman anggrek Tinggi tanaman anggrek diukur dengan menggunakan milimeter blok (Gambar 5). Gambar 5. Cara pengukuran panjang daun, panjang akar, diameter pseudobulb serta tinggi tanaman Dendrobium antennatum D. Teknik Analisis Data Data kuantitatif berupa data pengukuran jumlah daun, jumlah akar, panjang daun, panjang akar, jumlah pseudobulb, diameter pseudobulb dan tinggi tanaman anggrek, kemudian dianalisis secara statistik menggunakan program SPSS dengan uji One Way Anova. Uji ini dilakukan untuk 36
mengetahui adanya pengaruh penambahan konsentrasi sukrosa terhadap pertumbuhan pseudobulb. Apabila hasilnya signifikan maka dilanjutkan dengan uji lanjut DMRT (Duncan Multiple Range Test) taraf 10% guna mengetahui pengaruh beda nyata antar perlakuan. E. Batasan Operasional 1. Tanaman untuk penelitian merupakan hasil perkembangan biji anggrek Dendrobium antennatum berumur 10 bulan yang ditanam dalam media pra perlakuan (media NP+150 ml air kelapa) selama 1 bulan, kemudian dipindah pada medium perlakuan. 2. Tanaman Dendrobium antennatum yang dikultur adalah tanaman yang memiliki 2-3 helai daun. 37