BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dimulai pada bulan April sampai dengan Oktober 2011. Bahan dan Alat Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah organ bunga kakao klon Uper Amazon Hybrid (UAH) yang masih kuncup. Bahan lain yang digunakan yaitu media MS (Murashige and Skoog), phytagel dan agar-agar sebagai bahan pemadat, sukrosa, zat pengatur tumbuh (2,4-D, picloram, kinetin, adenin) dan bahan sterilan seperti agrimycin, dhitane, sodium hypoklorit 5%, alkohol, spritus dan aquades steril. Peralatan untuk pembuatan media yaitu gelas ukur, gelas piala, pipet volumetrik, magnetik stirer, spatula, kompor, botol kultur, timbangan analitik, ph meter, autoclave, dan oven. Peralatan untuk menanam antara lain Laminar Air Flow Cabinet, Petridis, lampu Bunsen, pinset, hand sprayer, pisau, dan gunting. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua percobaan, yaitu : percobaan pertama di lakukan untuk mendapatkan media terbaik yang akan dilanjutkan pada tahap berikutnya. Percobaan kedua merupakan pengulangan dari percobaan pertama untuk mendapatkan media terbaik dengan menggunakan media hasil percobaan pertama. Percobaan 1 Percobaan pertama dilakukan dengan dua tahap. Pada tahap pertama bagian bunga yang digunakan adalah bagian staminoid dan petal dengan 8 kombinasi media dengan media dasar MS yang terdiri dari : K1= 2,4-D 2 mg/l + adenine 0.1 mg/l
9 K2=2,4-D 2 mg/l + adenine 0.25 mg/l P1= picloram 1.1 mg/l + adenine 0.1 mg/l P2= picloram 1.1 mg/l + adenine 0.25 mg/l P3= picloram 2.2 mg/l + adenine 0.1 mg/l P4= picloram 2.2 mg/l + adenine 0.25 mg/l P5= picloram 3.3 mg/l + adenine 0.1 mg/l P6= picloram 3.3 mg/l + adenine 0.25 mg/l Media terbaik ditambah dengan media kombinasi baru (MS + 2,4-D 2 mg/l + kinetin 0.25 mg/l dan MS + picloram 1.1 mg/l + kinetin 0.25 mg/l) yang digunakan sebagai media lanjutan tahap kedua pada percobaan pertama dengan bahan tanam berupa kalus terbaik hasil percobaan pada tahap pertama. Percobaan 2 Percobaan kedua terdiri dari tiga sub percobaan. Pada percobaan kedua bahan tanam yang digunakan adalah bagian bunga kakao berupa staminoid dan petal. Media yang digunakan adalah media terbaik pada percobaan pertama tahap pertama ditambah dengan media kombinasi baru. Masing masing perlakuan terdiri dari 100 eksplan staminoidia dan 100 eksplan petal dengan jumlah eksplan per botol 5 eksplan. Setiap sub percobaan terdiri dari 160 botol kultur. Sub Percobaan 2.1 Pada sub percobaan 2.1 media tanam menggunakan botol kultur kecil (volume 100 ml), serta bahan pemadat agar-agar sebanyak 6 g/l dan sukrosa dengan merk dagang Gulaku 30 g/l. Percobaan ini memiliki 8 satuan percobaan dengan 4 media kombinasi dan 2 bagian bunga. Tiap satuan percobaan terdiri dari 20 botol kultur dengan 5 eksplan per botol. Sehingga penelitian ini terdiri dari 800 satuan pengamatan. Sub Percobaan 2.2 Pada sub percobaan 2.2 media tanam menggunakan botol kultur besar (volume 200 ml), serta bahan pemadat phytagel 2 g/l dan sukrosa p.a 30 g/l. Percobaan ini memiliki 8 satuan percobaan dengan 4 media kombinasi dan 2 bagian bunga. Tiap satuan percobaan terdiri dari 20 botol kultur dengan 5 eksplan per botol. Sehingga penelitian ini terdiri dari 800 satuan pengamatan.
10 Sub Percobaan 2.3 Pada sub percobaan 2.3 media tanam menggunakan botol kultur kecil (volume 100 ml), serta bahan pemadat phytagel 2 g/l dan sukrosa p.a 30 gr/l. Percobaan ini memiliki 8 satuan percobaan dengan 4 media kombinasi dan 2 bagian bunga. Tiap satuan percobaan terdiri dari 20 botol kultur dengan 5 eksplan per botol. Sehingga penelitian ini terdiri dari 800 satuan pengamatan. METODE PENELITIAN Percobaan 1 Percobaan 2 Media : K1, K2, P1, P2, P3 P4, P5, dan P6 Tahap 1 Hasil Ekaplan : Organ bunga kakao Media terbaik + media kombinasi baru Sub percobaan 2.1 Sub percobaan 2.2 Ekaplan : Organ bunga kakao Sub percobaan 2.3 Media terbaik Kalus potensi embriogenik / kalus embriogeik / embrio Tahap 2 Media terbaik + media kombinasi baru Kalus potensi embriogenik / kalus embriogeik / embrio Kalus potensi embriogenik / kalus embriogeik / embrio Gambar 1. Bagan Metode Penelitian
11 Pelaksanaan Percobaan Sterilisasi Alat Peralatan yang digunakan, meliputi alat tanam, cawan petri dan botol kultur, disterilkan untuk mencegah kontaminasi. Peralatan dicuci bersih terlebih dahulu, lalu disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada temperature 121 C bertekanan 17.5 psi selama 30 menit. Pembuatan Media Larutan stok dibuat sesuai dengan komposisi masing-masing media. Larutan stok MS dibuat untuk memudahkan pembuatan media. Larutan stok zat pengatur tumbuh 2,4-D, picloram (golongan auksin), kinetin dan adenin (golongan sitokinin) dibuat dengan konsentrasi masing-masing 1000 ppm untuk auksin, serta 100 ppm untuk sitokinin. Selanjutnya ditambahkan aquades sesuai volume yang diinginkan dan disimpan dalam lemari es. Media dibuat dari larutan stok yang ditambah gula 30 g/l media, kemudian ditambah aquades hingga volume mencapai 1 liter. Kemasaman media diatur dengan mengguanakan NaOH atau HCl hingga berkisar antara 5.5-5.8. Larutan media kemudian ditambah agar-agar 6 g/l atau 2 g/l untuk phytagel, dipanaskan sambil diaduk-aduk, lalu tuangkan ke botol kultur. Botol kemudian ditutup dengan menggunakan plastik dan diikat dengan karet gelang. Botol-botol yang berisi media perlakuan disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 C dan tekanan 17.5 psi selama 30 menit. Sterilisasi Eksplan dan Penanaman Kuncup bunga dicuci dengan tween lalu dibilas dengan air mengalir. Setelah itu bunga direndam dalam larutan fungisida selama 30 menit dan dibilas sebanyak tiga kali. Tahap selanjutnya direndam dengan Sodium hypochloride 5% selama 5 menit sambil sesekali dikocok, kemudian dibilas tiga kali dengan aquadestilata steril. Setelah itu bunga dipisahkan sesuai bagian-bagiannya yaitu mahkota (petala), dan staminoid. Bagian bunga yang dipisahkan, ditanam pada media MS tanpa ZPT selama 5 hari setelah tanam (HST).
12 Penginduksian kalus Eksplan yang steril ditumbuhkan ke dalam media MS dengan penambahan ZPT sesuai perlakuan yang ditambah dengan sukrosa 30 g/l dan phytagel 2 g/l atau agar-agar 6 g/l, sebanyak lima potong per botol. Kultur disimpan dalam ruang gelap dengan suhu 26-28 C. Pemeliharaan Kultur Pemeliharaan dilakukan dengan mempertahankan suhu ruang kultur. Botol kultur yang terkontaminasi dipindahkan dari ruang kultur untuk mencegah penyebaran kontaminasi ke seluruh botol. Pengamatan Pengamatan pada percobaan pertama antara lain : 1. Pengamatan waktu berkalus, yaitu waktu terbentuknya kalus setelah perlakuan yang dihitung berdasarkan hari setelah perlakuan. 2. Persentase eksplan berkalus merupakan perbandingan eksplan berkalus pada tiap jumlah eksplan steril. Persentase eksplan berkalus = 3. Persentase kalus berpotensi embriogenik, Persentase kalus potensi embriogenik = organ bunga berkalus organ bunga yang steril 100% kalus potensi embriogenik organ bunga steril berkalus 100% Pada percobaan kedua, pengamatan yang dilakukan antara lain : 1. Persentase eksplan berkalus, Persentase eksplan berkalus = organ bunga berkalus organ bunga yang steril 100% 2. Persentase warna kalus, yaitu persentase warna tampilan kalus dengan kriteria warna kalus putih kekuningan dan browning. Persentase warna kalus putih kekuningan atau browning = warna kalus putih kekuningan atau browning organ bunga steril berkalus 100%
13 3. Persentase kalus potensi embriogenik, 4. Persentase embrio, Persentase kalus potensi embriogenik = Persentase embrio = kalus potensi embriogenik organ bunga steril berkalus 100% embrio kalus potensi embriogenik 100%