11 III. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilakukan pada Januari sampai Mei 2011 bertempat di Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Organisme Uji Organisme uji adalah udang Litopenaeus vannamei SPF (specific pathogen free) yang diperoleh dari hatchery komersial di Anyer, Banten. Benur (post larvae) dipelihara pada kondisi terkontrol untuk mencegah peluang infeksi IMNV dari lingkungan. Sebagai langkah biosecurity maka air pemeliharaan didisinfeksi menggunakan desinfektan kuat. Desinfeksi ganda dilakukan untuk mengurangi keberadaan patogen di air yang akan digunakan untuk penelitian. Desinfeksi ganda tersebut menggunakan kalsium hipoklorit (kaporit) 10 ppm dan kalium monopersulfat (KMPS) dengan dosis 2 ppm. 3.3 Stok Virus dan Bakteri Stok virus diperoleh dari udang yang terinfeksi virus IMNV, yakni udang dengan symptom penyakit IMN. Verifikasi dilakukan dengan menguji ke laboratorium PCR (kit komersial NugenIMNV). Udang terinfeksi dipelihara sebagai stok virus untuk bahan infeksi oral dalam penelitian ini. Otot udang tersebut dicacah dan segera diinfeksikan secara oral. Jenis bakteri yang digunakan pada penelitian ini adalah Vibrio harveyi. Isolat V. harveyi merupakan koleksi Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor. Bakteri dikultur ulang untuk menjaga aktivitas dan kemurniannya.
12 3.4 Desain Penelitian 3.4.1 Percobaan 1. Dampak KoInfeksi IMNV dan Berbagai Dosis V. harveyi terhadap Mortalitas Udang Uji Uji ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh koinfeksi virus IMNV dengan berbagai dosis V. harveyi terhadap mortalitas udang (Tabel 1). Udang uji dengan bobot ratarata 2.71±0.395 g sebanyak ekor tiap wadah perlakuan dipelihara pada akuarium dengan volume air 10 liter. Bobot ratarata tersebut dipilih berdasarkan penelitian koinfeksi skala laboratorium yang dilakukan oleh Phuoc et al. (2009). Administrasi infeksi IMNV dilakukan secara oral dengan modifikasi feeding rate 10% per hari dari bobot biomassa udang uji. Udang diberi pakan otot udang yang terinfeksi penyakit IMN selama 3 hari, kemudian selanjutnya diberi pakan komersial (Coelho et al., 2009). Bakteri diinfeksikan dengan metode imersi pada hari ke3 setelah infeksi oral IMNV yang pertama. Pemeliharaan dan pengamatan dilakukan selama 14 hari mengacu pada informasi Tang et al. (2005) bahwa udang vaname yang diinfeksi virus IMNV memerlukan waktu 913 hari untuk menyebabkan kematian. Data yang dianalisa adalah tingkat mortalitas udang tiap perlakuan, sehingga diperoleh dosis tertinggi infeksi V. harveyi yang tidak mematikan pada infeksi tunggal namun mematikan pada koinfeksi dengan IMNV. Dosis tersebut akan digunakan pada Percobaan 2. Tabel 1. Desain percobaan 1, dampak koinfeksi virus IMNV dan berbagai dosis bakteri V. harveyi terhadap mortalitas udang uji. No. Perlakuan (3 ulangan) Administrasi Infeksi IMNV Infeksi V. harveyi (cfu/ml) Jumlah Udang Uji (ekor) 1 2 3 4 5 6 VH VH VH IMNV+VH IMNV+VH IMNV+VH 10 6 10 7 10 10 6 10 7 10 7 IMNV Kontrol Keterangan: IMNV (Infectious Myonecrosis Virus), VH (Vibrio harveyi).
13 3.4.2 Percobaan 2. Penghitungan Jumlah Bakteri Vibrio, Perkembangan Gejala Klinis Penyakit IMN dan Konfirmasi Virus IMNV di Tubuh Udang Uji dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) Pada percobaan ini dilakukan penghitungan densitas Vibrio pada perlakuan infeksi tunggal V. harveyi, koinfeksi dan kontrol (Tabel 2). Udang uji dengan bobot ratarata 2.91±0.312 g sebanyak 15 ekor tiap wadah perlakuan dipelihara pada akuarium dengan volume air 25 liter. Dosis infeksi diperoleh dari percobaan 1 yaitu V. harveyi 10 7 cfu/ml. Dosis tersebut adalah dosis perlakuan yang menghasilkan respon kematian pada koinfeksi IMNV dan V. harveyi namun tidak berpengaruh terhadap mortalitas ketika diinfeksi V. harveyi saja. Penghitungan bakteri berdasarkan ciri warna koloni Vibrio di media TCBS. Koloni Vibrio tersebut digolongkan menjadi Vibrio hijau (berpendar) dan Vibrio kuning. Penghitungan dilakukan di tubuh udang dan air. Organ sampel tubuh udang yaitu hepatopankreas. Penghitungan dilakukan pada hari ke 2, 4, 6,, dan 10 setelah infeksi bakteri. Tabel 2. Desain Percobaan 2, penghitungan densitas bakteri Vibrio, pengamatan gejala klinis, histopatologi dan uji PCR IMNV. No. Perlakuan Pengujian Infeksi Penghitungan Bakteri b, Gejala 1 2 3 4 VH e IMNV f +VH e f IMNV Kontrol IMNV a (hari) 2 dan 10 2 dan 10 2 atau 10 Klinis c, Histopatologi d (hari) 0, 2, 4, 6,, 10 0, 2, 4, 6,, 10 0, 2, 4, 6,, 10 Keterangan: Uji PCR (a), sampel air dan hepatopankreas (b), sampel udang uji (c), sampel otot dan organ limfoid (d), dosis berdasarkan Percobaan 1 (e), infeksi oral (f). Pada percobaan ini juga diamati perkembangan gejala klinis penyakit IMN pada perlakuan infeksi IMNV dan koinfeksi. Pengamatan gejala klinis dilakukan sampai 14 hari setelah infeksi. Penghitungan mortalitas dilakukan pada satu wadah atau satu ulangan untuk masingmasing perlakuan. Pengamatan juga dilakukan untuk mengetahui awal munculnya gejala klinis dan mortalitas serta perkembangan penyakit IMN. Pengamatan perkembangan gejala klinis penyakit IMN yang dilakukan yaitu observasi gejala klinis secara visual dan histopatologi (Tabel 3). Pengamatan histopatologi dilakukan pada beberapa organ tubuh udang
14 yaitu jaringan otot dan organ limfoid. Pengambilan sampel untuk pengujian histopatologi dilakukan pada hari ke 0, 2, 4, 6,, dan 10 pasca infeksi. Kemudian dibandingkan infeksi virus pada infeksi tunggal IMNV dengan koinfeksi IMNV dan V. harveyi. Konfirmasi IMNV dilakukan dengan analisis PCR menggunakan kit komersial NugenIMNV (hari ke2 dan 10 setelah infeksi). Tabel 3. Pengamatan gejala klinis dan histopatologi. No Parameter Waktu Pengamatan Sampel Pengamatan (hari) 1 Gejala Klinis 0, 2, 4, 6,, 10 Udang uji 2 Histopatologi 0, 2, 4, 6,, 10 Otot dan limfoid 3.5 Pengukuran Parameter 3.5.1 Penghitungan Bakteri Vibrio Penghitungan bakteri Vibrio dilakukan dengan metode hitungan cawan menggunakan media spesifik TCBS agar. Penghitungan Vibrio dilakukan pada Percobaan 2. Vibrio hijau berpendar diamati minimal jam setelah kultivasi. Pada penelitian ini pengamatan dilakukan antara 1620 jam setelah kultivasi. Untuk sampel dari tubuh udang, sampel hepatopankreas digerus dalam tube ependorf dan ditambahkan phosphat buffer saline (PBS) steril hingga 1 ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat sampai 4. Untuk sampel air pemeliharaan, sebanyak 1 ml air pemeliharaan dimasukkan ke dalam tube ependorf. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat seperti dilakukan pada sampel tubuh udang (hepatopankreas). Inokulasi bakteri juga dilakukan pada pengenceran pertama dan ke3 atau ke4. Inokulasi dilakukan dengan mengambil 0.1 ml sampel dari pengenceran tersebut dan disebar pada media TCBS. 3.5.2 Histopatologi Pengamatan parameter histopatologi dilakukan pada otot skeletal dan limfoid udang uji. Histopatologi dilakukan pada Percobaan 2. Sampel udang dengan atau tanpa gejala klinis diperoleh dari setiap perlakuan. Organ sampel yang diambil, difiksasi dengan larutan fiksatif davidson. Organ yang telah difiksasi minimal 24 jam dipotong sebesar 35 mm dan 1x1 cm, kemudian jaringan tersebut dimasukkan dalam etanol bertingkat. Proses selanjutnya jaringan dimasukkan dalam xylene lalu paraffin untuk dilakukan proses blocking. Jaringan
15 dipotong dengan mikrotom rotary dengan ketebalan 3 5 µm dan diletakkan pada gelas objek. Setelah proses tersebut, dilakukan pewarnaan dengan menggunakan haematoxylineosin. Preparat diamati di bawah mikroskop untuk mengamati perubahan jaringan yang mungkin terjadi. Histopatologi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat kerusakan organ akibat infeksi IMNV. 3.5.3 Gejala Klinis Penyakit IMN Pengamatan gejala klinis dilakukan pada Percobaan 2. Pengamatan gejala klinis dari sampel meliputi beberapa stadia. Gejalagejala klinis tersebut diamati untuk menentukan waktu awal udang menampakkan gejala klinis IMNV dan melihat perkembangan stadia gejala klinis tersebut. Pengamatan harian dilakukan secara visual pada udang uji. Parameter gejala klinis ditentukan berdasarkan modifikasi dari pengelompokan gejala klinis menurut Costa et al. (2009). Tingkat gejala klinis dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4. Parameter pengamatan gejala klinis (symptom) Penyakit IMN. Level Stadia Gejala Klinis/ Symptom Simbol Tingkat Infeksi 1 Terinfeksi tanpa symptom + Ringan 2 Sedikit warna put ih lebam di ++ Menengah dalam jaringan di beberapa segmen abdomen 3 Sebagian besar jaringan +++ Berat abdomen berwarna putih lebam 4 Bagian abdomen dari arah ekor berwarna merah (jaringan mati) ++++ Berat 3.5.4 Mortalitas Udang Mortalitas udang diukur pada Percobaan 1 dan 2. Perhitungan mortalitas udang menggunakan persamaan sebagai berikut: Nt MR = x100% No Keterangan : MR = Mortalitas udang uji Nt = Jumlah udang mati pada waktu t No = Jumlah udang pada awal pemeliharaan
16 3.6 Analisis Data Analisis statistik untuk mengetahui perbedaan densitas bakteri Vibrio hijau dan total Vibrio di tubuh udang antar perlakuan dievaluasi dengan ttest analysis menggunakan software MINITAB (versi 16 untuk windows). Hasil pengamatan lain seperti mortalitas udang dan gejala klinis penyakit dianalisa secara deskriptif.