Lampiran 1. Analisis Kadar Pati Dengan Metode Luff Schroll (AOAC, 1995) Bahan sejumlah kurang lebih 1 g ditimbang. Sampel dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 200 ml HCl 3%. Sampel kemudian dihidrolisis selama 1-3 jam di dalam otoklaf dengan suhu 105 o C. Setelah terhidrolisis, sampel selanjutnya dinetralkan dengan NaOH 40%. Tetapi sebelumnya sampel harus didinginkan terlebih dahulu. Selanjutnya sampel dimasukkan ke dalam labu takar 250 ml dan ditambahkan air destilata sampai mencapai tanda tera. Sampel sebanyak 10 ml dipipet kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml dan ditambahkan 25 ml larutan Luff Schroll. Larutan dididihkan selama 10 menit pada pendingin tegak. Setelah itu sampel didinginkan di bawah air mengalir (jangan dikocok). Kemudian pada sampel ditambahkan 20 ml H 2 SO 4 25%. Larutan dititrasi menggunakan Na 2 S 2 O 3 0,1 N dengan indikator kanji (3-5 tetes) sampai hilang warnanya. Blanko dibuat dengan sampel berupa 25 ml air destilata dan 25 ml larutan Luff Schroll. Kadar pati dihitung dengan rumus: Keterangan: Kadar pati (%) = a x 0.9 x p x 100 % mg contoh a : jumlah mg glukosa, fruktosa dan gula invert (C 6 H 12 O 6 ) p : faktor pengenceran (jumlah mg C 6 H 12 O 6 ditentukan berdasarkan selisih titrasi larutan tiosulfat antara blanko dan contoh menurut tabel Luff Schroll) ml selisih titrasi tiosulfat 0,1 N jumlah mg C 6 H 12 O 6 ml selisih titrasi tiosulfat 0,1 N 1 2.4 13 33.0 2 4.8 14 35.7 3 7.2 15 38.5 4 9.7 16 41.3 5 12.2 17 44.2 6 14.7 18 47.1 7 17.2 19 50.0 8 19.8 20 53.0 9 22.4 21 56.0 10 25.0 22 59.1 11 27.6 23 62.2 12 30.3 24 - jumlah mg C 6 H 12 O 6 40
Lampiran 2. Diagram Alir Pembuatan Sirup Dekstrin Pati Sagu (Akyuni, 2004) Pati Sagu CaCO 3 200 ppm Pencampuran Air Suspensi Pati Sagu 30% (b/v) NaOH Pengaturan ph 6,2 Gelatinisasi (105 o C, 5 menit) α-amilase (1478,12 U/kg pati) Likuifikasi (90 o C, ph 6,2, 210 menit) Sirup Dekstrin 41
Lampiran 3. Analisis Total Gula Sirup Dekstrin (Dubois et. al, 1956) a. Kurva Standar Glukosa (Metode Fenol) Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar fenol yang digunakan. Pembuatan kurva standar total gula (metode fenol) adalah sebagai berikut: 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 μg glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5% dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan dengan cepat. Biarkan selama 10 menit, kocok lalu tempatkan dalam penangan air selama 15 menit. Absorbansinya diukur pada 490 nm. Gambar 17. Kurva Standar Total Gula (Metode Fenol) b. Total Gula (Metode Fenol) Total gula pada sirup dekstrin sagu diukur dengan menggunakan Metode Fenol. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva standar fenol hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel. 42
Lampiran 4. Diagram Alir Pembuatan Etanol Menggunakan Sirup Dekstrin Sirup Dekstrin Pengaturan ph 5 Sumber N, Trace Elemen Sterilisasi 121 o C, 15 menit Inokulum 10% v/v Fermentasi (30 o C, 24 Jam) Sampel Etanol Analisa Hasil Analisa 43
Lampiran 5. Analisis Hasil Fermentasi a. Total Biomassa (Hartoto, 1992) Sebanyak 1,5 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah diketahui bobot awalnya. Setelah itu sampel disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit. Kemudian dilakukan pemisahan antara supernatan dengan biomassanya. Tabung eppendorf yang telah berisi biomassa dimasukkan akuades steril sebanyak 1,5 ml kemudian dilakukan sentrifugasi kembali. Pemisahan antara akuades dan biomassa dilakukan, kemudian tabung eppendorf yang berisi biomassa dikeringkan pada suhu 50 o C selama 24 jam. Bobot kering biomassa adalah bobot tabung yang berisi biomassa yang telah dikeringkan dikurangi dengan bobot awal tabung. Bobot sel kering (g/l) = bobot biomassa kering ml sampel b. Kadar etanol (Mc Nair dan Bonelli, 1988). Pengukuran kadar etanol sampel dilakukan dengan menggunakan Gas Chromatography. Penentuan dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan waktu retensi standar etanol. Standar etanol yang diinjeksikan memiliki konsentrasi 99,8% (v/v). Menurut Wulandari (2007), Pengukuran kadar etanol juga dapat dilakukan dengan metode Conway, sebagai berikut : 1) Buat larutan : Larutan A : Na 2 CO 3 jenuh Larutan B : 0,37 g K 2 Cr 2 O 7 dilarutkan dalam 15 ml aquades. Tambahkan 28 ml H 2 SO 4 pekat secara perlahan-lahan sambil diaduk perlahan menggunakan magnetic stirrer. Encerkan sampai 50 ml. Larutan ini dapat disimpan lama. Larutan C: larutan stok alkohol dibuat dengan mengencerkan 1 ml alkohol PA dengan aquades hingga 250 ml. 2) Buat kurva standar alkohol (absorbansi) dari deret : a) 2ml Larutan B + 1 ml aquades b) 2ml Larutan B + 0,2 ml Larutan C + 0,8 ml aquades 44
c) 2ml Larutan B + 0,4 ml Larutan C + 0,6 ml aquades d) 2ml Larutan B + 0,6 ml Larutan C + 0,4 ml aquades e) 2ml Larutan B + 0,8 ml Larutan C + 0,2 ml aquades f) 2ml Larutan B + 1 ml Larutan C 3) Sampel diencerkan terlebih dahulu sebelum direaksikan. 4) Reaksikan 1 ml contoh (yang telah diencerkan), 1ml larutan A, dan 2 ml larutan B. Penempatan reaksi dapat dilihat pada gambar berikut. Larutan A Larutan B Larutan contoh 5) Tutup rapat cawan conway dan campurkan Na 2 CO 3 dan contoh hasil fermentasi dengan memutar cawan secara perlahan. 6) Simpan cawan conway selama 2 jam pada 30 o C. 7) Larutan yang ada di bagian tengah cawan dipindahkan pada tabung spektro untuk dibaca absorbansinya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 605 nm. Apabila warna larutan biru maka contoh harus diencerkan kembali. 8) Bandingkan absorbansi dengan kurva standar dari stok alkohol. 0.8 Absorbansi 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Kadar Etanol (%) y = 1.74x + 0.029 R² = 1 Kurva Standar Etanol (Metode Conway) Linear (Kurva Standar Etanol (Metode Conway)) 45
c. ph Pengukuran ph dilakukan dengan menggunakan ph meter. Sebelum digunakan, ph meter dikalibrasi terlebih dahulu ke dalam ph 4 dan ph 7. Setelah dicuci dengan akuades, elektroda dimasukkan ke dalam contoh yang akan diukur ph-nya. Nilai ph adalah nilai yang ditampilkan setelah menunjukkan angka konstan. Pengukuran ph dilakukan setiap 6 jam sekali. d. Total Gula Metode Fenol (Dubois et al., 1956) Total gula akhir diukur dengan menggunakan Metode Fenol. Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva standar fenol yang digunakan. Pembuatan kurva standar fenol adalah sebagai berikut: 2 ml larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 μg glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml larutan fenol 5% dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan dengan cepat. Biarkan selama 10 menit, kocok lalu tempatkan dalam penangan air selama 15 menit. Absorbansinya diukur pada 490 nm. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva standar fenol hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel. 46
Lampiran 6. Data Total Biomassa 1. Penelitian Pertama Total biomassa pada laju aerasi 1vvm (g/l) Jam ke- 18% 24% 30% 36% 0 0,59 0,57 0,40 0,49 6 1,70 2,01 2,32 1,93 12 2,04 2,42 2,82 2,31 18 2,13 2,50 2,91 2,41 24 2,19 2,57 2,98 2,47 Total biomassa pada laju aerasi 2vvm (g/l) Jam ke- 18% 24% 30% 36% 0 0,49 0,49 0,46 0,33 6 1,56 1,71 1,93 1,63 12 1,96 2,00 2,34 2,04 18 2,04 2,18 2,52 2,25 24 2,02 2,17 2,57 2,23 2. Penelitian Lanjutan Total biomassa pada penelitian lanjutan (g/l) Jam ke- Aerasi penuh Aerasi dihentikan 0 1,03 0,96 6 2,30 2,20 12 2,85 2,48 18 3,18 2,55 24 3,22 2,56 47
Analisa sidik ragam pertumbuhan biomassa, pada penelitian utama Derajat Jumlah Kuadrat Sumber Bebas Kuadrat Tengah Keragaman (DB) (JK) (KT) f-hitung f-tabel Aerasi 1 0,35 0,35 69,08 0,01 Error 2 0,01 0,01 Total 3 0,36 Aerasi Ulangan Rata-rata Standar Deviasi Penuh 2 2,19 0,1 Dihentikan 2 1,6 0,02 Keterangan : Nilai f-tabel nilai α (0,05), menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95% terdapat pengaruh nyata jumlah biomassa yang dihasilkan antara perlakuan dengan aerasi penuh dan aerasi yang dihentikan. 48
Lampiran 7. Data Kadar Etanol 1. Penelitian Pertama Jumlah etanol rata-rata pada penelitian pertama (g/l) 18% 24% 30% 36% 1 vvm 9,50 13,90 19,25 20,55 2 vvm 8,20 9,20 9,30 8,50 2. Penelitian Lanjutan Jumlah etanol pada penelitian lanjutan (g/l) Aerasi penuh Aerasi dihentikan Ulangan 1 21,64 25,05 Ulangan 2 20,86 24,83 Rata-rata 21,25 24,94 Analisa sidik ragam etanol, pada penelitian utama Derajat Jumlah Kuadrat Sumber Bebas Kuadrat Tengah Keragaman (DB) (JK) (KT) f-hitung f-tabel Aerasi 1 13,62 13,62 82,92 0,01 Error 2 0,33 0,16 Total 3 13,94 Aerasi Ulangan Rata-rata Standar Deviasi Penuh 2 21,25 0,55 Dihentikan 2 24,94 0,16 Keterangan : Nilai f-tabel nilai α (0,05), menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95% terdapat pengaruh nyata jumlah etanol yang dihasilkan antara perlakuan dengan aerasi penuh dan aerasi yang dihentikan. 49
Lampiran 8. Data ph 1. Penelitian Pertama Nilai ph pada fermentasi dengan laju alir 1vvm Jam ke- 18% 24% 30% 36% 0 5,01 5,06 5,09 5,08 6 3,96 3,96 3,98 3,94 12 3,80 3,68 3,72 3,65 18 3,84 3,71 3,69 3,66 24 3,82 3,78 3,70 3,68 Nilai ph pada fermentasi dengan laju alir 2vvm Jam ke- 18% 24% 30% 36% 0 5,10 5,08 5,09 5,14 6 4,23 4,23 4,14 4,12 12 3,80 3,79 3,81 3,77 18 3,72 3,70 3,69 3,73 24 3,66 3,74 3,70 3,69 2. Penelitian Lanjutan Jam ke- Aerasi penuh Aerasi dihentikan 0 5,00 4,80 6 3,35 3,40 12 3,15 3,25 18 3,10 3,20 24 3,05 3,15 50
Lampiran 9. Data Total Gula 1. Penelitian Pertama Total gula pada laju aerasi 1vvm (g/l) Jam ke- 18% 24% 30% 36% B 190,70 228,26 296,78 360,46 0 157,86 188,56 268,49 325,78 6 147,16 173,51 237,76 308,34 12 143,99 171,01 229,51 298,40 18 141,75 158,81 227,02 287,27 24 139,53 155,97 220,02 281,19 2. Penelitian Lanjutan Total gula pada penelitian lanjutan (g/l) Jam ke- Aerasi penuh Aerasi dihentikan B 305,97 302,76 0 278,51 275,53 6 250,91 244,66 12 243,00 235,29 18 233,92 227,79 24 230,50 207,45 51
Lampiran 10. Analisis Sidik Ragam Kinetika Fermentasi 1. Analisa sidik ragam Yp/s, pada penelitian utama Derajat Jumlah Kuadrat Sumber Bebas Kuadrat Tengah Keragaman (DB) (JK) (KT) f-hitung f-tabel Aerasi 1 1,82.10-4 1,82.10-4 4,31 0,17 Error 2 0,85.10-4 0,42.10-4 Total 3 2,67.10-4 Aerasi Ulangan Rata-rata Standar Deviasi Penuh 2 0,44 0,01 Dihentikan 2 0,43 0 Keterangan : Nilai f-tabel > nilai α (0,05), menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95% tidak terdapat pengaruh nyata nilai rendemen produk per substrat yang didapatkan antara perlakuan dengan aerasi penuh dan aerasi yang dihentikan. 2. Analisa sidik ragam Yx/s, pada penelitian utama Derajat Jumlah Kuadrat Sumber Bebas Kuadrat Tengah Keragaman (DB) (JK) (KT) f-hitung f-tabel Aerasi 1 3,42.10-4 3,42.10-4 37 0,03 Error 2 0,19.10-4 0,09.10-4 Total 3 3,61.10-4 Aerasi Ulangan Rata-rata Standar Deviasi Penuh 2 0,05 0,01 Dihentikan 2 0,03 0 52
Keterangan : Nilai f-tabel nilai α (0,05), menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95% terdapat pengaruh nyata nilai rendemen biomassa per substrat yang didapatkan antara perlakuan dengan aerasi penuh dan aerasi yang dihentikan. 3. Analisa sidik ragam Yp/x, pada penelitian utama Derajat Jumlah Kuadrat Sumber Bebas Kuadrat Tengah Keragaman (DB) (JK) (KT) f-hitung f-tabel Aerasi 1 35,68 35,68 127,81 0,01 Error 2 0,56 0,28 Total 3 36,24 Aerasi Ulangan Rata-rata Standar Deviasi Penuh 2 9,7 0,68 Dihentikan 2 15,68 0,31 Keterangan : Nilai f-tabel nilai α (0,05), menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95% terdapat pengaruh nyata nilai rendemen produk per biomassa yang didapatkan antara perlakuan dengan aerasi penuh dan aerasi yang dihentikan. 53