BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Bahan dan Alat Metode Penelitian Pra-pengamatan atau survei

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Kebun Percobaan Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika IPB (PKBT-IPB) Pasir Kuda, Desa Ciomas, Bogor, dan Laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret sampai dengan Oktober Bahan dan Alat Tanah di sekitar perakaran tanaman pepaya varietas IPB 9 yang terinfeksi penyakit busuk basah pada batang dan tanah dari tanaman yang sehat. Bahan tanaman lain yaitu tanaman tembakau. Media biakan yang digunakan nutrient agar (NA), luria broth (LB), martin agar (MA), dan potato dextrose agar (PDA). Media uji yang digunakan adalah media Oksidatif-Fermentatif (O/F), media King s B, media tryphenil tetrazolium chloride (TZC), media Arginine, Levan, yeast extract dextrose CaCO 3 (YDC), media D1M Agar. Komposisi masing-masing media terdapat pada lampiran 1. Bahan lain yang digunakan yaitu umbi kentang mentah, KOH 3%, alkohol 70%, paraffin oil, malachite green 5%, safranin 0,5%, dimethyl-pphenylenediamine dihydrochloride 1%, air steril, dan kapas. Alat-alat yang digunakan adalah mikroskop compound, autoklaf, alat shaker, cawan petri, tabung reaksi, labu erlenmeyer, pipet, jarum inokulasi, alat suntik, glass-bite, gelas objek, baki plastik, seal, pisau, lampu bunsen, dan tisu. Metode Penelitian Pra-pengamatan atau survei Survei dilakukan pada lahan yang terdapat gejala serangan penyakit busuk basah. Survei tersebut bertujuan untuk mengetahui kondisi lahan, kondisi tanaman yang akan diamati, dan memudahkan dalam menentukan tanaman yang akan dijadikan sampel.

2 8 Penentuan tanaman contoh dan pengambilan tanah Lahan yang digunakan telah ditanami pepaya varietas IPB 9. Tanah dari tanaman contoh diambil sampai kedalaman 20 cm dengan mengambil 3 sampel tanaman yang terserang penyakit busuk basah dan 3 sampel tanaman sehat. Isolasi mikroorganisme rizosfer Sampel tanah yang telah diambil dari lapang diisolasi menggunakan pengenceran berseri dengan cara mencampur sebanyak 5 gram tanah dari setiap contoh dan air steril sebanyak 50 ml, kemudian di-shaker 100 rpm selama semalam (overnight). Suspensi diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam 9 ml air steril pada tabung. Pengenceran berseri dilakukan terhadap sampel tanah sampai Dari pengenceran 10-3, 10-4, 10-5, setiap 0,1 ml suspensi ditumbuhkan dengan metode sebar pada media NA untuk bakteri, PDA dan MA untuk menumbuhkan cendawan. Identifikasi A. Bakteri Identifikasi bakteri berdasarkan kunci identifikasi yang dikemukakan oleh Schaad et al. (2001) (Lampiran 2) dan Brown et al. (1980). Beberapa uji yang dilakukan untuk mengetahui genus bakteri hasil isolasi rizosfer tanaman pepaya IPB 9 yang terinfeksi penyakit busuk basah maupun yang tidak terinfeksi, sebagai berikut: 1. Uji Gram (KOH 3%) Uji ini dilakukan dengan mencampurkan satu lup isolat bakteri pada gelas obyek yang telah ditetesi KOH 3%, kemudian diamati terbentuk tidaknya lendir. Jika terbentuk lendir maka bakteri tersebut dikelompokkan ke dalam Gram-negatif dan sebaliknya jika tidak terbentuk lendir maka bakteri tersebut tergolong Gram-positif. 2. Uji Oksidatif/Fermentatif Uji Oksidatif/Fermentatif dilakukan dengan menumbuhkan bakteri uji pada media Oksidatif/fermentatif (Lampiran 1) dengan ph 7.2 pada tabung

3 9 reaksi. Masing-masing bakteri uji diiinokulasikan pada 2 tabung reaksi. Bakteri uji diinokulasikan pada media dengan cara menusukkannya pada kedalaman 0,5 cm, kemudian ditutup dengan paraffin oil steril pada salah satu tabung, sedangkan tabung yang satunya tanpa diberi parafin. Kontrol pada pengujian ini berupa media uji tanpa bakteri. Pengamatan dilakukan selama 7-14 hari. Jika terjadi perubahan warna menjadi kuning hanya pada media uji tanpa paraffin oil berarti bakteri tersebut bersifat oksidatif, sedangkan bakteri bersifat fermentatif jika mengalami perubahan warna menjadi kuning, baik pada media berparafin maupun tanpa parafin (Brown et al. 1980). 3. Uji Pembentukan Endospora Uji ini hanya dilakukan pada bakteri Gram-positif untuk mengetahui keberadaan endospora pada sel bakteri. Pertama, satu lup suspensi bakteri dicampurkan dengan akuades steril yang telah ditetesi pada kaca preparat dan telah dikeringanginkan, kemudian ditetesi malachite green 5%, didiamkan selama 10 menit hingga mengering, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan, selanjutnya ditetesi larutan safranin 0,5% selama 15 detik, dibilas dengan air, dan dikeringkan sambil dilewatkan di atas Bunsen. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop compound dengan perbesaran kuat 100x menggunakan minyak imersi. Sel bakteri akan terlihat berwarna merah, spora yang masih menempel berwarna transparan, dan spora yang sudah terlepas berwarna hijau kebiruan. 4. Uji Fluoresensi Pengujian ini dilakukan untuk membedakan kelompok bakteri Pseudomonas sp. dengan kelompok bakteri lainnya. Bakteri yang akan diuji digores pada media King s B (Lampiran 1) dan diinkubasi selama jam kemudian diamati di bawah sinar UV. Jika berpendar dengan menghasilkan warna biru kehijauan maka bakteri tersebut merupakan kelompok bakteri Pseudomonas.

4 10 5. Uji Levan Pengujian ini dilakukan dengan menggoreskan bakteri uji pada media NA yang ditambahkan dengan 5% (b/v) sukrosa. Jika terbentuk koloni berwarna putih, berlendir dan cembung setelah diinkubasi selama 3-5 hari berarti menunjukkan reaksi positif. Uji ini untuk membedakan kelompok Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresen) patogen (bereaksi positif) dengan yang non-patogen (Brown et al. 1980). 6. Uji Oksidase Uji ini dilakukan dengan menggoreskan koloni bakteri berumur 24 jam pada kertas saring steril yang telah ditetesi dengan larutan dimethyl-pphenylenediamine dihydrochloride 1%. Reaksi positif ditunjukkan dengan perubahan warna bakteri menjadi warna ungu gelap pada kertas saring setelah 10 sampai 15 detik (Brown et al. 1980). 7. Uji Pembusukkan Kentang Uji ini dilakukan dengan menggoreskan inokulum bakteri berumur jam pada irisan kentang yang telah disterilisasi permukaannya dengan natrium hipoklorit (NaOCl) 1%, kemudian dibilas dengan akuades selama 1 menit. Selanjutnya irisan kentang tersebut diinkubasi dalam cawan petri pada kondisi lembab. Reaksi positif ditunjukkan dengan terjadinya pembusukkan pada kentang akibat adanya enzim pektolitik setelah 24 jam penggoresan inokulum bakteri. Permukaan kentang yang diinokulasi menjadi berlendir dan terdapat lubang kecil cukup dalam. Uji ini digunakan untuk membedakan bakteri kelompok Pseudomonas yang bersifat patogenik maupun non-patogenik pada tanaman. Pada bakteri kelompok Pseudomonas non-patogen, lubang yang terbentuk lebih dangkal dan tidak terdapat lendir pada kentang yang diinokulasi (Lelliott & Stead 1987). 8. Uji Arginine Dihydrolase Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan bakteri uji ke dalam tabung reaksi yang berisi media arginin dengan cara menusukkannya sampai

5 11 kedalaman sekitar 0,5 cm, kemudian ditutup dengan menggunakan paraffin oil steril. Reaksi positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media dari jingga menjadi merah muda (Brown et al. 1980). 9. Reaksi Hipersensitif Reaksi ini berguna untuk mengetahui sifat patogenik bakteri uji. Satu lup koloni bakteri dicampur dengan 5 ml LB (luria broth), dikocok dengan kecepatan 100 rpm selama 21 jam, kemudian suspensi bakteri tersebut diinokulasi pada daun tembakau dengan cara menyuntikkan pada permukaan bawah daun. Reaksi positif ditunjukkan setelah 24 sampai 48 jam inokulasi dengan terbentuknya gejala nekrosis pada bagian daun yang disuntikkan. 10. Pertumbuhan pada Media YDC Yeast extract Dextrose CaCO 3 (YDC) merupakan salah satu media untuk membedakan pertumbuhan bakteri Erwinia sp. dengan Pantoea sp. Bakteri uji digores pada media YDC dan diinkubasi selama 48 jam. Jika koloni bakteri berwarna kuning pada media, hal tersebut menunjukkan reaksi positif. 11. Uji pada Media TZC Isolat bakteri berumur 24 jam digores ke media TZC yang telah ditambahkan larutan 2,3,5 Tryphenil Tetrazolium Chloride 1% (b/v). Media TZC berguna untuk mengetahui bakteri yang diuji bersifat virulen atau avirulen khususnya bakteri Ralstonia solanacearum (Brown et al. 1980). 12. Pertumbuhan pada Media D1M Agar D1M merupakan media semiselektif untuk pertumbuhan bakteri Agrobacterium sp. untuk membedakannya dengan Burkholderia sp., Acidovorax sp., dan Ralstonia sp. Uji ini dilakukan dengan menumbuhkan bakteri uji pada media D1M agar.

6 12 B. Cendawan Cendawan yang diperoleh dari hasil isolasi dibuat preparat slide pada kaca preparat yang telah ditetesi air steril kemudian diidentifikasi menggunakan mikroskop cahaya. Identifikasi dilakukan berdasarkan kunci identifikasi yang dikemukakan oleh Watanabe (1993) (Lampiran 3) dan Domsch et al. (1993).