43 Lampiran 1. Diagram Alur Penelitian Limbah Udang Pengecilan Ukuran Sterilisasi suhu 121 c, tekanan 1 atm Dianalisis kadar air dan bahan keringnya Persiapan Penyediaan dan Pembuatan Inokulum Bacillus licheniiformis dan Saccharomyces cereviseae 1. Pembuatan Media 2. Pembuatan Larutan Mineral 3. Perbanyakan Mikroba 4. Pembuatan Inokulum Fementasi oleh Bacillus licheniformis 20 Sampel diinokulasi B. licheniformis dosis 3% suhu 45 o C Lama fermentasi : P1= 1 hari, P2= 2 hari, P3= 3 hari, P4= 4 hari, P5= 5 hari Fermentasi oleh Saccharomyces cereviseae Limbah udang produk fermentasi B. licheniformis diinokulasi S.cereviseae dosis 3% suhu 35 o C Lama fermentasi: P1= 5 hari, P2= 4 hari, P3= 3 hari, P4= 2 hari, P5= 1 hari
Lampiran 2. Cara Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri dengan Metode Total Plate Count (TPC) Perhitungan jumlah koloni yang tumbuh ditentukan dengan metode Total Plate Count (TPC). Prinsip dari metode ini adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni. Koloni tersebut dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Tahapannya adalah sebagai berikut: 1. Sebanyak 1 ml sampel diencerkan dengan NaCl fisiologis sampai 10-9 dan 10-10, dengan cara menyiapkan 10 deret tabung reaksi steril. Masingmasing tabung reaksi diisi 9 ml NaCl fisilogis. 2. Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi No. 1 kemudian digoyang-goyang. Dari tabung tersebut diambil sampel sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi No. 2, goyang-goyangkan. 3. Selanjutnya dilakukan cara yang sama sampai dengan tabung No. 10. Dari tabung No. 9 dan No. 10 diambil sampel 1 ml untuk dimasukkan kedalam cawan petri steril yang sudah berisi Nutrient broth Agar (NBA). 4. Selanjutnya digoyang-goyangkan sampai merata dan diinkubasi pada suhu 45 o C selama 48 jam. Koloni-koloni yang tumbuh dapat dihitung dengan memberi tanda pada dasar cawan petri. Perhitungannya adalah sebagai berikut: CFU/ml = Jumlah koloni per cawan x 44
Lampiran 3. Cara Perhitungan Jumlah Koloni Khamir dengan Metode Total Plate Count (TPC) Prinsip dari metode Total Plate Count (TPC) ini adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada media agar, maka mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni. Koloni tersebut dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Tahapannya adalah sebagai berikut: 1. Sebanyak 1 ml sampel diencerkan dengan NaCl fisiologis sampai 10-6 dan 10-7, dengan cara menyiapkan 7 deret tabung reaksi steril. Masing-masing tabung reaksi diisi 9 ml NaCl fisilogis. 2. Sebanyak 1 ml sampel dimasukkan kedalam tabung reaksi No. 1 kemudian digoyang-goyang. Dari tabung tersebut diambil sampel sebanyak 1 ml kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi No. 2, goyang-goyangkan. 3. Selanjutnya dilakukan cara yang sama sampai dengan tabung No. 7. Dari tabung No. 6 dan No. 7 diambil sampel 1 ml untuk dimasukkan kedalam cawan petri steril yang sudah berisi Ekstrak Toge Agar (ETA). 4. Selanjutnya digoyang-goyangkan sampai merata dan diinkubasi pada suhu 35 o C selama 48 jam. Koloni-koloni yang tumbuh dapat dihitung dengan memberi tanda pada dasar cawan petri. Perhitungan yang dilakukan sama seperti perhitungan jumlah koloni bakteri. 45
Lampiran 4. Perbanyakan dan Perhitungan Total Plate Count (TPC) Bakteri Bacillus licheniformis Pada Media Nutrient Broth Agar 46 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl +1 ml Inokulum + 1ml 10-1 + 1ml 10-2 + 1ml 10-3 + 1ml 10-4 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl 9 ml NaCl + 1ml 10-9 + 1ml 10-8 + 1ml 10-7 + 1ml 10-6 + 1ml 10-5 NBA+1 ml 10-10 NBA+1 ml 10-9 (Diinkubasi selama 48 jam) Perhitungan : CFU/ml = Jumlah koloni per cawan X
Lampiran 5. Perbanyakan dan Perhitungan Total Plate Count (TPC) Khamir Saccharomyces cerevisiae Pada Media Ekstrak Toge Agar 47 10-3 10-2 10-1 1 ml 1 ml 9 ml NaCl+1 ml inokulum 9 ml NaCl+1 ml 10-1 9 ml NaCl+1 ml 10-2 10-4 10-5 10-6 1 ml 1 ml 9 ml NaCl+1 ml 10-5 9 ml NaCl+1 ml 10-4 9 ml NaCl+1 ml 10-3 10-7 ETA+1 ml 10-7 ETA+1 ml 10-6 (Diinkubasi selama 48 jam) 9 ml NaCl+1 ml 10-6 Perhitungan : CFU/ml = Jumlah koloni per cawan X
48 Lampiran 6. Prosedur Penentuan Protein Metode Lowry A. Penyiapan Kurva Standar Larutan Protein 1. Menyiapkan larutan protein sekitar 300 µ g/ml. 2. Menyiapkan larutan protein tersebut dalam tabung reaksi sehingga kadarnya bertingkat dari 30-300 µ g/ml. 3. Menambahkan kedalam masing-masing tabung 8 ml reagen lowry B dan biarkan paling sedikit 10 menit. 4. Menambahkan kemudian 1 ml reagen lowry A, gojog dan biarkan 20 menit. 5. Membaca OD (absorbance) pada panjang gelombang 600 nm dengan spektrofotometer. 6. Membuat kurva standar pada kertas grafik yang menunjukkan hubungan antara OD (pada ordinat) dan konsentrasi (pada absis). B. Penyiapan Sampel 1. Mengendapkan larutan protein sampel (contoh, cuplikan) yang terlarut misalnya enzim, albumin dan lain-lain terlebih dahulu dengan amonium sulfat krsital (jumlahnya sampai mendekati kejenuhan amonium-sulfat dalam larutan). 2. Memisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. 3. mempresipitat yang merupakan protein kemudian perlu dilarutkan kembali dengan bufer asam asetat ph 5 misalnya sampai 10 ml. 4. Mengambil volume tertentu dari larutan protein sampel dan melakukan prosedur seperti pada A mulai dengan penambahan reagen lowry B dan seterusnya.
49 5. Membaca kadar protein dari OD yang didapat dari larutan sampel dengan menggunakan kurva standar diatas.
50 Lampiran 7. Prosedur Penentuan Gula Pereduksi Metode Luff Schoorl 1. Menimbang bahan padat yang sudah dihaluskan sebanyak 2,5-25 g dan pindahkan kedalam labu takar 100 ml, tambahkan 50 ml aquades. Tambahkan bubur AI (OH) 3 atau larutan Pb-asetat. Penambahan bahan penjernih ini diberikan tetes demi tetes sampai penetesan dari reagensia tidak menimbulkan pengeruhan lagi. Kemudian tambahkan aquades sampai tanda dan disaring. 2. Menampung filtrat dalam labu takar 200 ml. Menghilangkan kelebihan Pb tambahkan Na 2 CO 3 anhidrat atau K atau Na-oksalat atau larutan Na-fosfat 8% secukupnya, kemudian ditambah aquades sampai tanda, digojog dan disaring. Filtrat bebas Pb bila ditambah K atau Na oksalat atau Na-fosfat atau Na 2 CO 3 tetap jernih. 3. Mengambil 25 ml filtrat bebas Pb dan tambahkan 25 ml larutan luff schoorl dalam erlenmeyer. 4. Membuat pula perlakuan blanko yaitu 25 ml larutan luff schoorl dengan 25 ml aquades. 5. Menambahkan beberapa buir batu didih, kemudian erlenmeyer dihubungkan dengan pendingin balik dan didihkan. Pendidihan larutan dipertahankan selama 10 menit. 6. Mendinginkan larutan dan menambahkan 15 ml KI 20% dan dengan hatihati menambahkan 25 ml H 2 SO 4 26,5%. 7. Menitrasi yodium yang dibebaskan dengan larutan Na-thiosulfat 0,1N memakai indikator pati sebanyak 2-3 ml untuk memperjelas perubahan warna pada akhir titrasi maka sebaiknya pati diberikan pada saat titrasi hampir berakhir.
51 8. Melakukan perhitungan dengan mengetahui selisih antara titrasi blanko dan titrasi contoh kadar gula reduksi dalam bahan.
Lampiran 8. Perubahan Jumlah Mikroba (CFU/ml) pada Limbah Udang yang Difermentasi oleh Bacillus licheniformis dilanjutkan oleh Saccharomyces cereviseae 52 Jumlah Sel Bacillus licheniformis Perlakuan Ulangan 1 2 3 4 Rataan... (x 10 9 CFU/ml)... P1 4,60 4,30 3,30 4,30 4,12 P2 4,30 5,20 4,60 4,00 4,52 P3 3,60 6,40 5,40 5,70 5,27 P4 6,50 7,00 7,20 6,90 6,90 P5 6,60 8,10 6,10 8,90 7,42 Jumlah Sel Saccharomyces cereviseae Perlakuan Ulangan 1 2 3 4 Rataan... (x 10 7 CFU/ml)... P1 3,70 2,80 3,40 2,90 3,20 P2 3,70 3,90 3,10 3,50 3,55 P3 4,40 4,60 4,10 3,90 4,25 P4 4,70 5,10 5,60 5,40 5,25 P5 4,60 4,90 4,00 5,30 4,70
53 Lampiran 9. Analisis Statistik Pengaruh Lama Fermentasi oleh Bacillus licheniformis dilanjutkan oleh Saccharomyces cereviseae pada Limbah Udang terhadap Kandungan Protein Produk Ulangan Perlakuan P 1 P 2 P 3 P 4 P 5...... %... 1 37,96 40,02 41,68 46,03 48,49 2 37,51 40,09 41,77 46,41 47,03 3 37,32 40,18 41,60 46,20 46,44 4 38,43 39,63 41,49 46,36 47,06 Jumlah 151,22 159,92 166,54 185,00 189,02 Rata-rata 37,80 39,98 41,63 46,25 47,25 Perhitungan: FK = = = = 36269,64 JKT = (Y 2 )- FK = (37,96) 2 +(37,51) 2 +(37,32) 2 +(38,43) 2 +...+(47,06) 2 36269,64 = 36536,079-36269,64 = 266,439 JKP = - FK = -36269,64 = 263,116 JKG = JKT- JKP = 266,439 263,116 = 3,323 KTP = = = 65,779 KTG = = = 0,221 Fhit = = 297,64
54 Daftat Sidik Ragam Pengaruh Perlakuan terhadap Kandungan Protein Produk Sumber Db JK KT F hit F 0,05 Keragaman Perlakuan 4 263,116 65,779 297,64 3,06 Galat 15 3,323 0,221 Total 19 266,439 Keterangan: F hit > F 0,05 yang berarti berbeda nyata
Lampiran 10. Uji Jarak Berganda Duncan Pengaruh Lama Fermentasi oleh Bacillus licheniformis dilanjutkan oleh Saccharomyces cereviseae pada Limbah Udang terhadap Kandungan Protein Produk 55 Uji jarak berganda Duncan S x = = = 0,235 LSR = SSR x S x P SSR (0,05) S x LSR 2 3,01 0,235 0,707 3 3,16 0,235 0,742 4 3,25 0,235 0,764 5 3,31 0,235 0,778 Uji Jarak Berganda Duncan LSR 0,05 Signifikansi Perlakuan Rataan Selisih Rataan P 1 37,805 a P 2 39,980 2,175 0,707 b P 3 41,635 3,830 1,655 0,742 c P 4 46,250 8,445 6,270 4,615 0,764 d P 5 47,255 9,450 7,275 5,620 1,050 0,778 e Keterangan : Huruf yang berbeda dalam kolom signifikansi menunjukan pengaruh perlakuan berbeda nyata (P<0,05)
Lampiran 11. Analisis Statistik Pengaruh Lama Fermentasi oleh Bacillus licheniformis dilanjutkan oleh Saccharomyces cereviseae pada Limbah Udang terhadap Kandungan Glukosa Produk Ulangan Perlakuan P 1 P 2 P 3 P 4 P 5... %... 1 2,36 4,72 6,70 7,08 9,00 2 3,54 2,36 7,08 7,73 9,44 3 2,50 4,72 7,08 8,26 7,08 4 4,72 3,93 6,00 9,44 8,50 Jumlah 13,12 15,73 26,86 32,51 34,02 Rata-rata 3,280 3,932 6,715 8,127 8,505 56 Perhitungan: FK = = = = 747,13 JKT = (Y 2 )- FK = (2,36) 2 +(3,54) 2 +(2,50) 2 +(4,72) 2 +...+(8,50) 2 747,13 = 853,05-747,13 = 105,92 JKP = - FK = -747,13= 91,69 JKG = JKT- JKP = 105,92-91,69 = 14,23 KTP = = = 22,92 KTG = = = 0,948 Fhit = = 24,177
57 Daftar Sidik Ragam Pengaruh Perlakuan terhadap Kandungan Glukosa Produk Sumber Db JK KT F hit F 0,05 Keragaman Perlakuan 4 91,69 22,92 24,177 3,06 Galat 15 14,23 0,948 Total 19 105,92 Keterangan: F hit > F 0,05 yang berarti berbeda nyata
Lampiran 12. Uji Jarak Berganda Duncan Pengaruh Lama Fermentasi oleh Bacillus licheniformis dilanjutkan oleh Saccharomyces cereviseae pada Limbah Udang terhadap Kandungan Glukosa Produk 58 S x = = = 0,487 LSR = SSR x S x P SSR (0,05) S x LSR 2 3,01 0,487 1,466 3 3,16 0,487 1,539 4 3,25 0,487 1,583 5 3,31 0,487 1,612 Uji Jarak Berganda Duncan LSR 0,05 Signifikansi Perlakuan Rataan Selisih Rataan P 1 3,280 a P 2 3,932 0,652 1,466 a P 3 6,715 3,435 2,783 1,539 b P 4 8,127 4,847 4,195 1,412 1,583 bc P 5 8,505 5,225 4,573 1,790 0,378 1,612 c Keterangan : Huruf yang berbeda dalam kolom signifikansi menunjukan pengaruh perlakuan berbeda nyata (P<0,05)