BAB III BAHAN DAN METODE

Transkripsi

1 BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Pelaksanaan Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Laboratorium Pembenihan Ikan dan Kolam Percobaan Ciparanje untuk penelitian pendahuluan pada bulan Februari sampai dengan Maret Penelitian utama dilaksanakan di Laboratorium Akuakultur, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran pada bulan April sampai dengan Juni Bahan dan Alat Penelitian Bahan bahan Penelitian 1. Benih Lele Benih lele yang digunakan dalam penelitian ini adalah benih lele sangkuriang berasal dari petani lele di Sumedang dengan ukuran 7-10 cm sebanyak 530 ekor. Penelitian pendahuluan menggunakan 150 ekor benih lele Penelitian utama menggunakan 380 ekor 2. Kulit Buah Manggis Kulit buah manggis yang digunakan berasal dari Toko Babah Kuya, Jalan Pasar Barat (belakang Pasar Baru Bandung) dalam bentuk tepung halus sebanyak 1 kg. 3. Bakteri Aeromonas hydrophila Bakteri yang digunakan adalah Aeromonas hidrophila dengan kode isolat AHL-13 berasal dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Bogor. 4. Medium Bakteri Media yang digunakan untuk kultur bakteri dan uji patogenitas adalah Triptic Soy Agar (TSA) merk dagang DIFCO dengan dosis pembuatan 40 gram/l akuades. Pembuatan medium bakteri dapat dilihat pada (Lampiran 1). 5. Akuades sebanyak 5L. Akuades digunakan sebagai bahan pelarut simplisia kulit manggis 16

2 17 6. NaCl Fisiologis NaCl fisiologis digunakan sebagai larutan suspensi bakteri sebanyak 900 ml. 7. Pakan Pakan yang digunakan merupakan pakan komersil tipe 781 merk Hi-Pro-Vite sebanyak 2 kg Alat alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : Akuarium sebagai wadah penelitian sejumlah 15 buah, masing-masing berukuran 38cm x 23cm x 20 cm. Kolam beton volume 1000 L digunakan untuk penampung stok benih Aerator, selang aerasi dan batu aerasi untuk memasok O 2 pada setiap akuarium dan bak fiber Serokan sebanyak 1 buah untuk mengambil benih lele Timbangan digital merk Precise dengan ketelitian 0,001 g untuk menimbang berat benih dan tepung kulit buah manggis Tabung erlemeyer merk Herma sebanyak 15 buah sebagai wadah tepung kulit buah manggis Autoclave untuk mensterilkan media bakteri dan peralatan lainnya Hot plates untuk memanaskan media bakteri Magnetic stirrer untuk mengaduk larutan media bakteri Petri dish merk Pyrex sebanyak 10 buah sebagai wadah media agar Jarum ose sebanyak 1 buah untuk mengambil bakteri yang akan dikulturkan. L glass untuk meratakan bakteri Kertas saring Whatman no. 42 dengan diameter 5 mm yang berfungsi sebagai kertas cakram untuk menentukan zona bening Parafilm sebagai segel cawan petri untuk mencegah kontaminasi Pembakar bunsen untuk mensterilkan udara pada saat inokulasi bakteri

3 18 Inkubator untuk inkubasi bakteri Jangka sorong digital dengan ketelitian 0,1 mm sebanyak 1 buah untuk mengukur zona bening yang terbentuk Laminar flow sebagai ruang untuk menginokulasi bakteri Vortex mixer untuk homogenisasi larutan kulit buah manggis Mikro pipet merk Eppendorf dengan ketelitian 100 μl-1000μl untuk mengambil larutan bakteri Spektofotometer Genesys 10 UV untuk mengukur kepadatan bakteri dalam larutan Tabung falcon untuk membuat larutan bakteri Aeromonas hydrophila Rak tabung reaksi untuk tempat menyimpan tabung reaksi Kapas untuk menutup tabung reaksi Alumunium foil untuk membungkus peralatan yang akan digunakan sebelum disterilisasi Plastik tahan panas untuk membungkus peralatan yang akan di autoclave Tabung reaksi merk Pyrex sebanyak 5 buah sebagai wadah larutan kulit buah manggis sesuai konsentrasi uji Petri dish merk Pyrex sebanyak 5 buah sebagai wadah uji daya hambat bakteri Cuvette plastik ukuran 2 ml sebanyak 10 buah untuk kelengkapan analisis spektofotometer Suntikan 0,1 mm untuk menginfeksikan bakteri pada benih lele DO meter merk Hanna HI-3810 untuk mengukur oksigen terlarut ph meter merk Lutron ph-/44 untuk mengukur derajat keasaman Termometer dengan ukuran 0 0 C C sebanyak 1 buah untuk mengukur suhu air Ammonia Test Kit untuk mengukur amonia terlarut.

4 Metode Penelitian Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima perlakuan dan tiga ulangan. Perlakuan yang digunakan adalah pengobatan benih lele dengan cara direndam dengan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis selama 48 jam, setiap akuarium diisi dengan 20 ekor benih lele. Berdasarkan hasil uji in vitro memperlihatkan bahwa konsentrasi 1000 ppm memberikan zona hambat bakteri Aeromonas hydrophila sebesar 8,32 mm, sedangkan pada konsentrasi 5000 ppm memberikan zona hambat sebesar 8,73 mm. Hasil uji LC 50 dan LC 1 dianalisis melalui program Probit Analysis menggunakan software dari US Enviromental Protection Agency (US EPA). Hasil uji LC jam memperlihatkan bahwa konsentrasi larutan filtrat sebesar 5287,982 ppm dapat mematikan benih lele sebesar 50 % selama 48 jam sedangkan LC 1 48 jam memperlihatkan bahwa konsentrasi larutan sebesar 1690,639 ppm dapat mematikan benih lele sebesar 1 %. Berdasarkan uji in vitro dan LC 1, maka perlakuan yang digunakan adalah Perlakuan A : tanpa direndam larutan filtrat kulit buah manggis (kontrol) 0 ppm Perlakuan B: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 1000 ppm Perlakuan C: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 1500 ppm Perlakuan D: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 2000 ppm Perlakuan E: direndam larutan filtrat kulit buah manggis pada konsentrasi 2500 ppm

5 20 Model umum rancangan yang digunakan : X ij = µ + τj + Ɛij (Gasperz 1991) Keterangan X ij = hasil pengamatan pada perlakuanke-i ulangan ke- j µ = rata-rata umum τj = pengaruh perlakuan ke-i Ɛij = pengaruh faktor random perlakuanke-i ulangan ke- j 3.4 Tahapan Penelitian Tahapan penelitian yang pertama dilakukan adalah penelitian pendahuluan yang meliputi uji in vitro dan LC jam dan selanjutnya dilakukan penelitian utama. Uji in vitro bertujuan untuk mengetahui daya hambat bakteri yang disebabkan perendaman dengan menggunakan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis sedangkan untuk mengetahui tingkat toksisitas larutan filtrat terhadap benih lele dilakukan uji LC jam Penelitian Pendahuluan 1. Pembuatan larutan filtrat kulit buah manggis Pembuatan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis dilakukan dengan metode Hot Water Extract (Lampiran 2). Langkah langkah yang dilakukan adalah sebagai berikut : 1. Ditimbang simplisia bubuk kulit buah manggis sesuai konsentrasi yang diinginkan 2. Dimasukkan simplisia pada akuades steril dalam erlenmeyer dengan volume 250 ml. 3. Hasil campuran bubuk dengan akuades kemudian dipanaskan selama 15 menit pada suhu 50 0 C di atas hot plates dengan pengaduk magnetic stirrer (tiap - tiap dosis) 4. Diamkan ± 5 menit untuk diendapkan kemudian disaring dengan kertas saring kasar sampai diperoleh larutan yang digunakan untuk pengobatan

6 21 2. Uji Toksisitas (Uji LC Jam) Uji LC 50 larutan filtrat kulit buah manggis dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi larutan herbal dengan mortalitas benih lele sebanyak 50% selama 48 jam. Langkah langkah yang dilakukan untuk uji toksisitas adalah sebagai berikut : Sebelum dilakukan uji LC 50, benih lele terlebih dahulu diaklimatisasi selama 7 hari dalam bak fiber dengan volume 100 liter diberi pakan pelet secara ad libitum Akuarium dengan alat aerasi dipersiapkan Akuarium diisi air sebanyak 15 L dengan padat tebar 15 ekor/akuarium Benih lele direndam larutan filtrat simplisia kulit buah manggis sesuai perlakuan (Lampiran 3) Mortalitas ikan diamati dan dihitung pada 24 jam pertama dan kedua Kelangsungan hidup ikan dalam uji LC 50 dianalisis melalui program Probit Analysis menggunakan software dari US Enviromental Protection Agency (US EPA). Hasil uji LC jam pada benih lele ini didapatkan nilai 5287,982 (Lampiran 4). 3. Uji in vitro Uji zona daya hambat (in vitro) dilakukan untuk mengetahui kemampuan dari larutan filtrat kulit buah manggis sebagai antibakteri dalam menghambat pertumbuhan Aeromonas hydropilla. Hasil uji in vitro didapatkan dari adanya zona bening di sekitar kertas saring whatman yang telah direndam larutan. Peralatan dan bahan yang digunakan untuk uji zona daya hambat disterilisasi terlebih dahulu dengan autoclave. Metode pengerjaan dilakukan secara steril di ruang laminar flow untuk mencegah kontaminasi. Kepadatan bakteri sebesar 10 8 CFU/mL diukur dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 µm sampai diperoleh nilai OD (Optical Density) sebesar 0,235 yang setara dengan 10 8 CFU/mL.

7 22 Kertas cakram dipersiapkan dengan diameter 5 mm yang telah direndam pada larutan kulit manggis selama 24 jam kemudian diletakkan di atas media petri dish agar TSA yang telah diinokulasi dengan bakteri Aeromonas hydrophila sebanyak 0,1 ml dengan kepadatan 10 8 CFU/mL. Petri dish kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 35 0 C dalam inkubator. Setelah diinkubasi, pengamatan dilakukan dan pengukuran zona hambat dengan melihat zona bening dari setiap kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong. Semakin besar zona hambat, mengindikasikan semakin besar kemampuan larutan filtrat kulit buah manggis dalam menghambat pertumbuhan bakteri Aeromonas hydrophila. Diameter zona hambat yang dihasilkan pada uji ini kemudian diamati (Lampiran 5) Penelitian Utama Prosedur yang dilakukan selama penelitian adalah sebagai berikut : 1. Persiapan akuarium sebanyak 15 buah. 2. Air yang akan digunakan didiamkan selama sehari di bak penampungan air sebelum dimasukkan ke dalam akuarium 3. Akuarium diisi dengan air sebanyak 15 L, yang berasal dari bak penampungan air. 4. Aerasi bak penampungan air dan akuarium. 5. Ikan terlebih dahulu diaklimitasi selama seminggu. 6. Penempatan akuarium perlakuan secara acak (Lampiran 6). 7. Ikan uji dimasukkan ke dalam akuarium yang telah disiapkan dengan kepadatan 20 ekor per wadah. 8. Penginfeksian bakteri Aeromonas hydrophila dengan kepadatan 10 8 CFU/ml (Lampiran 7) sebanyak 0,1 ml dengan cara menyuntikan pada tubuh benih secara intramuscular. 9. Larutan filtrat kulit buah manggis dipersiapkan sesuai perlakuan 10. Pengamatan gejala klinis. Jika gejala klinis telah nampak, baru dilakukan pengobatan dengan larutan filtrat simplisia kulit buah manggis.

8 Setelah 48 jam perendaman, air pemeliharaan diganti dengan air baru tanpa diberikan larutan simplisia kulit buah manggis. 12. Penyiponan dan penggantian air dilakukan setiap hari selama penelitian. 13. Pemberian pakan pelet komersil secara adlibitum dengan frekuensi dua kali sehari yaitu pukul dan WIB. 14. Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setiap hari selama masa pengobatan (2 hari) dan masa pemeliharaan (21 hari). 3.5 Paramater Pengamatan Gejala klinis Gejala klinis yang diamati adalah kerusakan tubuh bagian luar dan perubahan tingkah laku benih yang mencakup respon terhadap pakan uji, keseimbangan tubuh ikan dan pergerakan renang (pasif/aktif) Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup benih benih lele dihitung berdasarkan kelangsungan hidup benih lele selama pengobatan dengan larutan simplisia kulit buah manggis setelah 23 hari pengamatan. Rumus yang digunakan dengan menggunakan rumus Effendie (1997) : Keterangan : SR = Nt No x 100% SR : kelangsungan hidup benih (%) Nt : jumlah benih hidup akhir pengamatan (ekor) No : jumlah benih hidup awal pengamatan (ekor) Kualitas Air Parameter kualitas air yang diamati adalah suhu, DO (disolved oxygen), ph, dan amonia. Parameter ini diamati selama masa pemeliharaan dan masa pemeliharaan setelah pengobatan. Pengamatan amonia dilakukan sebanyak tiga kali yaitu pada hari ketujuh, hari keempat belas dan hari kedua puluh satu setelah pengobatan.

9 Analisis Data Data kelangsungan hidup benih lele yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) atau uji F. Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan dilakukan uji lanjutan dengan menggunakan uji jarak berganda Duncan dengan taraf kepercayaan 95 % (Gasperz 1991). Data gejala klinis dianalisis secara deskriptif.