13 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Juli 2011 hingga bulan Februari 2012 di Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Institut Pertanian Bogor. Induksi mutasi kromosom padi dilakukan di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Atom dan Nuklir (PATIR-BATAN), Jakarta Selatan. Alat dan Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian ini meliputi bahan media tanam, bahan tanaman dan bahan sterilisasi. Bahan yang digunakan sebagai media tanam adalah larutan media tanam MS (Murashige-Skoog), NAA dan BAP untuk menginduksi pembentukan tunas, agar-agar, serta Polyethylene glycol (PEG) 6000 sebagai penginduksi cekaman kekeringan pada eksplan. Bahan tanaman yang dipakai adalah benih padi varietas Sintanur yang diperoleh dari Balai Penelitian Padi (BALITPA) Sukamandi. Benih berasal dari hasil panen pada musim tanam kedua tahun 2009. Bahan sterilisasi yang digunakan adalah Sodium Hipoklorit (NaClO 3 ) 5% dan alkohol. Bahan lain yang digunakan adalah aquades, spirtus, alkohol 70%, tissue dan plastik wrap. Alat yang dipakai untuk penelitian ini adalah alat iradiasi gamma Chamber, botol kultur, alat-alat kultur, autoclave dan Laminar Air Flow Cabinet. Metode Pelaksanaan Disain perlakuan menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan dua faktor yaitu: perbedaan dosis iradiasi sebagai faktor I dan taraf konsentrasi PEG sebagai faktor II. Perlakuan dosis iradiasi yang digunakan terdiri dari lima taraf yaitu R0=0 Gy, R1=100 Gy, R2=200 Gy, R3=300 Gy, R4=400 Gy, dan R5=500 Gy. Iradiasi sinar gamma yang digunakan berasal dari Cobalt 60.
Jumlah PEG yang dibutuhkan untuk menginduksi cekaman kekeringan dapat dihitung dengan menggunakan rumus: 14 Y = Tekanan osmotik (bar) C = Konsentrasi PEG 6000 (g/l) T = Suhu ( 0 C) (Michel dan Kaufmann, 1973). Perlakuan konsentrasi PEG terdiri dari empat taraf yaitu I0= 0 g/l, I1= 116,538 g/l (-0,2 bar), I2= 174,674 g/l (-0,4bar) dan I3= 219,547 g/l (-0,6 bar). Masingmasing perlakuan diulang sebanyak 5 ulangan yang terdiri dari 10 benih sebagai eksplan yang diamati sehingga terdapat 1200 satuan amatan. Model rancangan percobaan yang digunakan adalah: Y ijk μ = pengamatan pada dosis iradiasi ke-i, konsentrasi PEG ke-j, dan ulangan ke-k; = rataan umum; α i = pengaruh dosis iradiasi ke-i, i = 1,...,5; β j = pengaruh konsentrasi PEG ke-j, j = 1,...,5; ε ijk = pengaruh acak pada dosis iradiasi ke-i, konsentarsi PEG ke-j dan ulangan ke-k, k = 1,...,10 (Gomez dan Gomez, 1995). Data yang dihasilkan dianalisis menggunakan uji F serta dilakukan uji lanjut Duncan Multiple Range Test (DMRT). Pelaksanaan Percobaan Sterilisasi Alat Tanam. Semua peralatan yang dipakai dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril untuk mengurangi persentase kontaminasi. Alat tanam, botol kultur serta Laminar Air Flow Cabinet harus disterilisasi terlebih dahulu sebelum digunakan. Sterilisasi botol kultur, alat kultur serta air steril dilakukan dengan cara memasukkan ke dalam autoclave dengan suhu 121 C dan tekanan 17.5 psi (pound per square inch) selama 60 menit. Sterilisasi alat tanam seperti pinset, scalpel, gunting dan cawan petri dibungkus dahulu dengan
15 menggunakan kertas sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Setelah disterilisasi, botol kultur disimpan pada rak bersih, kering dan tertutup. Sedangkan untuk alat tanam disimpan dalam oven untuk mencegah menempelnya sumber kontaminan pada alat kultur. Sterilisasi Laminar Air Flow Cabinet dilakukan dengan menggunakan sinar UV selama 1 jam sebelum digunakan atau dengan membersihkannya dengan menggunakan alkohol 70%. Persiapan Media Tanam. Media tanam yang dipakai untuk kultur in vitro setelah benih diiradiasi adalah jenis Murashige-Skoog, (1962) dengan zat pengatur tumbuh NAA 0,1 mg/l dan BAP 1 mg/l serta penambahan PEG. PEG yang diberikan sesuai dengan tingkat cekaman pada masing-masing perlakuan. Tahapan pembuatan media dimulai dengan memipet larutan stok sesuai dengan konsentrasi yang dibutuhkan untuk membuat 1 liter media. Selanjutnya media ditambahkan gula, zat pengatur tumbuh dan PEG sesuai perlakuan. Setelah itu, media ditambahkan aquades hingga mencapai 1 liter. Kemudian larutan media yang telah bervolume 1 liter diukur phnya. Media tanpa penambahan PEG, ph media adalah sebesar 5,9. Sedangkan media seleksi dengan PEG, ph media adalah sebesar 6,2. Untuk mengatur ph media digunakan HCl 1 N dan KOH 1 N. Media yang telah diukur phnya ditambahkan agar-agar dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu media dimasukkan ke dalam botol kultur bervolume 200 ml yang telah disterilisasi sebanyak 20 ml serta ditutup dengan plastik bening tahan panas dan karet. Media yang telah ditutup disterilisasi dengan menggunakan autoclave selama 20 menit lalu disimpan pada rak penyimpanan media. Iradiasi Bahan Tanam. Benih yang digunakan sebagai bahan tanaman diiradiasi terlebih dahulu sesuai dengan dosis yang telah ditentukan. Iradiasi dilakukan pada bulan Maret 2011 di Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi Badan Tenaga Atom dan Nuklir (PATIR-BATAN), Jakarta Selatan. Benih diiradiasi menggunakan gamma chamber dengan sumber iradiasi berasal dari Cobalt 60. Masing-masing dosis iradiasi dilakukan pada 300 butir benih yang telah dimasukkan ke dalam botol kultur bervolume 200 ml. Sterilisasi Bahan Tanam. Benih yang telah diiradiasi, dikupas dahulu untuk menghilangkan sekam yang ada. Pengupasan dilakukan untuk
16 memaksimalkan kerja bahan sterilan yang digunakan. Benih selanjutnya dicuci dengan menggunakan detergen dan dibilas dengan air bersih. Selanjutnya benih direndam dengan alkohol 70% selama 10 menit sambil dikocok. Setelah 10 menit, benih dibilas dengan aquadestilata steril dan direndam kembali sebentar ke dalam alkohol 70%. Setelah itu, benih direndam dalam larutan sodium hipoklorit konsentrasi 50 % selama 30 menit dan kemudian direndam kembali dalam larutan sodium hipoklorit 10% selama 15 menit. Benih yang telah disterilisasi langsung ditanam pada masing-masing media perlakuan yang telah disiapkan. Pindah Tanam. Pindah tanam dilakukan setelah bibit/planlet berumur satu bulan setelah kultur atau setelah benih bertunas dan diulang setiap satu bulan sekali untuk mencegah kematian karena kekurangan unsur hara. Bila planlet yang akan dipindah tanam memiliki lebih dari dua tunas maka dilakukan pemisahan terlebih dahulu. Pengamatan Pengamatan yang dilakukan pada masing-masing sampel meliputi: 1. LD 50 iradiasi yang diamati dengan cara menghitung benih yang berkecambah setelah ditanam pada media kultur mulai dari minggu pertama hingga minggu sebelum pindah tanam. Kriteria benih yang tumbuh yaitu benih berkecambah. 2. Tinggi tunas diamati dengan cara mengukur tinggi tanaman. Pengukuran dilakukan mulai dari akar hingga daun tertinggi. Pengamatan tinggi tunas akan dilakukan pada saat subkultur untuk mengurangi kesalahan paralaks pada saat pengukuran serta mengurangi persentase kontaminasi. 3. Jumlah anakan yang terbentuk serta kondisi morfologi anakan pada masingmasing eksplan. Penghitungan jumlah anakan dilakukan setiap minggu mulai dari minggu pertama hingga minggu akhir pengamatan. 4. Waktu benih berkecambah dan tipe perkecambahan benih. Selain ditanam pada media kultur, benih juga dikecambahkan dengan menggunakan metode uji kertas digulung didirikan dalam plastik (UKDdp). Tipe perkecambahan benih terbagi ke dalam dua jenis yaitu kecambah normal dan tidak normal. Penggolongan kecambah dilakukan berdasarkan kriteria abnormal jika tidak
memiliki akar primer, akar sekunder tidak berkembang serta plumula (calon daun) tidak berkembang. 17 A. Normal B. Abnormal Gambar 3. Kecambah padi varietas Sintanur yang dikecambahkan dengan metode UKDdp. A. Kecambah normal; B. Kecambah abnormal 5. Persentase keragaman fenotipe (% KKF) (Murdaningsih et al. 1999) Kategori keragaman berdasarkan % KKF an a a a ak an a aan a ak an, < 24,9 sempit (S) 24,9 < 49,7 agak sempit (AS) 49,7 < 74,7 agak luas (AL) 74,7 < 99,65 luas (L) >99,65 sangat luas (SL)