LAMPIRAN
Lampiran 1. Penentuan kadar ADF (Acid Detergent Fiber) (Apriyantono et al., 1989) Pereaksi 1. Larutan ADF Larutkan 20 g setil trimetil amonium bromida dalam 1 liter H 2 SO 4 1 N 2. Aseton Cara Kerja 1. Timbang sampel bentuk tepung lolos ayakan 30 mesh sebanyak 1 gram dan masukkan kedalam erlenmeyer. 2. Tambahkan 100 ml larutan ADF; didihkan pada pendingin tegak selama 60 menit 3. Saring melalui filter gelas 2-G-3; endapan yang diperoleh dicuci dengan akuades panas beberapa kali. 4. Endapan dicuci kembali dengan aseton beberapa kali 5. keringkan filter gelas dan endapan dalam oven 100 o C sampai diperoleh berat yang tetap (sekitar 8 jam), timbang. 6. Abukan endapan pada tanur yang bersuhu 450-500 o C hingga diperoleh berat yang tetap (sekitar 3 jam), timbang. Perhitungan a : berat filter dan endapan setelah dikeringkan (gram) b : berat filter dan endapan setelah diabukan c : berat awal sampel (gram) a b c Persen kadar ADF = x 100
Lampiran 2. Penentuan kadar NDF (Neutral Detergent Fiber) (Apriyantono et al., 1989) Pereaksi 1. Larutan NDF 18.61 gram EDTA-2Na, 6.81 gram Na 2 B 4 O 7.10H 2 O, 30 gram sodium lauril sulfat, 4.56 gram Na 2 HPO 4, dan 10 ml 2-etoksi-etanol dilarutkan sampai 1 liter, sehingga ph 6.8-7.1. 2. Larutan α-amilase 1 gram α-amilase dimasukkan dalam 1 liter buffer fosfat yaitu 0,067 M buffer fosfat (KH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 ). ph 7.0±0.05 3. Aseton Cara Kerja 1. Timbang 0.5 gram sampel bentuk tepung lolos ayakan 30 mesh dan masukkan kedalam erlenmeyer 2. Tambahkan 30 ml larutan α-amilase dan inkubasi pada suhu 40oC selama 16 jam (semalam) 3. Tambahkan 200 ml larutan NDF dan 0.5 gram Na 2 SO 3 4. Refluks campuran pada pendingin tegak selama 60 menit 5. Saring campuran melalui filter gelas 2-G-3 dan cuci dengan akuades panas beberapa kali. 6. Bilas endapan dengan aseton beberapa kali 7. Keringkan filter dan endapan pada oven yang bersuhu 100 o C sampai diperoleh berat yang tetap (sekitar 8 jam), timbang 8. Abukan filter dan endapan pada tanur yang bersuhu 450-500 o C sampai diperoleh berat yang tetap (sekitar 3 jam) timbang. Perhitungan a : Berat filter dan endapan setelah dikeringkan (gram) b : Berat filter dan endapan setelah diabukan (gram) w : Berat sampel awal (gram) a b w Persen kadar NDF = x 100
Lampiran 3. Penetapan kadar Lignin (Apriyantono et al., 1989) Pereaksi 1. Larutan ADF (lihat penetapan ADF) 2. Larutan H 2 SO 4 72% (w/v) 3. Aseton Cara Kerja 1. Timbang 0.5 gram sampel berbentuk tepung lolos ayakan 30 mesh, masukkan ke dalam erlenmeyer/ labu didih. 2. Tambahkan 100 ml larutan ADF 3. Refluks pada pendingin tegak selama 60 menit 4. Saring melalui filter gelas 2-G-4 5. Tempatkan filter gelas yang berisi residu pada gelas piala 100 ml 6. Tambahkan 25 ml H2SO4 72% dingin (15 o C) ke dalam filter gelas, aduk dengan menggunakan gelas pengaduk sampai terbentuk pasta halus. Biarkan gelas pengaduk berada dalam filter gelas. 7. Biarkan selama 3 jam pada suhu 20-23 o C sambil diaduk-aduk setiap 1 jam sekali. 8. Dengan bantuan vacum lakukan penyaringan. Cuci residu dengan air panas sampai filtrat bebas asam (cek dengan kertas lakmus). Jangan lupa cuci bagian pinggir filtrat dan gelas pengaduk dengan air panas. 9. Bilas residu dengan aseton 2-3 kali. 10. Keringkan filter gelas dalam oven 100 o C sampai diperoleh berat tetap, masukkan ke dalam desikator kemudian timbang. 11. Masukkan filter ke dalam tanur 450-500 o C sampai diperoleh berat tetap, biarkan agak dingin, masukkan desikator, timbang. Perhitungan a b Persen kadar Lignin = x 100 W a = Berat filter dan residu setelah dikeringkan (gram) b = Berat filter dan residu setelah diabukan (gram) W = Berat awal sampel (gram)
Lampiran 4. Prosedur analisis proksimat (kadar air, kadar abu, kadar protein, kadar lemak, dan kadar serat kasar) mengikuti metode Takeuchi (1988). a. Prosedur analisis kadar air - Cawan dipanaskan pada suhu 110 o C selama 1 jam, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (A). - Sampel ditimbang sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam cawan, kemudian ditimbang (B). - Cawan dan sampel dipanaskan tanpa penutup pada suhu 110 o C selama 2 jam, kemudian didinginkan dalam desikator sampai suhu ruang dan timbang. Proses tersebut diulang sampai beratnya konstan (C). - Kadar air (%) = (B-C) x 100 (B-A) b. Prosedur analisis kadar abu - Cawan porselin dipanaskan pada suhu 600 o C selama 1 jam di dalam muffle furnase, kemudian dibiarkan suhu muffle furnase turun sampai 110 o C, selanjutnya cawan porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang (A). - Sampel ditimbang sebanyak 1 sampai 2 gram dan dimasukkan ke dalam cawan, kemudian ditimbang (B). - Cawan porselin dan sample dipanaskan di dalam muffle furnase pada suhu 600 o C selama 1 jam, kemudian dibiarkan sampai samalam. - Cawan porselin + sample dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang (C). - Kadar abu (%) = C x 100 (B-A) c. Prosedur analisis protein c.1. Tahap Oksidasi - Sampel ditimbang sebanyak 0,5 gram dan dimasukkan ke dalam labu Kjehldahl, salah satu dari labu digunakan sebagai blanko dan tidak diisi dengan sample. - Tiga gram katalis (K 2 SO 4 + Cu SO 4.H 2 O dengan rasio 9:1) dan 10 ml H 2 SO 4 pekat ditambahkan. - Labu Kjeldahl dipanaskan pada suhu 400 o C selama 0,5 sampai satu jam, kemudian pemanasan dilanjutkan lagi selama 3 sampai 4 jam sehingga terjadi perubahan warna menjadi hijau bening. - Larutan ditambah dengan 20 ml air destilata dan didinginkan. - Setelah dingin diencerkan dengan air destilata sampai 100 ml.
c.2.tahap Destilasi - Beberapa tetes H 2 SO 4 ditambahkan ke dalam botol A yang sebelumnya telah diisi setengah bagian dengan air destilata untuk menghindari amoniak lingkungan, kemudian dididihkan selama 10 menit. - Botol erlenmeyer (F) yang berisi 10 ml H 2 SO 4 0,05 N ditetesi 2 sampai 3 tetes indikator (methyl red / methyl blue), disiapkan untuk menampung NH 3 yang dibebaskan. - 5 ml larutan sampel dimasukkan ke botol D melalui corong C, kemudian corong C dicuci dengan air destilata. - 10 ml larutan NaOH 30% ditambahkan melalui corong C dan corong C dicuci kembali dengan air destilata, kemudian antara corong C dan botol D ditutup dengan cara dijepit. - Campuran alkalin dalam botol destilasi dipanaskan dengan uap selama minimum 10 menit estela kondensasi terlihat pada kondensor. - Larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan larutan NaOH 0,05 N dan catat hasilnya. - Prosedur titrasi yang sama juga dilakukan pada blanko. - Kadar protein (%) = 0,0007 *1 x (Vb Vs) x F x 6,25 *2 x 20 x 100 S Di mana : Vs = volume NaOH 0,05 N untuk sampel F = faktor koreksi untuk larutan standar NaOH 0,05 N S = berat sampel (g) *1 = setiap ml NaOH 0,05 N equivalent dengan 0,0007 g nitrogen *2 = faktor nitrogen, protein diasumsikan pada 16% nitrogen, faktor 6,25 (100/16) digunakan untuk mengkonversi total nitrogen ke total protein. d. Prosedur Analisis Lemak - Labu ekstraksi dipanaskan pada suhu 110 o C selama 1 jam, setelah itu didinginkan selama 30 menit dalam desikator. Labu dipanaskan kembali selama 30 menit dan dinginkan, kemudian ditimbang. Proses tersebut diulang sampai tidak ada perbedaan bobot labu (lebih kecil dari dari 0,3 mg). Bobot labu ekstraksi (A). - Sampel ditimbang sebanyak 1 sampai 2 gram dan dimasukkan ke dalam tabung filter kemudian ditutup dengan lapisan tipis dari katon absorbent dan dikeringkan dalam oven pada suhu 90 sampai 100 o C selama 2 sampai 3 jam. - Tabung filter ditempatkan di dalam ruang ekstraksi dari alat soxhlet dan dihubungkan dengan kondensor labu ekstraksi yang telah diisi dengan 100 ml petrolium ether, sebelumnya ether dipanaskan terlebih dahulu pada labu ekstraksi dalam water bath pada suhu 60 sampai 70 o C selama 16 jam. - Labu ekstraksi dipanaskan pada suhu 100 o C, kemudian ditimbang (B) - Kadar lemak (%) = (B-A) x 100 Berat sampel
e. Prosedur analisis serat kasar - Kertas filter dipanaskan dalam oven pada suhu 110 o C, kemudian didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Dipanaskan kembali selama 30 menit dan dinginkan, kemudian ditimbang. Proses tersebut diulang sampai tidak ada perbedaan bobot (lebih kecil dari 0,3 mg). - Cawan porselin dipanaskan pada suhu 550 o C selama 1 jam di dalam muffle furnase, kemudian dibiarkan suhu muffle furnase turun sampai 110 o C, selanjutnya cawan porselin dikeluarkan dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit. - Sampel sebanyak 1 sampai 2 gram ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer, (kalau kandungan lemak sampel > 1% dilakukan ekstraksi dengan larutan ether untuk memindahkan lemak), tambahkan 200 ml H 2 SO 4 1,25% panas dan 1 ml iso-amyl alkohol sebagai agen antifoam. - Labu dihubungkan dengan kondensor dan dididihkan selama 30 menit, labu diputar secara periodik agar bahan tidak mengendap. - Labu dipindah dan cairan disaring melalui filter fiber nilon dalam sebuah corong, kemudian dicuci sebanyak 3 kali berturut-turut dengan 40 sampai 50 ml air panas. - Residu yang terdapat dalam filter dipindahkan ke dalam labu original yang berisi sedikit air panas dan ditambahkan dengan 50 ml NaOH 5% panas dan 1 ml iso-amyl alkohol, kemudian diencerkan dengan 200 ml air panas. - Selanjutnya labu dididihkan dan cairan disaring kembali dengan filter fiber nilon, kemudian dicuci sebanyak 5 kali berturut-turut dengan 40 sampai 50 ml air panas. - Residu yang terdapat pada filter dipindahkan dalam kertas filter dan dicuci dengan air, tambahkan 15 ml alkohol dan 10 ml ether. Selanjutnya dikeringkan pada suhu 110 o C sampai tercapai bobot konstan. - Kertas saring dimasukkan ke dalam cawan porselin dipanaskan dalam muffle furnace pada suhu 550 o C selama 1 jam atau sampai beratnya konstan, kemudian didinginkan. - Kadar serat kasar (%) = Berat yang hilang selama pembakaran x 100 Berat sampel
Lampiran 5. Penentuan Kadar Asam Fitat Kadar asam fitat ditentukan dengan metoda Davies dan Reid, (1979). Ekstrak untuk analisis diperoleh dengan cara berikut: sampel dalam bentuk tepung sebanyak 1 g disuspensikan dalam 50 ml air larutan HNO3 0,5 M. Suspensi ini diaduk menggunakan magnetic stirrer selama 2 jam pada suhu ruang kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh digunakan untuk menetapkan kadar asam fitat, Penentuan kadar asam fitat dilakukan dengan cara berikut. Dalam tabung reaksi yang berisi 0,5 ml filtrat, ditambahkan 0,9 ml HNO3 0,5 ml dan 1 ml FeCl3. Kemudian tabung reaksi ditutup, lalu direndam dalam air mendidih selama 20 menit. Setelah didinginkan, ditambah 5 ml amil alkohol dan 1 ml larutan amonium tiosianat. Selanjutnya disentnifus pada kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Setelah terbentuk dua lapisan, lapisan amil alkohol diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer (Coleman junior 11 Spectrophotometer G-20) pada panjang gelombang 465 nmdengan blangko amil alkohol, 15 menit setelah penambahan amonium tiosianat. Hasil yang diperoleh dibandingkan pada kurva standar Na-fitat yang diperoleh dengan cara seperti di atas. Untuk pembuatan kurva standar Na-fitat, konsentrasi larutan Na-fitat yang digunakan adalah 0,025 mm, 0,05 mm, 0,075 mm, 0,1 mm, 0,125 mm, 0,15 mm, 0,175mM dan 0,2 mm. Kadar asam fitat dalam sampel dinyatakan dalam mg/g bahan kering.
Lampiran 6. Kadar glukosa darah ikan selama 24 jam perlakuan jam ke- 0% 0 3 6 9 12 15 18 21 24 87 136 172 188 173 144 122 102 80 90 145 166 173 159 135 99 98 80 85 141 159 175 162 141 116 95 86 rerata 87.33 140.67 165.67 178.67 164.67 140.00 112.33 98.33 82.00 sd 2.52 4.51 6.51 8.14 7.37 4.58 11.93 3.51 3.46 5% 87 132 169 199 172 145 120 111 80 90 155 177 177 169 142 130 99 85 85 142 158 184 166 144 98 112 85 rerata 87.33 143.00 168.00 186.67 169.00 143.67 116.00 107.33 83.33 sd 2.52 11.53 9.54 11.24 3.00 1.53 16.37 7.23 2.89 10% 87 130 171 186 185 132 118 86 80 90 136 177 194 188 155 121 115 91 85 135 166 191 179 148 132 92 89 rerata 87.33 133.67 171.33 190.33 184.00 145.00 123.67 97.67 86.67 sd 2.52 3.21 5.51 4.04 4.58 11.79 7.37 15.31 5.86 15% 87 122 166 198 181 146 122 112 86 90 132 172 192 184 151 130 119 92 85 128 177 194 182 151 132 116 91 rerata 87.33 127.33 171.67 194.67 182.33 149.33 128.00 115.67 89.67 sd 2.52 5.03 5.51 3.06 1.53 2.89 5.29 3.51 3.21 20% 87 129 159 188 182 161 126 113 88 90 136 167 195 185 164 135 125 92 85 135 171 191 178 156 131 119 82 rerata 87.33 133.33 165.67 191.33 181.67 160.33 130.67 119.00 87.33 sd 2.52 3.79 6.11 3.51 3.51 4.04 4.51 6.00 5.03