BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juni 2010 sampai dengan bulan Oktober 2010 di Laboraturium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan tanaman digunakan eksplan tunas Nepenthes mirabilis steril yang telah dikecambahkan dari biji yang diperoleh dari Kalimantan pada media ½ komposisi hara makro dan mikro media MS dan telah berumur ± 1.5 tahun sejak dikecambahkan. Eksplan yang digunakan berukuran 1.5 cm dengan menyisakan 2 ruas batang dari pucuk dan tidak menghilangkan bagian apikal tanaman serta menyisakan 2 helai daun. Bahan untuk media tanam meliputi zat pengatur tumbuh NAA 1 dan 2 mg/l (auksin), BAP, Kinetin dan 2iP masing-masing 0, 2.5, dan 5 mg/l (sitokinin), larutan stok MS, agar-agar 8 g/l, gula pasir 30 g/l dan aquades. Pengaturan ph media dengan menambahkan KOH (1 N) atau HCl (1 N). Bahan yang digunakan untuk sterilisasi berupa alkohol 70%. Bahan lain yang digunakan antara lain aquadest, karet gelang, plastik, tissue, spirtus dan label. Alat-alat yang digunakan antara lain botol kultur, pipet, cawan petri, labu takar, bunsen, erlenmeyer, sprayer, mata pisau, scalpel, timbangan, gunting, pinset, autoclave dan laminar air flow cabinet. Rak penyimpanan dilengkapi dengan lampu fluorescence dengan intensitas cahaya antara 500-750 lux sebagai sumber penyinaran dengan suhu ruangan diatur antara 20-22.
18 Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan metode Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial dengan dua faktor. Faktor pertama yaitu konsentrasi auksin berupa 1 dan 2 mg/l NAA, sedangkan faktor kedua yaitu jenis dan konsentrasi sitokinin berupa BAP, kinetin dan 2 ip masing-masing 0, 2.5 dan 5 mg/l. Penelitian ini terdiri dari 18 perlakuan dan masing-masing perlakuan terdiri dari 3 ulangan, sehingga terdapat 54 satuan percobaan. Setiap ulangan dari satuan percobaan terdiri atas 1 botol, setiap botol terdiri dari 3 tanaman, sehingga total terdapat 162 tanaman. Masing-masing tanaman diamati sebagai sampel. Model rancangan percobaan penelitian ini, sebagai berikut: Yijk = μ + αi + βi + (αβ)ij + εijk Keterangan: Yijk μ = Nilai pengamatan pengaruh faktor konsentrasi auksin ke-i, faktor jenis dan konsentrasi sitokinin ke-j dan ulangan ke-k = Rataan umum αi = Pengaruh konsentrasi auksin ke-i ( i = 1 dan 2 ). βj = Pengaruh jenis dan konsentrasi sitokinin ke-j ( j = 1, 2,... dan 7 ) (αβ)ij = Pengaruh interaksi konsentrasi NAA ke-i dengan jenis dan konsentrasi sitokinin ke-j εijk = Galat percobaan ( k = 1, 2, dan 3) Pengolahan data dengan menggunakan uji F hitung pada system SAS (Statistical Analysis System). Perlakuan yang berpengaruh nyata pada uji F diuji lanjut menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT) pada taraf 5%. Data yang digunakan di dalam analisis ragam di transformasi dengan.
19 Berikut notasi yang digunakan dalam penelitian ini: Tabel 1. Notasi Perlakuan NAA dan Sitokinin yang Digunakan dalam Penelitian ini. Perlakuan NAA S0 Perlakuan Sitokinin BAP Kinetin 2iP B2 B5 K2 K5 P2 P5 N1 N1S0 N1B2 N1B5 N1K2 N1K5 N1P2 N1P5 N2 N2S0 N2B2 N2B5 N2K2 N2K5 N2P2 N2P5 Keterangan: N1 : Perlakuan NAA 1 mg/l N2 : Perlakuan NAA 2 mg/l S0 : Perlakuan Kontrol tanpa Sitokinin B2 : Perlakuan BAP 2.5 mg/l B5 : Perlakuan BAP 5 mg/l K2 : Perlakuan Kinetin 2.5 mg/l K5 : Perlakuan Kinetin 5 mg/l P2 : Perlakuan 2iP 2.5 mg/l P5 : Perlakuan 2iP 5 mg/l Kombinasi perlakuan NAA dengan Sitokinin memiliki notasi yang sama dengan diatas dimana notasi NAA diikuti dengan notasi Sitokinin, contoh seperti N1B5 merupakan notasi dari kombinasi perlakuan NAA 1 mg/l dengan BAP 5 mg/l (Tabel 1). Pelaksanaan Sterilisasi Alat dan Botol Sterilisasi merupakan faktor terpenting dari keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan. Alat-alat dan botol yang digunakan dalam pembuatan media dan penanaman dicuci hingga bersih kemudian disterilkan dengan menggunakan autoclave selama satu jam pada suhu 121 dan tekanan 17.5 psi. Perhitungan
20 lama waktu dimulai ketika tekanan telah berada pada 17.5 psi selama satu jam. Alat yang perlu disterilkan antara lain pinset, botol kultur, scalpel, cawan petri, dan pengaduk. Pembuatan Larutan Stok Pembuatan larutan stok dilakukan sebelum pembuatan media tanam bertujuan untuk memudahkan dalam pencampuran media kultur. Media yang dibuat terdiri dari media Murashige Skoog (MS) dengan komposisi seperti terlampir pada Tabel Lampiran 1. Larutan stok dibuat sesuai dengan komposisi media MS yang disimpan dalam erlenmeyer dengan konsentrasi yang lebih pekat. Beberapa jenis larutan stok media MS tahan disimpan di ruangan dengan suhu ruang tetapi adapula yang harus disimpan dalam ruang pada suhu di bawah 10 C. Larutan stok F, myo-inositol dan vitamin disimpan pada suhu dibawah 10 C, sedangkan larutan stok A,B,C,D dan E dapat disimpan dalam suhu ruang. Pembuatan Media Kultur Media kultur yang digunakan dalam penelitian ini adalah media MS. Media MS dibuat dengan memipet 20 ml larutan stok A, B dan vitamin, 5 ml larutan stok C, D dan E, 10 ml larutan F dan Myoinositol ke dalam labu takar satu liter (Tabel Lampiran 1). Setelah itu ditambahkan NAA sebanyak 1 ml untuk mendapatkan media dengan konsentrasi 1mg/l dari stok 1g/l NAA dan BAP sebanyak 1 ml untuk mendapatkan media dengan konsentrasi 1mg/l dari stok 1g/l BAP. Kemudian gula dilarutkan sebanyak 30 g kedalam aquades dan dicampurkan ke dalam larutan media. Aquadest ditambahkan hingga tanda terra 1 liter. Untuk mengukur kemasaman media digunakan ph meter 5.8 diatur dengan menambahkan KOH atau HCl.
21 Larutan media yang telah siap dipindahkan ke dalam panci pemanas lalu ditambahkan agar-agar sebanyak 8 gram. Larutan media tersebut dipanaskan sambil diaduk-aduk hingga mendidih. Botol-botol kultur yang telah steril disiapkan untuk diisi dengan larutan media yang telah dipanaskan. Larutan media agar yang telah mendidih dituangkan ke dalam botol-botol kultur yang telah disediakan. Botol-botol yang telah diisi dengan larutan media agar sama rata ditutup rapat dengan plastik transparan. Botol-botol yang telah tertutup plastik dengan baik disterilkan dengan autoclave pada suhu 121 C dan tekanan 17.5 psi selama 20 menit. Media steril disimpan dalam ruang kultur. Media ini dapat digunakan setelah inkubasi selama 4 hari dan bebas dari kontaminasi. Persiapan Ruang Tanam Ruang tanam yang digunakan sebagai tempat menanam eksplan atau yang biasa disebut laminar air flow cabinet. Sebelum digunakan terlebih dahulu dibersihkan dengan menggunakan alkohol 96% dan disterilkan dengan sinar ultra violet selama 1 jam. Alat tanam dan bahan-bahan yang akan digunakan disemprot alkohol 70% sebelum di masukkan ke dalam laminar air flow cabinet. Hal ini dilakukan untuk menghindari resiko bahan penelitian terkontaminasi. Penanaman Eksplan tunas Nepenthes mirabilis diperoleh dari biji yang telah ditanam ± 1.5 tahun sejak dikecambahkan dengan media ½ komposisi hara makro dan mikro media MS. Eksplan dipilih dari dalam botol yang memiliki penampilan baik, seperti pertumbuhan optimum, daun hijau tua, tidak berwarna kuning, tidak vitrus dan tidak berkalus. Eksplan diambil dari tunas yang dipotong dari pangkal batang tanpa akar, tiap potongan berukuran 1 sampai 1.5 cm dengan 2 buah ruas dan 2 helai daun awal serta tanpa pemotongan tunas apikal. Potongan kecil ini kemudian
22 ditanam di media perlakuan. Setiap botol kultur terdiri dari 3 eksplan. Botol kultur yang telah ditanami diletakkan di rak dalam ruang kultur di bawah cahaya penuh. Pemeliharaan Pemeliharaan dilakukan dengan pengontrolan harian maupun mingguan. Penyemprotan alcohol 70% dilakukan tiap minggu dan penggantian tutup botol jika tutup botol yang lama telah rusak. Kondisi ruang kultur dipertahankan antara 20-22 ºC. Intensitas cahaya dipertahankan pada 500-750 lux dengan pencahayaan selama 16 jam per hari. Pengamatan Pengamatan dilakukan selama 10 minggu. Pengamatan dilakukan setiap hari maupun minggu. Peubah yang diamati antara lain: 1. Persentase eksplan kontaminasi diamati seminggu sekali hingga akhir pengamatan. 2. Presentase kultur yang hidup diamati di akhir pengamatan. 3. Warna tanaman diamati di awal dan di akhir pengamatan. 4. Jumlah tunas diamati setiap minggu hingga akhir pengamatan. 5. Jumlah daun diamati setiap minggu hingga akhir pengamatan. 6. Jumlah akar diamati setiap minggu hingga akhir pengamatan. 7. Jumlah kantong diamati setiap minggu hingga akhir pengamatan. 8. Waktu inisiasi akar diamati setiap hari hingga akar pertama muncul. 9. Waktu inisiasi tunas diamati setiap hari hingga tunas pertama muncul. 10. Waktu inisiasi daun diamati setiap hari hingga daun pertama muncul. 11. Waktu inisiasi kantong diamati setiap hari hingga kantong pertama muncul.