BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan Penelitian Metode Penelitian Isolasi dan Identifikasi Cendawan Patogen

Transkripsi

1 14 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Percobaan dilaksanakan dari bulan Maret sampai bulan Juli 2012 di Laboratorium Mikologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan berupa isolat cendawan antagonis hasil eksplorasi Prof. Meity Suradji Sinaga, yaitu Trichoderma harzianum (TH1), dan Gliocladium fimbriatum (G84), sedangkan isolat bakteri antagonis merupakan hasil penelitian dan eksplorasi Dr. Abdjad Asih Nawangsih, yaitu Pseudomonas fluorescens (P1), dan Bacillus subtilis (B12). Isolat cendawan patogen hasil isolasi dari buah dan benih cabai yang terinfeksi antraknosa, benih cabai besar varietas GELORA dengan merk dagang CAP MUTIARA BUMI, air steril, media Nutrient Agar (NA), media Potato Dextrose Agar (PDA), media Nutrient Broth (NB), NaOCl 1%, kompos steril, dan tanah steril. Metode Penelitian Isolasi dan Identifikasi Cendawan Patogen Penyebab antraknosa diisolasi dari bagian buah dan benih cabai yang menunjukkan gejala penyakit antraknosa. Potongan buah cabai sakit (0.5 x 0.5) cm 2 ditumbuhkan pada media PDA dalam cawan petri. Koloni patogen yang tumbuh dimurnikan pada media PDA yang telah diberi kloramphenicol. Patogen yang sudah murni kemudian diidentifikasi di bawah compound microscope (perbesaran 400x) dengan melihat aservulus, penciri hifa, percabangan, ukuran, dan bentuk konidianya serta keberadaan setae. Selanjutnya patogen disimpan untuk digunakan pada uji antagonisme in vitro dan uji keefektifan agens antagonis in vivo.

2 15 Uji Antagonisme in vitro Uji antagonisme in vitro antara agens antagonis dengan patogen dilakukan dengan menggunakan metode uji ganda pada media PDA. Agens antagonis Trichoderma harzianum (TH1), Gliocladium fimbriatum (G84), Bacillus subtilis (B12), dan Pseudomonas fluorescens (P1) diinokulasikan pada media PDA termodifikasi dengan jarak 3 cm dari koloni cendawan patogen. Tiap perlakuan dilakukan sebanyak 3 ulangan. Pengamatan dilakukan dengan mengukur jari-jari koloni cendawan patogen yang menjauhi koloni agens antagonis (R1) dan jari-jari koloni cendawan patogen yang mendekati agens antagonis (R2), serta menghitung penghambatan agens antagonis (H). Pengamatan dimulai 24 jam setelah kedua isolat uji diinokulasikan sampai hari kesepuluh setelah perlakuan. Keterangan : P : Koloni cendawan patogen R1 P R2 A A : Koloni cendawan antagonis 3 cm 3 cm R1 : Jari-jari koloni patogen yang menjauhi koloni cendawan antagonis (mm) R2 : Jari-jari koloni patogen yang mendekati koloni cendawan antagonis (mm) Kemampuan Penghambatan Besarnya pengaruh penghambatan agens antagonis terhadap patogen dihitung dengan menggunakan rumus persentase: Keterangan : H = (R1-R2) R1 x 100% H : Persentase penghambatan agens antagonis (%) R1 : R2 : Jari-jari koloni patogen yang menjauhi koloni agens antagonis (mm) Jari-jari koloni patogen yang mendekati koloni agens antagonis (mm)

3 16 Catatan : bila koloni pertumbuhan patogen sudah tertutup oleh koloni agens antagonis, maka dianggap persentase penghambatan agens antagonis (H) = 100%. Uji Keefektifan Agens Antagonis in vivo Keefektifan penghambatan agens antagonis dilakukan secara in vivo pada kecambah cabai merah. Media tanam yang digunakan dalam polibag adalah kompos dan tanah steril (1:6). Uji keefektifan agens antagonis in vivo meliputi faktor dengan inokulasi dan tanpa inokulasi patogen. Perlakuan tunggal meliputi perlakuan kontrol (K), Trichoderma harzianum (TH1), Gliocladium fimbriatum (G84), Bacillus subtilis (B12), dan Pseudomonas fluorescens (P1), sedangkan perlakuan kombinasi meliputi (THB12), (THP1), (G84B12), (G84P1), (THG84), dan (B12P1). Setiap perlakuan dilakukan sebanyak 5 ulangan. Aplikasi agens antagonis dilakukan melalui penyiraman suspensi langsung ke lubang tanam dan dengan perendaman benih dalam suspensi agens antagonis. Penyiraman suspensi dilakukan pada agens antagonis golongan cendawan yaitu Trichoderma harzianum (TH1) dan Gliocladium fimbriatum (G84), sedangkan perendaman benih dilakukan pada agens antagonis golongan bakteri yaitu Bacillus subtilis (B12) dan Pseudomonas fluorescens (P1). Suspensi agens antagonis golongan cendawan didapatkan dari hasil peremajaan biakan antagonis selama 7 hari. Biakan dalam cawan petri yang berumur 7 hari ditambahkan air steril sebanyak 10 ml kemudian digerus menggunakan spatula. Hasil gerusan diambil sebanyak 1 ml untuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air steril dengan menggunakan pipet volumetrik. Sebelum diaplikasikan jumlah konidia cendawan dihitung menggunakan haemasitometer, dan didapatkan hasil 1.18 x 10 7 konidia/ml untuk Gliocladium fimbriatum dan 1.23 x 10 7 konidia/ml untuk Trichoderma harzianum. Suspensi cendawan antagonis diaplikasikan langsung ke dalam lubang tanam. Suspensi bakteri agens antagonis didapatkan dengan mengkulturkan biakan bakteri ke dalam media Nutrient Broad (NB) dan dishaker selama 24 jam pada 100 rpm, kemudian dilakukan pengenceran berseri sampai tingkat

4 17 pengenceran Hasil pengenceran kemudian dilakukan plating untuk dihitung jumlah koloni pada tiap pengencerannya, dan didapatkan hasil untuk Bacillus subtilis sebanyak 1.85 x 10 9 CFU pada pengenceran 10-6 dengan kerapatan optik (OD) sebesar 0.61, sedangkan untuk Pseudomonas fluorescens dengan kerapatan optik 0.75 didapatkan hasil sebanyak 1.12 x 10 9 CFU pada pengenceran Kerapatan optik (optical dencity) pada setiap isolat bakteri antagonis ditentukan dengan menggunakan spectrophotometer pada panjang gelombang 600 nm. Aplikasi perendaman benih pada pengenceran yang telah ditentukan dan diketahui banyaknya koloni bakteri per unit, suspensi bakteri tersebut dituangkan ke dalam cawan petri yang telah berisi benih cabai dan ditunggu selama ± 1 jam untuk selanjutnya ditanam ke polibag dengan menanam 3 benih untuk masingmasing polibag. Perlakuan K, TH1, dan G84 dilakukan perendaman hanya pada air steril agar tidak terkontaminasi bakteri antagonis yang digunakan. Hal ini dilakukan karena perendaman benih berhubungan dengan budidaya cabai, yaitu untuk membantu terjadinya perkecambahan benih, benih cabai harus direndam terlebih dahulu dalam air sebelum di tanam. Air steril sebanyak 10 ml dituangkan ke dalam biakan patogen kemudian digerus dengan menggunakan spatula. Hasil gerusan diambil sebanyak 1 ml dan dimasukan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air steril. Suspensi patogen hasil peremajaan selama 7 hari kemudian dihitung kerapatan konidianya dengan menggunakan haemasitometer. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa kerapatan konidia patogen sebanyak 2.5 x 10 5 konidia/ml. Inokulasi patogen dilakukan dengan penyiraman suspensi ke kecambah cabai pada hari ke 5 setelah aplikasi agens antagonis. Benih cabai dipelihara selama 21 hari, dan dilakukan pengamatan pada 6 hari setelah perlakuan (hsp) agens antagonis atau 1 hsp patogen dengan peubah yang diamati adalah daya kecambah benih, kejadian penyakit, tinggi kecambah, jumlah daun, dan vigor tanaman. Kejadian penyakit (intensitas penyakit) dapat ditentukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut: KP = n N x 100%

5 18 Keterangan: KP : Kejadian penyakit (%) n N : Jumlah kecambah yang sakit : Jumlah kecambah yang diamati Kecambah yang menunjukkan gejala rebah kecambah direisolasi untuk diidentifikasi lebih lanjut mengenai patogen yang menyebabkan rebah pada kecambah. Rancangan Percobaan dan Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan pada uji antagonisme in vitro adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL). Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 3 ulangan, sehingga terdapat 12 unit percobaan untuk uji antagonisme in vitro. Rancangan percobaan yang digunakan pada uji keefektifan agens antagonis in vivo adalah rancangan Faktorial RAL 11x2 dengan 2 faktor (faktor dengan inokulasi patogen dan faktor tanpa inokulasi patogen). Masing-masing perlakuan dilakukan sebanyak 5 ulangan, sehingga terdapat 110 unit percobaan. Data yang diperoleh dianalisis dengan Microsoft Office Excel 2007 dan analisis ragam (ANOVA) menggunakan program Statistical Analysis System (SAS) versi Perlakuan yang berpengaruh nyata diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf α=5% (Mattjik dan Sumertajaya 2006).