BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Pelaksanaan Kegiatan penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan selama 5 bulan yang terhitung dari bulan Mei sampai dengan bulan September 2009. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah biji melon muda dan biji melon tua H-7 koleksi Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB. Media kultur MS (Murashige and Skoog), media B5, dan media WPM (Woody Plant Medium), agar-agar sebagai bahan pemadat, sukrosa (gula), zat pengatur tumbuh (2,4-D, picloram, NAA, dan BAP), klorox, alkohol 70%, bakterisida (streptomycin sulfat), fungisida (mankozeb), detergen, betadhine dan air steril. Alat yang digunakan terdiri dari botol kultur, gelas ukur, gelas piala besar, cawan petri, corong plastik, kompor, autoclave, laminar airflow cabinet, ph meter, lampu spiritus, botol sprayer, rak kultur, plastik gulung dan karet gelang serta peralatan diseksi seperti sudip, pinset, pisau, dan scalpel. Metode Penelitian Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rancangan perlakuan dua faktor dengan menggunakan rancangan acak kelompok (RAK). Pada percobaan 1 faktor pertama adalah jenis media tumbuh dengan 3 taraf yaitu: Media MS, Media WPM, dan Media B5. Faktor kedua adalah konsentrasi zat pengatur tumbuh auksin jenis 2,4-D, dengan 4 taraf yaitu: 0, 0.5, 1.0 dan 1.5 mg/l. Terdapat 12 kombinasi perlakuan dan setiap perlakuan diulang 3
13 kali berdasarkan hari penanaman sehingga diperoleh 36 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 5 botol dan 1 botol terdiri dari 4 eksplan Pada percobaan 2 faktor pertama adalah jenis dan konsentrasi auksin yang terdiri dari 7 taraf yaitu: tanpa auksin, 1.0 mg/l 2,4-D, 2.0 mg/l 2,4-D, 1.0 mg/l picloram, 2.0 mg/l picloram, 1.0 mg/l NAA, dan 2.0 mg/l NAA. Faktor kedua adalah konsentrasi BAP yang terdiri dari 2 taraf yaitu: 0 dan 0.1 mg/l. Terdapat 14 kombinasi perlakuan dan setiap perlakuan diulangan 3 kali berdasarkan hasil penanaman sehingga diperoleh 42 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 5 botol dan 1 botol terdiri dari 4 eksplan..uji statistik yang digunakan yaitu analisis sidik ragam. Model rancangan yang digunakan adalah : Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + δk + εijk i = perlakuan jenis media (percobaan 1) atau taraf jenis dan taraf konsentrasi auksin (percobaan 2) j = perlakuan taraf konsentrasi 2,4-D (perobaan 1) atau taraf konsentrasi BAP (percobaan 2) k = 1, 2, 3 (ulangan) Yijk = respon perlakuan µ = pengaruh rata-rata umum αi = pengaruh perlakuan jenis media (percobaan 1) atau jenis dan taraf konsentrasi auksin (percobaan 2) pada taraf ke-i βj = pengaruh perlakuan konsentrasi 2,4-D (percobaan 1) atau konsentrasi BAP (percobaan 2) pada taraf ke-j (αβ)ij = pengaruh interaksi antara dua faktor perlakuan δk = pengaruh kelompok ke-k εijk = pengaruh galat percobaan Pada percobaan 1 : Pada Percobaan 2 : i = 1,2,3 i = 1,2,3,...,7 j = 1,2,3,4 j = 1,2 k = 1,2,3 k = 1,2,3
14 Data pengamatan diuji dengan menggunakan analisis ragam, jika terdapat pengaruh yang nyata, maka akan dilanjutkan dengan uji lanjut DMRT (Duncan Multiple Range Test) pada taraf 5%. Pengolahan data dilakukan dengan perangkat lunak Statistical Analysis System (SAS). Pelaksanaan Penelitian Persiapan dan Sterilisasi Alat Alat-alat yang digunakan untuk kegiatan penanaman harus dalam keadaan steril. Botol kultur, cawan petri, alat tanam (pinset, pisau dan scalpel) dicuci bersih terlebih dahulu kemudian dikeringkan. Peralatan tanam dan cawan petri tersebut dibungkus dengan kertas. Semua peralatan tersebut disterilisasi dengan autoclave pada temperatur 121 0 C dengan tekanan 1.1 kgcm 2 selama 1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan mencapai 1.1 kgcm 2. Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutan stok bahan pembuat media MS, B5 dan WPM bertujuan untuk memudahkan pembuatan media. Larutan stok media dibuat sesuai dengan komposisi media MS, WPM, dan B5 (Tabel Lampiran 1, 2, dan 3) yang disimpan dalam erlenmeyer dengan konsentrasi yang lebih pekat dalam suhu kamar. Pembuatan Media Kultur Percobaan I : Media MS, B5 dan WPM dibuat dari larutan stok yang sudah tersedia. Hal pertama yang dilakukan adalah memipet beberapa jenis larutan stok MS, B5, dan WPM (Tabel Lampiran 1, 2, dan 3) kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh 2,4-D dengan konsentrasi sesuai perlakuan dan larutan gula sebanyak 30 g/l selanjutnya ditambahkan aquades sampai volumenya mencapai 1000 ml. Media diatur hingga derajat keasamannya (ph) 5.8-6.0. Penambahan dan pengurangan ph dilakukan dengan penambahan larutan KOH atau HCl hingga mencapai ph yang diinginkan. Larutan tersebut dipindahkan ke dalam wadah yang lebih besar
15 kemudian ditambahkan agar-agar sebanyak 7 g/l. Media tersebut dipanaskan dan diaduk sehingga agar-agar larut. Setelah mendidih media dituangkan ke dalam botol-botol kultur steril yang telah dipersiapkan. Masing-masing botol kultur diisi sebanyak 20 ml media. Botol segera ditutup rapat dengan menggunakan plastik dan diikat dengan karet gelang lalu disterilkan dengan autoclaf pada suhu 121 0 C dan tekanan 1.1 kgcm 2 selama 30 menit. Selanjutnya media yang sudah disteril disimpan dalam ruang penyimpanan media yang telah dilengkapi dengan pendingin ruangan. Percobaan II : Pada percobaan 2 dilakukan perlakuan kombinasi berbagai auksin (2,4-D ; Picloram dan NAA) dengan sitokinin (BAP). Kombinasi auksin dan sitokinin yang akan dilakukan yaitu: 2,4-D + BAP ; Picloram + BAP dan NAA + BAP. Hal pertama yang dilakukan dalam pembuatan media adalah memipet beberapa jenis larutan stok komposisi media MS (Tabel Lampiran 1) kemudian ditambahkan auksin dan sitokinin. Konsentrasi auksin yang digunakan yaitu 1.0 dan 2.0 mg/, sedangkan konsentrasi sitokinin yang digunakan yaitu 0 dan 0.1 mg/l. Selanjutnya ditambahkan larutan gula sebanyak 30 g/l dan ditambahkan aquades sampai volumenya mencapai 1000 ml. Derajat keasamannya (ph) diatur sehingga mencapai 5.8 6.0. Pengaturan ph dilakukan dengan penambahan larutan KOH atau HCl hingga mencapai ph yang diinginkan. Larutan tersebut dipindahkan ke dalam wadah yang lebih besar kemudian ditambahkan agar-agar sebanyak 7 g/l. Media tersebut dipanaskan dan diaduk sehingga agar-agar larut. Setelah mendidih media dituangkan ke dalam botol-botol kultur steril yang telah dipersiapkan. Masing-masing botol kultur diisi sebanyak 20 ml media. Botol segera ditutup rapat dengan menggunakan plastik dan diikat dengan karet gelang lalu disterilkan dengan autoclaf pada suhu 121 0 C dan tekanan 1.1 kgcm 2 selama 30 menit. Selanjutnya media yang sudah disteril disimpan dalam ruang penyimpanan media yang telah dilengkapi dengan pendingin ruangan.
16 Sterilisasi Eksplan Percobaan I : Buah melon yang muda terlebih dahulu dicuci bersih dengan menggunakan detergen. Buah yang sudah bersih kemudian direndam dalam larutan dithane dan agrept, masing-masing 2 g/ /l selama 1 jam. Buah yang sudah Pemilihan Eksplan Percobaan I : Biji melon muda sebagai eksplan diambil dari buah melon hibrida H-7 muda, berumur 15 hari setelah penyerbukan yang berasal dari kebun percobaan Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB. Biji melon muda harus berpenampilan baik dan utuh. A B Gambar 1. (A) Buah Melon Muda Berumur 15 Hari, (B) Biji Melon Muda Percobaan III : Biji tua melon (mature seed) yang berasal dari melon hibrida H-7 koleksi Pusat Kajian Buah-buahan Tropika IPB dipilih yang berpenampilan baik, tidak cacat, berukuran normal, dan seed coat bebas dari jamur. Gambar 2. Biji Tua Melon Hibrida H-7
17 disterilkan tersebut kemudian dipindahkan kedalam Laminar Airflow Cabinet. Lalu buah direndam ke dalam clorox 25% selama 20 menit, dibilas dengan aquades steril sebanyak 2 kali. Lalu buah dibelah secara melintang tepat dibagian tengah. Biji melon dipisahkan dari daging buah kemudian satu-persatu biji dibersihkan dari lendir yang menempel dengan menggunakan pinset. Biji yang sudah bersih dari lendir direndam dalam klorox 5% selama 20 menit. Banyaknya biji yang direndam adalah 100 biji per 100 ml larutan klorox. Percobaan II : Pada percobaan kedua biji melon tua dipisahkan dari kulit biji sehingga diperoleh kotiledon (Gambar 3). Kotiledon yang diperoleh kemudian direndam dalam larutan fungisida dan bakterisida dengan masing-masing konsentrasi 2 g/l selama 1 jam. Kotiledon lalu dibilas dengan air steril kemudian direndam dalam larutan klorox 10% selama 10 menit lalu direndam kembali dalam larutan klorox 5% selama 5 menit kemudian dibilas dengan air steril sebanyak 2 kali. Banyaknya biji yang direndam adalah 100 biji per 100 ml larutan klorox. Penanaman Biji Penananan eksplan dilakukan didalam laminar airflow cabinet yang sebelumnya telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70% sebelum penanaman. Semua alat-alat yang akan digunakan dalam proses penanaman dimasukkan kedalam laminar namun sebelumnya disemprot dengan alkohol 70%. Setelah disterilisasi biji segera ditanam dalam media yang telah disiapkan beberapa hari sebelumnya. Pada percobaan pertama biji melon ditanam bersama dengan kulitnya dan diletakkan dipermukaan media. Pada percobaan kedua biji melon yang sudah dipisahkan dari kulit bijinya dipotong bagian aksisnya sehingga diperoleh bagian kotiledon (Gambar 3) kemudian bagian kotiledon ditanam dalam media kultur. Kultur disimpan dalam ruang kultur yang gelap dan bertemperatur 18-24 0 C.
18 Gambar 3. Sketsa Biji Melon yang Sudah Dipisahkan Kulit Bijinya, Bagian Kotiledon Ditanam pada Media Kultur (Gray, 2000). Pengamatan Pengamatan dilakukan terhadap beberapa peubah yaitu : 1. Kultur yang terkontaminasi 2. Kultur yang membentuk kalus 3. Kultur yang membentuk embrio somatik 4. Waktu terbentuknya kalus dan embrio somatik 5. Struktur dan warna kalus 6. Kultur yang berkecambah dan berakar Pada setiap perlakuan terdapat 5 unit botol yang diulang 3 kali berdasarkan hari penanaman. Terdapat 4 eksplan dalam setiap botol. Pengamatan dilakukan terhadap semua eksplan. Eksplan diamati satu-persatu dan dicatat jumlahnya sesuai dengan respon yang muncul. Data perlakuan yang diolah diperoleh dari data rata-rata setiap botol. Rata-rata tiap botol diperoleh dengan cara membagi eksplan yang memberikan respon dengan jumlah total eksplan per botol. Data setiap ulangan diperoleh dengan menambahkan hasil rata-rata tiap botol dibagi dengan jumlah botol tiap ulangan. Jika terdapat botol yang terkontaminasi maka data ulangan diperoleh dengan menambahkan hasil ratarata tiap botol dibagi dengan jumlah botol yang masih ada.