III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanankan pada bulan Juni 2009 sampai dengan Agustus Lokasi penelitian bertempat di Laboratorium Lingkungan dan Laboratorium Kesehatan Ikan, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Metode Penelitian Prosedur Penentuan Kurva Standar Alkyl Sulfate (AS) Pembuatan kurva standar ini bertujuan untuk mencari hubungan antara absorban yang terukur dengan konsentrasi AS yang dianalisa menggunakan metode MBAS (Methylen Blue Active Substances) sehingga mempermudah pada saat pengukuran kadar perlakuan, yaitu dengan memasukkan ke dalam persamaan linear yang terbentuk. Menurut APHA (1975) dalam Berlianti (2005), prosedur kerja metode MBAS adalah sebagai berikut: 1. Pembuatan larutan stok AS AS ditimbang 0,05 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukuran 50 ml dan ditambahkan akuades sampai tanda tera, lalu dikocok supaya melarut. Stok AS disimpan dalam suhu ruangan dan tidak terkena cahaya. Stok yang dibuat harus digunakan dalam waktu sebelum 12 jam penggunaan. Kemurnian AS adalah 98 %. 2. Pembuatan larutan standar Larutan stok AS diambil 1 ml dan ditempatkan pada labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan akuades sampai tanda tera. Larutan dikocok supaya melarut. 3. Pembuatan reagen MB MB sebanyak 100 mg dilarutkan dalam 100 ml akuades, lalu diambil sebanyak 30 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 1000 ml. Kemudian ditambahkan 500 ml akuades, 6,8 ml H 2 SO 4 pekat, 50 g NaH 2 PO 4 H 2 O.

2 Larutan ini dikocok sampai tercampur kemudian diencerkan sampai 1000 ml. 4. Pembuatan larutan pencuci Sebanyak 6,8 ml H 2 SO 4 pekat ditambahkan ke dalam 500 ml akuades di dalam labu ukur 1000 ml lalu ditambah 50 g NaH 2 PO 4 H 2 O dan dikocok sampai tercampur, kemudian diencerkan sampai 1000 ml. 5. Prosedur kerja MBAS Larutan standar dimasukkan kedalam labu pemisah (separatory funnel) masing-masing sebanyak 1, 5, 9, 13, dan 20 ml. Kemudian masing-masing larutan standar tersebut diencerkan dengan akuades sampai 50 ml. Lalu ditetesi dengan indikator phenol pthalin (pp) 1 tetes dan NaOH 1 N sebanyak 1 tetes. Setelah itu ditambahkan H 2 SO 4 1 N hingga berubah warna dari merah muda menjadi bening. Selanjutnya ditambahkan 5 ml kloroform dan reagen MB 12,5 ml. Kemudian dikocok selama 30 detik dan didiamkan hingga terjadi pemisahan dimana klorofom akan berada dibagian bawah. Kemudian klorofom tersebut dialirkan ke dalam labu pemisah kedua. Metode ini dilakukan sampai 3 kali dengan menggunakan 5 ml klorofom. Hasil ekstraksi dengan klorofom pada labu pemisah pertama dicampurkan ke dalam labu pemisah kedua. Kemudian ditambahkan 25 ml larutan pencuci dan dikocok selama 30 detik. Didiamkan sebentar sampai terjadi pemisahan, kemudian ekstraksi klorofom dialirkan kedalam labu ukur 50 ml dengan menggunakan corong yang telah dilapisi glass wool sebagai penyaring. Ekstraksi larutan pencuci dilakukan sebanyak dua kali dengan menggunakan 5 ml klorofom kedalam labu ukur tadi. Selanjutnya glass wool yang terdapat dicorong dibilas dengan klorofom yang dialirkan ke labu ukur tadi sampai tada tera dan nilai absorbannya dapat diketahui dengan pengukuran ke spektofotometer pada panjang gelombang 625 nm Uji Mencari Nilai Kisaran (Range Finding Test) Uji mencari nilai kisaran ini dilakukan untuk mencari dan menentukan kadar ambang atas dan ambang bawah yang digunakan dalam uji toksisitas (akut) terhadap udang galah. Kadar ambang atas adalah kadar yang menyebabkan

3 kematian hewan uji relatif lebih dari 95 % hewan uji dalam waktu dedah tertentu sedangkan ambang bawah adalah konsentrasi yang menyebabkan kelangsungan hidup hewan uji relatif lebih dari 95 % dalam waktu dedah tertentu. Uji mencari nilai kisaran dapat dilakukan dengan cara memasukkan 10 ekor udang galah dalam akurium berisi 4 liter air yang telah diaerasi beberapa hari sebelumnya, dan ketika sedang dilakukan uji air media tidak diaerasi lagi. Konsentrasi AS yang digunakan adalah 0; 4; 14; dan 34 mg/l. Ganti air dilakukan sebanyak 100 % setiap 12 jam. Untuk pengamatan udang yang mati dilakukan pada jam ke 0, 2, 4, 6, 12, 24 dan seterusnya 24 jam hingga jam ke-96. Dari nilai mortalitas yang didapat melalui uji mencari nilai kisaran dapat diketahui ambang atas dan ambang bawah yang dapat menentukan kisaran konsentrasi pada toksisitas (akut) Uji Akut Uji akut bertujuan untuk mengetahui kemampuan larutan AS dalam hal mematikan hewan uji. Toksisitas bahan uji dinyatakan dalam Median Lethal Concentration (LC 50 ), yaitu kadar bahan uji yang mematikan 50 % hewan uji selama waktu dedah tertentu. Uji akut dilakukan dengan menggunakan empat kadar bahan uji dalam selang ambang atas dan ambang bawah yang diperoleh dari persamaan (1) dan (2) serta satu perlakuan sebagai kontrol (kadar bahan uji 0 mg/l). Setiap perlakuan diulang dua kali. Persamaan (1) dan (2) adalah persamaan yang biasa digunakan untuk mencari nilai tertentu dalam interval geometris. Adapun persamaannya adalah : Log N/n = k (log a/n)..(1) a/n = b/a = c/b = d/c (2) Dimana : N = Konsentrasi ambang atas n = Konsentrasi ambang bawah k = Jumlah interval konsentrasi yang di uji antara konsentrasi ambang atas dan ambang bawah a = konsentrasi terkecil dalam deret konsentrasi yang ditentukan

4 Dengan menggunakan persamaan (1) diperoleh kadar terkecil (a mg/l). Selanjutnya dapat diperoleh nilai kadar berturut-turut sebesar b, c, dan d mg/l dengan menggunakan persamaan (2). Pada uji ini akuarium diisi air tandon dan larutan AS berdasarkan konsentrasinya yaitu 0; 8,41; 14,14; 23,77; 39,96 mg AS/l. Setelah itu baru dimasukkan udang galah sebanyak 10 ekor dengan masing-masing dua kali ulangan. Pengamatan dilakukan pada jam ke 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 dan 96 setelah hewan uji dimasukkan ke dalam wadah uji. Dalam uji ini diamati tingkah laku dan mortalitas post larva udang galah. Ganti air dilakukan sebanyak 100 % dengan selang waktu 12 jam. Sampel air diambil satu kali sebelum dan sesudah ganti air selama uji akut berlangsung. Selama uji akut udang tidak diberi makan Pemeliharaan Pasca Uji Akut Pemeliharaan pasca uji akut yaitu pemeliharaan udang galah pasca uji akut pada media air biasa. Pemeliharaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemaparan surfaktan pada uji akut terhadap pertumbuhan post larva udang galah. Pemeliharaan ini dilakukan selama 30 hari pada udang yang telah terpapar surfaktan pada saat uji akut. Selama pemeliharaan udang diberi pakan pellet dengan kadar protein 30 % secara at satiation. Sampling pertumbuhan dan pengukuran kualitas air dilakukan pada hari ke 0, 10, 20 dan 30. Pada akhir pemeliharaan dilakukan pembuatan preparat untuk uji histopatologi. 3.3 Parameter Mortalitas (Derajat Kematian) Mortalitas post larva adalah persentase dari perbandingan antara jumlah udang galah yang mati dengan jumlah udang galah yang diamati. Menurut Effendi, 1979 dalam Berlianti, 2005 mortalitas didapatkan dengan rumus berikut : Mortalitas = Jumlah udang yang mati x 100 % Jumlah total udang yang diamati

5 3.3.2 Laju Pertumbuhan Bobot Harian Pengukuran bobot udang dilakukan per ekor dengan menggunakan timbangan digital dengan ketelitian 0,01 g. Pengamatan dilakukan setiap 10 hari. Laju pertumbuhan harian dihitung dengan menggunakan rumus : Keterangan : α = Laju pertumbuhan harian (%) Wt = Bobot rata-rata udang pada saat akhir (g) Wo = Bobot rata-rata udang pada saat awal (g) t = Lama pemeliharaan (hari) (Zonnevelt et al., 1991 dalam Putri 2009) Tingkah Laku Pengamatan tingkah laku dilakukan pada saat uji akut dengan membandingkan tingkah laku antara udang pada akuarium perlakuan dengan udang pada akuarium kontrol. Pengamatan dilakukan dengan melihat aktivitas udang, cara udang berenang, dan posisi udang pada kolom air Kualitas Air Parameter kualitas air media uji ditera dengan cara disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Parameter kualitas air media uji, alat yang digunakan dan cara peneraannya. Parameter Alat Cara Peneraan Suhu ( 0 C) Termometer Pembacaan skala DO (mg/l O 2 ) DO- meter Pembacaan skala Kesadahan (mg/l CaCO 3 ) Peralatan titrasi Metode titrimetrik ph PH-meter Pembacaan skala NH 3 (mg/l NH 3 ) Spektofotometer Metode Phenate Alkalinitas Peralatan titrasi Metode titrimetrik Residu Surfaktan (mg/l) Spektofotometer Metode MBAS 3.4 Analisis Data Metode yang digunakan untuk analisis data hasil pengujian toksisitas untuk menentukan LC 50 dilakukan dengan metode analisa probit (Finney, 1971 dalam Berlianti, 2005). Analisa dilakukan secara bertahap yaitu sebagai berikut :

6 1. Data perlakuan, jumlah udang galah yang di uji dan jumlah kematian kumulatif udang galah disusun dalam suatu daftar dan data perlakuan (kadar) ditransformasikan ke dalam logaritma, apabila diperoleh nilai transformasi yang negatif maka kadar ditambah n. 2. Bila terdapat kematian pada kontrol, dan harus dikoreksi dengan rumus Aboot berikut ini : Ai = X 100% Dimana : Ai = Persentase kematian setetelah dikoreksi A = Persentase kematian tercatat pada perlakuan C = Persentase kematian tercatat pada kontrol 3. Nilai probit empiris ditentukan dari angka mortalitas setelah dikoreksi dengan menggunakan tabel transformasi probit Blis dalam Finney (1971) 4. Probit harapan, ditentukan dengan memplotkan nilai-nilai probit empiris terhadap logaritma kadar kemudian dicari persamaan regresinya. 5. Probit kerja (Y) dan koefisien bobot ditentukan dengan menggunakan Tabel koefisien bobot dan nilai-nilai probit. Dengan menggunakan rumus : Y = Yo + KP Dimana : Y = Probit kerja K = Probit kerja P Yo= Faktor Probit kerja Yo P = Persentase kematian 6. Nilai bobot (w) ditentukan dengan mengalikan koefisien bobot dengan jumlah hewan uji yang mati. 7. Tentukan nilai wx, wy, wx 2, wy 2 dan wxy serta menghitung nilai-nilai dari : x = y = b = Dimana : x = Peubah bebas dalam pencarian nilai LC 50 y = Peubah tak bebas dalam pencarian nilai LC 50 b = intersep 8. Hubungan mortalitas hewan uji (dalam probit y) dan kadar (dalam logaritma x) diduga oleh persamaan regresi garis dengan rumus :

7 y = (y bx) + bx 9. Untuk koreksi, dihitung nilai y. Apabila nilai y dengan probit harapan selisihnya kurang dari 0,2 maka perhitungan sudah benar. 10. Nilai x dihitung dengan memasukkan y = 5 dalam persamaan garis regresi diatas. Antilog nilai x adalah LC untuk penentuan ambang atas dan ambang bawah dilakukan berdasarkan metode Finney (1971) : m1 = m- 1,96 V m2 = m + 1,96 V Dimana : Antilog m1. Nilai konsentrasi ambang bawah LC 50 Antilog m2. Nilai konsentrasi ambang atas LC Rancangan Percobaan Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RAL Faktorial). Data mortalitas dan laju pertumbuhan bobot harian dianalisis dengan anova dan jika berbeda maka dilakukan uji lanjut menggunakan uji Duncan mengunakan SAS 9.1 dan Minitab 14.