MATERI DAN METODE. Lokasi dan Waktu. Materi

Transkripsi

1 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Biokimia, Fisiologi dan Mikrobiologi Nutrisi, Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Ilmu Ternak Perah, Departemen Ilmu Nutrisi dan Teknologi Pakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Waktu penelitian ini berlangsung dari bulan Februari sampai Juni Materi Bahan Bahan yang digunakan untuk pembuatan sampel ransum perlakuan adalah hijauan segar (rumput lapang), pakan penguat, ekstrak lerak, dan cairan rumen. Bahan-bahan lain yang dibutuhkan dalam penelitian adalah larutan McDougall, larutan HgCl 2 jenuh, gas CO 2, media BHI (Brain Heart Infusion), media tumbuh yang spesifik, media pengencer, agar bacto, aquades, larutan buffer fosfat NaCl 0,005 M ph 7,2. Bahan untuk uji VFA antara lain larutan NaOH 0,5N, larutan HCl 0,5N, H 2 SO 4 15%, NaCl 1%, HCl 1%, HCl 10% dan mineral (Ca, P, Mg, dan S). Bahan yang digunakan untuk uji NH 3 antara lain asam borat (H 3 BO 3 ), vaselin, indikator phenolphthalien (PP), Na 2 CO 3 jenuh, H 2 SO 4 0,005 N dan Na 2 SO 4. Bahan yang digunakan untuk pengukuran ph rumen adalah alat pengukur ph meter. Cairan Rumen Cairan rumen yang digunakan berasal dari sapi potong yang dipasang fistula pada bagian rumen yang dipelihara di Laboratoriun Lapang Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor, Bogor. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain neraca analitik, eksikator, tabung film, botol plastik ukuran sedang counting chamber, kain penyaring, shaker waterbath, autoclave, penangas air, roller tube, termos, kain belacu, karet berventilasi, cawan Conway, sentrifus, vakum, labu penyuling, labu Erlenmeyer, tabung Hungate, tanur, gegep, magnetic stirrer, destilator, timbangan digital, buret, kondensor, tabung fermentor, tabung reaksi, tutup karet, pipet volumetik, mikroskop, bulp dan cawan porselen. Metode

2 Ekstraksi Lerak Ekstraksi lerak diperoleh dengan cara mengekstraksi buah lerak dengan metanol. Buah lerak dibersihkan, dikeringkan selama jam (45 o C), setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven (60 o C). Buah lerak yang sudah kering digiling lalu dimaserasi dengan perbandingan tepung lerak dan metanol 1 : 4. Hasil maserasi disaring dengan menggunakan kertas saring, kemudian supernatan yang dihasilkan dikeringbekukan agar menjadi bubuk menggunakan alat freezer dryer (Wina et al., 2006). Pengukuran KCBK dan KCBO Analisis KCBK dan KCBO pada penelitian ini menggunakan metode (Tilley & Terry, 1963). Pembuatan Larutan Pepsin. Sebanyak 2,8 gram pepsin (1:7000) dilarutkan dalam 850 ml air bebas ion, kemudian ditambahkan 17,8 ml HCl pekat dan campuran dimasukkan ke dalam labu takar. Air ditambahkan hingga permukaan mencapai tanda tera. Pengukuran KCBK dan KCBO. Sampel dalam tabung fermentor yang sudah diinkubasi 48 jam dan ditetesi HgCl 2 disentrifusi dengan kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Supernatan dan endapan dipisahkan, kemudian endapan yang terbentuk ditambahkan 50 ml larutan pepsin-hcl 0,2%. Campuran tersebut diinkubasi selama 48 jam tanpa tutup karet. Setelah 48 jam campuran endapan-pepsin disaring menggunakan kertas saring whatman No.41 dengan bantuan pompa vacum. Hasil saringan (residu) dimasukkan ke cawan porselen yang sebelumnya sudah diketahui bobot kosongnya. Bahan kering diperoleh dengan cara mengeringkan sampel dalam oven 105 o C selama 24 jam. Selanjutnya bahan dalam cawan dipijarkan atau diabukan dalam tanur listrik selama 6 jam pada suhu o C. Sebagai blanko digunakan residu asal fermentasi tanpa sampel ransum perlakuan. Koefisien Cerna Bahan Kering (KCBK) dan Koefisien Cerna Bahan Organik (KCBO) dihitung dengan rumus: BK sampel (BK residu BK blanko) x 100% % KCBK = BK sampel % KCBO = BO sampel (BO residu BO blanko) x 100% BO sampel Pengukuran Konsentrasi NH 3 (Metode Mikrodifusi Conway)

3 Pengukuran konsentrasi NH 3 menggunakan metode Mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedures, 1966). Sebelum digunakan bibir cawan Conway diolesi dengan vaselin. Supernatan yang dihasilkan dari proses fermentasi dengan inkubasi 4 jam diambil 1 ml, kemudian ditempatkan pada salah satu ujung alur cawan Conway, pada ujung satunya dimasukkan 1 ml Na 2 CO 3 jenuh. Antara supernatan dan NaCO 3 tidak boleh bercampur. Larutan asam borat berindikator sebanyak 1 ml ditempatkan dalam cawan kecil yang terletak di tengah cawan Conway, kemudian cawan Conway langsung ditutup rapat hingga kedap udara. Setelah itu cawan Conway digoyang-goyangkan hingga supernatan dan NaCO 3 tercampur rata, dan dibiarkan dalam suhu ruang selama 24 jam. Setelah 24 jam asam borat berindikator dititrasi dengan H 2 SO 4 0,005 N sampai terjadi perubahan warna dari biru menjadi merah. Konsentrasi NH 3 dihitung dengan rumus: NH 3 (Mm) = Volume H 2 SO 4 x N. H 2 SO 4 x 1000 Berat sampel x BK sampel Prosedur Pengukuran Konsentrasi VFA Pengukuran konsentrasi VFA dengan menggunakan metode steam destilasi (General Laboratory Procedures, 1966). Prosedur pengukuran VFA, pertama dipersiapkan alat destilasi yaitu dengan mendidihkan air dan mengalirkan air ke kondensor atau pendingin. Kemudian masukkan 5 ml sampel yang diinkubasi pada jam ke-4 dan 1 ml H 2 SO 4 15% ke dalam tabung destilasi. Kemudian dilanjutkan dengan proses destilasi, proses destilasi dilakukan dengan cara menghubungkan tabung dengan labu yang berisi air mendidih. Uap air panas akan mendesak VFA dan akan terkondensasi di dalam pendingin. Destilasi ditampung dengan labu Erlenmeyer 500 ml yang telah terisi 5 ml NaOH 0,5 N. Proses destilasi selesai pada jumlah destilasi yang tertampung ditambahkan indikator phenolphthalein (PP) sebanyak 2-3 tetes, lalu dititrasi dengan HCl 0,5 N sampai terjadi perubahan warna dari merah jambu menjadi bening. Konsentrasi VFA dapat diukur dengan rumus : Konsentrasi VFA total (mm) = (a-b) x N.HCL X 1000/5ml Berat sampel x BK sampel a = volume titrasi blanko b = volume titrasi contoh Pengujian proporsi molar VFA menggunakan metode gas kromatografi dengan salicilic acid sebagai standar. Pengujian dilakukan di Pusat Penelitian Pengembangan Ternak, Bogor.

4 Menghitung Populasi Protozoa Perhitungan populasi protozoa dilakukan dengan menggunakan counting chamber dengan larutan garam formalin (formalin salin) yang dibuat dari campuran formalin dengan NaCl fisiologis (Ogimoto salin) 0,9% dalam 100 ml larutan (Ogimoto dan Imai, 1981). Sebanyak 1 ml larutan formalin salin dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan dicampur dengan cairan rumen segar atau rumen yang telah mengalami inkubasi 4 jam, dengan perbandingan 1 : 1 atau sebanyak 1 ml cairan rumen ditambah 1 ml larutan garam formalin, kemudian diaduk secara merata. Sampel cairan diteteskan pada counting chamber sebanyak 2 tetes dan ditutup dengan cover glass sampai rata. Counting chamber yang digunakan mempunyai ketebalan 0,1 mm, dengan luas kotak terkecil 0,0625 mm yang terdapat 16 kotak dan kotak yang dibaca sebanyak 5 kotak. Populasi protozoa diamati dengan mikroskop lensa obyektif dengan pembesaran 40x dan okuler 10x. Populasi protozoa dihitung dengan rumus : Populasi protozoa = 1 x 1000 x C x Fp 0,1 x 0,0625 x 16 x 5 Keterangan: C = jumlah koloni yang dihitung Fp = faktor pengencer Perhitungan Populasi Bakteri Total Populasi bakteri dihitung dengan metode pencacahan koloni bakteri hidup. Prinsip perhitungannya adalah cairan rumen diencerkan secara serial, lalu disimpan dalam tabung Hungate. Media tumbuh yang digunakan untuk menghitung populasi bakteri total adalah media BHI (Brain Heart Infusion). Pembuatan media BHI yaitu dengan cara mencampurkan bahan-bahan seperti BHI powder, glukosa, sellulobiosa, pati, cystein, hemin dan resazurin, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang telah disterilkan dengan autoclave. Campuran tersebut dipanaskan sampai terjadi perubahan warna dari coklat kekuningan menjadi coklat kemerahan dan berubah kembali menjadi coklat kekuningan, setelah itu didinginkan dan dialiri dengan gas CO 2. Media BHI anaerob dimasukkan ke dalam tabung Hungate yang sebelumnya telah diisi bacto agar sebanyak 0,150 gram dengan volume masing-masing 4,9 ml.

5 Sampel (cairan rumen yang telah mengalami perlakuan dan inkubasi 4 jam) dipipet 0,05 ml dimasukkan ke dalam media pengencer. Pengenceran dilakukan sebagai berikut: 0,05 ml kultur bakteri dimasukkan ke dalam 4,95 ml media pengencer. Selanjutnya dari media pengencer diambil kembali sebanyak 0,05 ml, lalu dimasukka ke dlam 4,95 ml media pengencer berikutnya, sehingga terdapat pengenceran 10-2, 10-4, 10-6 dan Dari masingmasing seri tabung pengenceran diambil sebanyak 0,1 ml, kemudian dimasukkan ke media agar dan diputar sambil dialiri air pada roller, agar media dapat menjadi padat secara merata. Selanjutnya bakteri diinkubasi selama 24 jam. Perhitungan populasi bakteri dilakukan dengan rumus: Populasi bakteri = Jumlah Koloni 0,05 x 10 -x x 0,1 Keterangan : x = tabung seri pengenceran ke-x Perhitungan Sintesis Protein Bakteri Perhitungan Sintesis Protein Bakteri menggunakan metode Makkar et al., (1981) (Biochemistry Laboratory Procedures), dilanjutkan dengan menggunakan metode Lowry s (Lowry s et al., 1951). Adapun tahapan pekerjaan sebagai berikut : 1.) Pembuatan Reagen pembentukan kompleks Reagen pembentukan kompleks dibuat dengan cara terlebih dahulu membuat tiga jenis larutan. Larutan A yaitu 2%b/v Na 2 CO 3 dalam akuades. Larutan B yaitu 1%b/v CuSO 4.5H 2 O dalam akuades. Dan larutan C yaitu 2%b/v Kalium Natrium tartrat dalam akuades. Ketiga larutan-larutan tersebut kemudian dicampur menjadi satu dengan perbandingan 100:1:1. 2.) Larutan NaOH 2N 3.) Pembuatan Reagen Folin-Ciocalteu Reagen Folin-Ciocalteu dibuat dengan cara 100 g sodium tungstate dimasukkan ke dalam labu erlemeyer berukuran 500 ml, ditambah 25 g sodium molibdate, 700 ml akuades, 50 ml asam phosphate, dan 100 ml HCl. Campuran direfluks selama 10 jam, tambahkan 150 ml lithium sulfat, 50 ml akuades dan beberapa tetes bromine (Br 2 ). Campuran (tanpa pendingin) didihkan sekitar 15 menit (hingga kelebihan bromine habis). Campuran dinginkan

6 kembali, lalu diencerkan dengan akuades hingga 1 L, dan campuran disaring (filtrat berwarna kehijauan). Sebelum digunakan, campuran diencerkan 1 bagian filtrat dengan 5 bagian akuades. Prosedur pengukuran sintesis protein mikroba, mula-mula dipersiapkan alat destilasi yaitu dengan memasukkan cairan rumen sebanyak 20 ml, didestiler dengan kecepatan 400 rpm selama 45 detik. Hal ini bertujuan untuk memisahkan antara bakteri dengan sampel. Sampel kemudian disentrifuse pada 408 gravitasi selama 5 menit, yang bertujuan untuk menurunkan jumlah populasi protozoa dalam cairan rumen dan juga untuk menghilangkan partikel pakan yang masih tersisah. Aliquot (cairan rumen yang telah disentrifuse pada 408 gravitasi, dengan penururnan jumlah populasi proptozoa yang juga terpisah dari partikel pakan) diambil sebanyak 10 ml dan ditambahkan TCA (tricloro acetic acid) 64,5% sebanyak 2,5 ml pada masing-masing sampel. Sampel kemudian disentrifuse rpm selama 20 menit, setelah itu supernatan dibuang dan diperoleh sel/endapan yang diambil dan dicuci dengan air destilasi. Sel/endapan kemudian disentrifuse kembali dengan rpm selama 20 menit. Hasil yang diperoleh berupa supernatan dan sel/endapan, supernatan dibuang kembali yang dibutuhkan hanya sel/endapan saja, endapan tersebut ditambahkan larutan NaOH 0,25N sebanyak 30 ml. Endapan dipanaskan dengan air mendidih selama 10 menit. Supernatan yang dihasikan diambil untuk dikoleksi dari masing-masing sampel sebanyak 1 ml untuk analisis protein mikroba dilanjutkan dengan metode Lowry s. Sampel yang diambil dari masing-masing perlakukan sebanyak 1 ml masih dalam bentuk endapan, maka terlebih dahulu diencerkan dengan NaOH 2N sebanyak 1 ml, kemudian dihidrolisis pada 100 o C selama 10 menit pada penangas air. Sampel lalu dinginkan pada suhu ruangan, tambahkan 5 ml reagen pembentukan kompleks. Biarkan larutan selama 10 menit pada suhu kamar. Tambahkan 0,5 ml reagen Folin-Ciocalteu, lalu homogenkan dengan vortex, biarkan selama menit (jangan sampai lebih dari 60 menit). Kemudian baca absorbansi pada 660 nm jika konsentrasi protein di bawah 500 µg/ml atau 550 nm jika konsentrasi protein antara µg/ml. Rancangan Percobaan Perlakuan Penelitian Penelitian dilakukan secara in vitro, dengan pakan yang digunakan dalam bentuk campuran antara rumput gajah dan pakan penguat. Masing-masing perbandingan rasio hijauan dan pakan penguat adalah 30:70, 50:50 dan 70:30. Setiap perbandingan rasio hijauan

7 dan pakan penguat mendapatkan perlakuan yaitu 0 (sebagai kontrol), penambahan ekstrak lerak (1 mg/ml) dan ekstrak lerak (1 mg/ml) yang difortifikasi dengan mineral mix (Ca, P, Mg, dan S). Kandungan masing-masing mineral mix (Ca, P, Mg, dan S) berturut-turut adalah 0,54%, 0,37%, 0,23%, dan 0,1%, berdasarkan acuan NRC Susunan ransum percobaan adalah sebagai berikut: 0 R : K = 70 : 30 ekstrak lerak (1 mg/ml) ekstrak lerak (1 mg/ml) plus mineral mix 0 R : K = 50 : 50 ekstrak lerak (1 mg/ml) ekstrak lerak (1 mg/ml) plus mineral mix R : K = 30 : 70 Ket : R K mineral mix 0 ekstrak lerak (1 mg/ml) ekstrak lerak (1 mg/ml) plus mineral mix : Rumput : Kosentrat : Mineral (Ca, P, Mg, dan S) yang difortifikasi dalam ekstrak lerak Model Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) pola faktorial 3x3 denga 4 ulangan dan masing-masing sampel dibuat duplo. Faktor pertama adalah rasio rumput dengan pakan penguat (70:30, 50:50, 30:70), dan faktor kedua adalah jenis pemberian supleman (0, ekstrak lerak 1 mg/ml dan ekstrak lerak 1 mg/ml + mineral mix). Model matematika yang digunakan adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie, 1991). Y ijk = µ + τ i + ß j + (τß) ij + ρ k + ε ijk Keterangan : Y ij = Nilai pengamatan pada faktor A taraf ke-i faktor B taraf ke-j dan kelompok ke-k µ = Nilai rataan umum τ i β j (τß) ij = Efek perlakuan ke-i = Efek kelompok ke-j = Komponen interaksi dari faktor A dan faktor B

8 ρ k = Pengaruh aditif dari kelompok dan diasumsikan bersifat aditif ijk = pengaruh acak yang menyebar normal (0, σ 2 ) Perubahan yang Diamati Perubahan yang diamati selama penelitian ini adalah sebagai berikut : 1) Kecernaan bahan kering dan kecernaan bahan organik yang dianalisis dengan menggunakan metode (Tilley and Terry, 1963) 2) Konsentrasi NH 3 (Amonia) yang diukur dengan menggunakan metode Mikrodifusi Conway (General Laboratory Procedures, 1966) 3) Konsentrasi VFA (Volatile Fatty Acids) yang diukur dengan menggunakan Teknik Destilasi Uap (General Laboratory Procedures, 1966) 4) Populasi protozoa total yang dihitung dengan metode Ogimoto dan Imai (1981) 5) Populasi bakteri total yang dihitung dengan menggunakan metode Ogimoto dan Imai (1981) 6) Sintesis protein bakteri yang diukur dengan menggunakan metode Makkar et al., (1981) (Biochemistry Laboratory Procedures), dilanjutkan dengan menggunakan metode Lowry s (Lowry s et al., 1951)