MATERI DAN METODE Waktu dan Lokasi Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Agustus 2010 sampai Februari 2011 di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi untuk tahap pembuatan biomineral, sedangkan analisis dilakukan pada bulan April 2011 sampai Agustus 2011 di Laboratorium Nutrisi Ternak Perah, Laboratorium Pusat Antar Universitas (PAU), dan Laboratorium Balai Penelitian Tanah, Bogor. Materi Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah cairan rumen, dengan bahan tambahan berupa HCl 10%, agar-agar, zeolit alam Lampung dalam bentuk serbuk (CV. Minamata), kapur (CaCO 3 ) dalam bentuk serbuk, tepung terigu, larutan McDougall, larutan HgCl 2 jenuh, larutan Na 2 CO 3, asam borat (H 3 BO 3 ), vaselin, H 2 SO 4 0,005 N, H 2 SO 4 15%, NaOH 0,5 N, HCl 0,5 N, larutan pepsin-hcl, gas CO 2, phenolphthalein, aquades dan air panas. Kandungan mineral pada bahan-bahan utama penelitian dapat dilihat pada Tabel 4. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain termos, kain penyaring, shaker water bath, tabung fermentor, autoklaf, sentrifuse, tabung sentrifuse, cawan Conway, seperangkat alat destilasi, pendingin Leibig, labu Erlenmeyer, buret, pipet, oven 60 dan 105 C, tanur listrik, eksikator, cawan porselen, timbangan digital, gelas ukur, spatula, pengaduk kaca, kertas saring Whatman no. 41, kain penyaring, bulp, pipet volumetrik, kantung plastik tahan panas, termos, gas CO 2 dan kompor. Peubah yang Diamati Peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Konsentrasi NH 3 (Amonia) yang diukur dengan menggunakan metode mikrodifusi Conway 2. Konsentrasi VFA yang diukur dengan teknik destilasi uap 3. Degradabilitas bahan kering (DBK) dan bahan organik (DBO) 4. Kecernaan bahan kering (KCBK) dan bahan organik (KCBO) yang diukur dengan metode Tilley dan Terry (1963) yang telah dimodifikasi oleh Sutardi (1979). 15
Tabel 4. Kandungan Mineral Bahan Penelitian Makro (%) : Mineral Mikro (ppm) : Bahan Agar-agar Kapur Tepung Terigu Zeolit Ca 0,13 65,40 0,11 4,10 P 0,81 0,48 0,76 0,67 K 0,03 0 0,09 0,49 Na 0,10 0 0 1,24 Cl 0,05 0,03 0,07 0,04 S 0,05 0,04 0,05 0,04 Mg 0,05 0,35 0,06 0,94 Fe 280 667 198 12122 Al 0 250 0 26155 Mn 11 152 5 266 Cu 0 1,3 0 24,8 Zn 0 0 69,8 37,1 Co td 0,7 td 3,4 Ni 13,3 7,0 0 2,2 Cr td 2,0 0 2,8 Mo 26 63 td 8 Se td td td td Keterangan: Hasil Analisis Laboratorium Tanah, Balai Penelitian Tanah Bogor (2011) td (tidak terdeteksi) Limit Deteksi untuk mineral: Mo: 0,0024 ppm; Ni: 0,0009 ppm dan Se: 0,3 ppm Prosedur Pembuatan Biomineral dan penerapan pelakuan Bahan utama yang digunakan yaitu cairan rumen yang diperoleh dari RPH Bubulak, Bogor. Adapun proses pembuatan biomineral cairan rumen antara lain : isi rumen segar diperas untuk menghasilkan cairan rumen, selanjutnya ditambahkan dengan larutan HCl 10% hingga ph rumen menjadi 5.5, kemudian cairan rumen disaring kembali. Setelah disaring, larutan tersebut diendapkan selama 1-2 hari dan diambil endapannya. Cairan yang berada diatas endapan dibuang sedikit demi sedikit dengan maksud agar endapan tersebut tidak kembali larut dan tercampur dalam 16
cairan. Endapan yang diperoleh kemudian dicampur dengan bahan carrier. Bahan carrier yang digunakan berupa agar-agar yang telah dilarutkan dalam air mendidih dan dicampur dengan terigu dengan komposisi tertentu. Pada tahap ini juga dilakukan penambahan bahan adsorben berupa zeolit dan kapur (CaCO 3 ) sesuai perlakuan (3% dan 6% bobot endapan). Bahan campuran tersebut selanjutnya dikeringkan dengan dijemur di bawah matahari selama 3-5 hari (sampai kering), kemudian dikeringkan menggunakan oven 60 C selama 1-2 hari. Bahan yang telah kering tersebut digiling hingga berbentuk serbuk. Proses pembuatannya dapat diperlihatkan pada Gambar 2. Pengukuran Fermentabilitas in vitro Sampel biomineral perlakuan dimasukkan sebanyak 1 gram ke dalam tabung fermentor bersama dengan 12 ml larutan McDougall (Tabel 5) dan 8 ml cairan rumen. Tabung fermentor dialiri dengan gas CO 2 dan ditutup dengan penutup karet berventilasi. Tabung fermentor tersebut diinkubasikan dalam shaker water bath selama 0, 1, 2 dan 3 jam pada suhu 39 C. Selanjutnya ditambahkan HgCl 2 jenuh sebanyak dua tetes yang bertujuan untuk membunuh mikroba rumen agar proses fermentasi berhenti. Tabung fermentor kemudian disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Cairan yang terbentuk atau disebut supernatan ditampung, untuk kemudian dianalisis konsentrasi NH 3 dan VFA total. Sedangkan residu atau endapannya digunakan dalam analisis degradabilitas. Tabel 5. Komposisi Larutan McDougall Bahan Konsentrasi (g/ 6 liter) NaHCO 3 58,8 NaHPO 4.7H 2 O 42 KCl 3,42 NaCl 2,82 MgSO 4. 7H 2 O 0,72 CaCl 2 0,24 Sumber : General Laboratory Procedure (1966) 17
Isi rumen diperas Cairan rumen Ditambah dengan larutan HCl 10% hingga ph 5,5 Disaring Endapan cairan rumen Diambil padatan yang telah mengendap Dicampur bahan carrier serta penambahan perlakuan (Zeolit dan Kapur) Dikeringkan sinar matahari 3-5 hari Atau dengan oven 60 C selama 2-3 hari Digiling Biomineral Gambar 2. Proses pembuatan Biomineral (Tjakradidjaja et al., 2007) Analisis NH 3 dan VFA Analisis ini meliputi analisis konsentrasi NH 3 dan VFA. Analisis NH 3 dilakukan dengan menggunakan teknik mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedure, 1966). Cawan Conway diolesi vaselin bagian bibir dan tutupnya. Supernatan sebanyak 1 ml ditempatkan pada salah satu ruang sekat cawan dan sisi yang lain diisi dengan Na 2 CO 3 jenuh, sedangkan cawan kecil diisi dengan 1 ml asam borat (H 3 BO 3 ) dan cawan lalu ditutup rapat. Selanjutnya cawan digerakkan hingga semua isinya tercampur rata dan didiamkan 24 jam. Asam borat kemudian dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005N hingga warnanya merah muda. 18
Konsentrasi NH 3 (mm) = ml H 2 SO 4 x N H 2 SO 4 x 100 Berat sampel x BK Sampel Sedangkan analisis VFA dilaksanakan dengan teknik steam destilation (General Laboratory Procedure, 1966). Supernatan sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung destilasi dan ditambahkan 1 ml larutan H 2 SO 4 15%. Dinding tabung dibilas dengan aquades dan ditutup dengan sumbat karet. Tabung destilasi dimasukkan ke labu yang berisi air mendidih tanpa menyentuh permukaan atau dasar air tersebut. Ujung pipa lainnya dihubungkan ke alat pendingin Leibig, destilat yang berasal dari proses pendinginan ditampung dalam labu Erlenmeyer yang diletakkan di bawah pendingin Leibig. Setelah diperoleh jumlah destilat sebanyak 250 ml, lalu ditambahkan 1 tetes indikator phenolphthalein, selanjutnya dititrasi sampai berubah warna menjadi tidak berwarna atau bening. VFA Total = (a-b) x N HCl x 1000/5 ml Berat sampel x BK Sampel Keterangan: a = Volume titran blanko b = volume titran sampel Pengukuran Degradabilitas Residu hasil fermentasi in vitro (metode Tilley dan Terry (1963) yang dimodifikasi oleh Sutardi (1979)) disaring dengan menggunakan kertas saring dengan bantuan pompa vakum. Hasil saringan dimasukkan ke dalam cawan porselen dan dikeringkan di dalam oven 105 C selama 24 jam, selanjutnya dimasukkan ke dalam tanur 600 C selama enam jam. Cawan dan residu kemudian dimasukkan ke dalam eksikator selama ± 15 menit untuk menstabilkan suhunya. Tahap terakhir cawan dan residu dapat ditimbang bobotnya. BK Sampel (g) (BK residu (g) BK blanko (g)) DBK (%) = x 100% BK Sampel (g) BO Sampel (g) (BO residu (g) BO blanko (g)) DBO (%) = x 100% BO Sampel (g) 19
Keterangan: DBK = Degradabilitas Bahan Kering DBO = Degradabilitas Bahan Organik Pengukuran Kecernaan Sampel biomineral setiap perlakuan sebanyak 1 gram dimasukkan ke dalam tabung fermentor bersama dengan 12 ml larutan McDougall dan 8 ml cairan rumen. Tabung fermentor dialiri dengan gas CO 2 dan ditutup dengan penutup karet berventilasi. Tabung fermentor tersebut diinkubasi dalam shaker water bath selama ± 24 jam pada suhu 39 C. Proses fermentasi dihentikan dengan menambah larutan HgCl 2 jenuh sebanyak dua tetes. Tabung fermentor kemudian disentrifuse pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Selanjutnya supernatan dibuang dan sebanyak 20 ml larutan pepsin-hcl ditambahkan ke dalam tabung yang berisi residu. Proses inkubasi dilanjutkan selama 24 jam secara aerob pada suhu 39 o C. Residu selanjutnya disaring dengan kertas saring menggunakan pompa vakum dan ditempatkan pada cawan porselen, kemudian dikeringkan di dalam oven 105 C selama 24 jam. Setelah sampel didinginkan di dalam eksikator hingga mencapai suhu ruang yang dilanjutkan dengan penimbangan, sampel kering lalu diabukan di dalam tanur pada suhu 600 C selama enam jam. Cawan dan residu kemudian dimasukkan ke dalam eksikator selama ± 15 menit untuk menstabilkan suhunya. Tahap terakhir cawan dan residu dapat ditimbang bobotnya. BK Sampel (g) (BK residu (g) BK blanko (g)) KCBK = x 100% BK Sampel (g) BO Sampel (g) (BO residu (g) BO blanko (g)) KCBO = x 100% BO Sampel (g) Keterangan: KCBK = Kecernaan Bahan Kering KCBO = Kecernaan Bahan Organik 20
Rancangan Percobaan Perlakuan Penelitian ini menggunakan 5 macam perlakuan dengan masing-masing 4 ulangan. Perlakuan tersebut antara lain: A1 = Biomineral kontrol 0% (tanpa penambahan) A2 = Biomineral dengan perlakuan penambahan kapur 3% A3 = Biomineral dengan perlakuan penambahan kapur 6% A4 = Biomineral dengan perlakuan penambahan zeolit 3% A5 = Biomineral dengan perlakuan penambahan zeolit 6% Model 1. Rancangan untuk percobaan fermentabilitas Rancangan percobaan yang digunakan dalam pengukuran hasil fermentasi penelitian ini adalah rancangan acak kelompok (RAK) berpola faktorial 5 x 4 dengan faktor A adalah perlakuan biomineral dan faktor B merupakan waktu inkubasi. Perlakuan biomineral adalah A1 = Biomineral tanpa perlakuan penambahan bahan adsorben (Kontrol), A2 = Biomineral dengan perlakuan penambahan kapur 3%, A3 = Biomineral dengan perlakuan penambahan kapur 6%, A4 = Biomineral dengan perlakuan penambahan zeolit 3%, dan A5 = Biomineral dengan perlakuan penambahan zeolit 6%. Faktor B merupakan waktu inkubasi, yaitu 0, 1, 2 dan 3 jam. Empat kelompok cairan rumen sapi digunakan sebagai ulangan. Model matematis dari rancangan adalah sebagai berikut : Y ijk = + i + j + k + j k + ijk Keterangan : Y ijk i j k j k ijk = Nilai pengamatan kelompok ke-i, faktor A ke-j dan faktor B ke-k = Rataan umum pengamatan = Pengaruh kelompok (cairan rumen) ke-i = Pengaruh faktor A (perlakuan) ke-j = Pengaruh faktor B (waktu inkubasi) ke-k = Pengaruh interaksi faktor A ke-j dan fator B ke-k = Galat percobaan untuk kelompok ke-i, faktor A ke-j dan faktor B ke-k 21
2. Rancangan untuk percobaan kecernaan Rancangan yang digunakan untuk pengukuran kecernaan dalam penelitian ini adalah rancangan acak kelompok (RAK) dengan empat ulangan. Model matematis dari rancangan ini adalah sebagai berikut: Y ij = + i + j + ij Keterangan : Y ij i ß j ij = Nilai pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j = Rataan umum = Efek perlakuan ke-i = Efek kelompok ke-j = Eror perlakuan ke-i dan ulangan ke-j Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian dianalisis menggunakan analisa ragam (Analyses of Variance, ANOVA) dan perbedaan di antara perlakuan diuji dengan Uji Ortogonal Kontras (Steel dan Torrie, 1993). 22