17 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup, Institut Pertanian Bogor (PPLH IPB) dari bulan Oktober sampai bulan Desember 2011. 3.2 Alat dan Bahan Peralatan yang digunakan dalam pembuatan media yaitu gelas piala, gelas ukur biasa, pipet volumetrik, neraca analitik, ph meter, panci, pengaduk, autoklaf, karet gelang, timbangan analitik, labu Erlenmeyer, labu takar, botol kultur, dan plastik, sedangkan untuk kegiatan sterilisasi dan penanaman alat-alat yang digunakan yaitu sendok spatula, petridish, scalpel, tissue, cawan petri, pisau, pinset, lampu Bunsen, laminar air flow cabinet, timer, aluminium foil, plastik wrap, dan handsprayer serta alat tulis dan kamera digital untuk kegiatan pengamatan. Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media yaitu larutan stok, media MS (Murashige dan Skoog), agar-agar, gula pasir, air steril, BAP (6-benzyl amino purine), sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan sterilisasi dan penanaman yaitu alkohol 70%, deterjen, air steril, HgCl 2, clorox, antiseptik (betadine), eksplan jelutung (Dyera costulata) berupa biji, dan larutan colchicine. Biji jelutung berasal dari PT Xylo Indah Pratama yang didatangkan dari pulau Sumatera yang sudah disimpan selama 6 bulan. 3.3 Metode Pengumpulan Data Jenis data yang dikumpulkan pada penelitian ini adalah data primer. Data primer dilakukan dan diamati secara langsung di laboratorium terdiri dari tinggi eksplan, jumlah dan panjang akar, jumlah daun dan ruas baru eksplan.
18 3.4. Batasan Penelitian Pengambilan data primer hanya dilakukan pada tinggi eksplan, jumlah dan panjang akar, jumlah daun, dan ruas baru eksplan. 3.5 Prosedur Kerja 3.5.1 Sterilisasi alat dan media kultur Alat-alat yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan seperti botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, pengaduk, pipet, gelas piala, labu takar dicuci bersih menggunakan detergen. Kemudian alat-alat yang digunakan dalam penanaman disterilisasi dengan membungkus alat-alat tersebut menggunakan kertas koran dan selanjutnya semua alat-alat tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121ºC - 126ºC dengan tekanan 1,5 atm selama 60 menit. Sedangkan untuk media yang telah dimasukkan ke dalam botol kultur lalu dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121ºC - 125ºC dengan tekanan 1,5 atm selama 20 menit. Untuk sterilisasi air yang digunakan dalam proses sterilisasi eksplan dan penanaman disterilisasi seperti cara mensterilisasi media. 3.5.2 Sterilisasi lingkungan kerja Pembersihan laboratorium dilakukan setiap hari terutama untuk penyeleksian botol kultur yang terkontaminasi. Pengepelan dan penyemprotan rak kultur dengan alkohol juga dilakukan secara berkala. Pembersihan tempat kerja (laminar air flow cabinet) dapat dilakukan dengan mengelap permukaan atau meja kerja dan dinding porselin dengan menggunakan kapas atau tisu yang telah disemprot alkohol 70%. Selama tidak digunakan, lampu ultra violet yang ada pada laminar air flow cabinet dinyalakan dan ketika digunakan harus dimatikan karena jika tidak dimatikan akan membahayakan kesehatan pengguna laminar air flow cabinet (Hendaryono & Wijayani 1994). Lalu sebelum dan selama pemakaian, blower atau peniup udara dalam laminar air flow cabinet harus dinyalakan untuk menghindari adanya kontaminan yang masuk ke dalam botol kultur ketika penanaman. Kemudian sebelum melakukan pekerjaan maka dilakukan penyemprotan dengan alkohol 70% terhadap kedua telapak tangan, botol kultur, ataupun alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman.
19 3.5.3 Sterilisasi bahan eksplan Biji jelutung yang dikultur diberi perlakuan sterilisasi yang meliputi sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet dan sterilisasi di dalam laminar air flow cabinet. Adapun tahapan sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet meliputi: 1. Pembersihan permukaan biji jelutung dengan cara dikerok menggunakan pisau 2. Pembersihan biji jelutung dengan alkohol 70% dengan cara digosok menggunakan kapas yang telah dibasahi alkohol 3. Pencucian dengan detergen (10 menit) 4. Pembilasan dengan menggunakan air bersih Sedangkan untuk tahapan sterilisasi eksplan di dalam laminar air flow cabinet meliputi: 1. Pencucian dengan menggunakan HgCl 2 10% selama 7 menit 2. Pencucian dengan menggunakan clorox 20% selama 7 menit 3. Pencucian dengan menggunakan clorox 10% selama 7 menit 4. Pembilasan dengan menggunakan air steril sebanyak 2 kali selama 10 menit 3.5.4 Pembuatan media 3.5.4.1 Pembuatan larutan stok Pembuatan larutan stok dilakukan secara terpisah sesuai dengan pengelompokkannya yaitu larutan stok makro, stok mikro, stok fe-edta, stok vitamin, dan stok hormon (BAP). Adapun rincian komposisinya yaitu larutan stok makro terdiri dari KNO 3, NH 4 NO 3, CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4. 7H 2 O, dan KH 2 PO 4 (masing-masing dibuat secara terpisah). Larutan stok mikro terdiri dari campuran MNSO 4. H 2 O, ZnsSO 4. 7H 2 O, H 3 BO 3, KI, NA 2 MoO 4, 2H 2 O, CoCl. 6H 2 O, 4CuSO 4. 5H 2 O. Larutan stok fe-edta terdiri dari campuran senyawa dari Thiamin HCl, Nicotinic Acid, Pyridoxin HCl, dan Glycin. Serta larutan stok hormon (BAP). Unsur hara yang telah ditimbang beratnya sesuai dengan yang telah ditentukan kemudian dilarutkan dengan 1 liter aquades. Setelah larutan stok selesai dibuat selanjutnya disimpan di lemari es.
20 3.5.4.2 Pembuatan media Murashige Skoog (MS) dengan larutan BAP Pembuatan media dimulai dengan pembuatan larutan stok MS dan hormon BAP yang telah dipersiapkan sebelumnya. Untuk pelaksanaan pembuatan media yaitu sebagai berikut: 1. Menyiapkan 500 ml air aquadest dalam panci 2. Memasukkan gula pasir sebanyak 30 gram 3. Memipet dan memasukkan larutan A, B, C, D, E, F, dan myo inositol masingmasing 5 ml, vitamin sebanyak 4 ml, dan hormon (BAP) sebanyak 0,5 ml. 4. Menambahkan air aquadest hingga volume menjadi tepat 1000 ml. 5. Mengukur ph larutan yaitu 4, jika terlalu asam tambahkan NaOH dan jika terlalu basah tambahkan HCl. 6. Memasukkan 6 gram agar-agar ke dalam larutan tersebut. 7. Memasak larutan media dalam panci hingga mendidih. 8. Menuangkan media ke dalam botol kultur yang telah diisi kapas. 9. Menutup botol dengan plastik dan karet. 10. Mensterilkan media di dalam autoklaf pada suhu 121ºC-126ºC dan pada tekanan 1,5 atm selama 20 menit. 11. Memasukkan media-media yang sudah steril ke dalam plastik dan simpan di lemari penyimpan media. 3.5.4.3 Pembuatan media perlakuan Pembuatan media perlakuan diawali dengan proses yang sama ketika membuat media kontrol (MS0+BAP0,5). Akan tetapi untuk media perlakuan pada larutan MS0+BAP0,5 ditambahkan colchicine sesuai dengan perlakuan yakni sebesar 0 ml/l (kontrol), 0,5 ml/l, 1,0 ml/l, 1,5 ml/l, dan 2,0 ml/l. Penambahan colchicine ini dilakukan setelah larutan MS0+BAP0,5 diencerkan dengan air aquadest hingga 1 liter dan dibagi ke dalam 5 bagian masing-masing sebanyak 200 ml. Setelah masing-masing larutan selesai dibuat, larutan diukur phnya dengan menggunakan ph meter. Pada umumnya teknik in vitro menggunakan ph media sebesar 5,6-5,8. Akan tetapi untuk perlakuan kultur biji jelutung ini menggunakan ph 4, sehingga yang awalnya ph media kisaran 6 diturunkan
21 dengan menambahkan HCl hingga ph tepat menunjukkan 4. Selanjutnya larutan media ditambahkan dengan agar-agar sebanyak 1,5 gr/ 200 ml (untuk tiap perlakuan) dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu larutan dituang ke dalam botol-botol kultur yang sudah berisi kapas sebanyak ±10 ml. Lalu botol ditutup dengan rapat menggunakan plastik dan karet serta diberi label. Langkah selanjutnya yaitu melakukan sterilisasi media tersebut dalam autoclave pada suhu 121ºC-126 ºC pada tekanan 1,5 atm selama 20 menit. 3.5.5 Penanaman Penanaman eksplan biji jelutung dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Setelah dilakukan sterilisasi eksplan kemudian eksplan dimasukkan ke dalam petridish dan lapisan tipis yang menutupi biji jelutung dilepaskan menggunakan pisau yang sudah disterilkan. Lalu biji jelutung ditanam ke dalam media kultur. Setelah selesai penanaman botol kultur ditutup kembali dengan plastik dan karet ditambah dengan alumunium foil dan dibungkus lalu disimpan di dalam ruang kultur yang suhu dan cahayanya telah diatur. Cahaya yang digunakan pada pagi hingga sore hari yaitu dari pantulan cahaya matahari, sedangkan pada sore hingga malam hari menggunakan cahaya lampu. 3.5.6 Pengamatan rancangan percobaan Pengamatan dilakukan kurang lebih 11 minggu setelah tanam dan pengambilan data dilakukan setiap satu minggu sekali. Selama 11 minggu ini pengamatan dibagi ke dalam dua kategori. Pengamatan kategori pertama dilakukan pada awal penanaman hingga eksplan sudah tumbuh dan masih berada di media yang mengandung colchicine (untuk yang perlakuan). Pengamatan ini dilakukan selama 5 minggu. Lalu pengamatan kategori kedua dilakukan ketika eksplan (untuk yang perlakuan) yang semula tumbuh di media dengan campuran colchicine dipindahkan ke media pemulih (tanpa colchicine). Pengamatan ini dilakukan selama 6 minggu. Adapun parameter yang diamati adalah: 1. Jumlah eksplan yang hidup
22 Penghitungan dilakukan dengan cara megnhitung jumlah eksplan yang masih bertahan hidup yang ditandai dengan eksplan yang masih berwarna seperti awal penanaman. 2. Jumlah eksplan yang mati Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah eksplan yang mati yang ditandai dengan eksplan yang mulai menghitam. 3. Tinggi eksplan Pengukuran dilakukan dengan cara mengukur dari pangkal eksplan sampai titik tumbuh tertinggi. 4. Jumlah akar yang tumbuh Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah akar yang tumbuh pada eksplan. 5. Panjang akar yang tumbuh Pengukuran dilakukan dengan cara mengukur dari pangkal akar eksplan sampai ujung akar. 6. Jumlah daun yang tumbuh Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah daun yang tumbuh. 7. Jumlah ruas baru eksplan Penghitungan dilakukan dengan cara mengamati jumlah ruas baru pada eksplan yang sudah tumbuh. 3.6 Metode Analisis Data Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan satu faktor yaitu konsentrasi colchicine. Konsentrasi yang digunakan adalah 0 mg/l (kontrol), 0,5 mg/l, 1 mg/l, 1,5 mg/l, dan 2 mg/l. Penelitian dilakukan dengan 5 perlakuan dengan masing-masing perlakuan diulang sebanyak 25 kali. Model umum rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut: Yij = µ + τi + εij : i = 1, 2, 3, 4, 5 j = 1, 2, 3,., 25 Yij = hasil pengamatan terhadap eksplan jelutung pada konsentrasi colchicine ke-i dan ulangan ke-j.
23 µ = nilai tengah umum (rata-rata populasi) Τi = pengaruh konsentrasi colchicine ke-i. Εij = pengaruh galat percobaan pada eksplan jelutung ke-j yang memperoleh perlakuan konsentrasi colchicine ke-i. Hipotesis dalam uji F: Ho = Perlakuan tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan tinggi, jumlah akar, panjang akar, jumlah daun, dan ruas baru eksplan. Hi = Perlakuan berpengaruh terhadap pertumbuhan tinggi, jumlah daun, dan ruas baru eksplan. Pengambilan keputusan uji F: F hitung > F tabel maka tolak Ho. F hitung = F tabel. F hitung < F tabel maka terima Ho. Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan ANOVA. Apabila ada perbedaan nyata diantara perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji Duncan. Program yang digunakan ialah SPSS 16.0.