BAHA DA METODE Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi Tanaman Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dimulai pada bulan Januari 2010 hingga Januari 2011. Bahan dan Alat Bahan tanam (eksplan) yang digunakan adalah potongan tunas samping (1 buku) dari kultur in vitro ubi kayu varietas Adira 2 dan Adira 4. Bahan lain yang digunakan meliputi gula, agar, plastik, karet gelang, dan aquades steril. Alkohol 70% dan 96%, bethadine, deterjen, dithane, agrept, clorox 10% dan 5% digunakan sebagai desinfektan, dan kinetin sebagai zat pengatur tumbuh serta CaP sebagai senyawa organik tambahan. Media dasar yang digunakan yaitu media MS (Murashige and Skoog). Peralatan yang digunakan adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoclave, cawan petri, gelas ukur, pipet, timbangan, pengaduk gelas, hand sprayer, gunting, pinset, penggaris, botol kultur, rak kultur, alat tulis, kamera digital, dan peralatan untuk aklimatisasi. Metode Penelitian Penelitian terdiri dari dua percobaan yang terpisah, masing-masing menggunakan Adira 2 dan Adira 4 sebagai bahan tanam (eksplan). Penelitian ini menggunakan rancangan faktorial dengan dua faktor yang disusun dalam Rancangan Lingkungan Acak Lengkap (RAL). Faktor pertama adalah konsentrasi kinetin, yang terdiri dari empat taraf yaitu 0 ppm, 1 ppm, 1.5 ppm, dan 3 ppm. Faktor kedua adalah konsentrasi CaP dengan tiga taraf yaitu 0 ppm, 1 ppm, dan 2 ppm. Kombinasi dari dua faktor tersebut menghasilkan 12 kombinasi perlakuan yang masing-masing perlakuan diulang sebanyak 10 kali, sehingga terdapat 120 satuan percobaan. Selain itu, juga terdapat kontrol khusus yaitu media MS dengan penambahan 3 ppm BAP yang diulang 10 kali, sehingga secara total
terdapat 130 satuan percobaan. Setiap ulangan terdiri dari satu botol kultur yang berisi satu eksplan. Model matematika yang digunakan adalah: Dimana : Y ijk Y ijk = µ + α i + β j + ( αβ) ij + ε ijk = Nilai pengamatan pada perlakuan konsentrasi kinetin ke-i, konsentrasi CaP ke-j dan ulangan ke-k µ = Rataan umum 15 α i β j ( α β ) ij = Pengaruh perlakuan konsentrasi kinetin ke-i = Pengaruh perlakuan konsentrasi CaP ke-j = Pengaruh interaksi antara perlakuan konsentrasi kinetin ke-i dan konsentrasi CaP ke-j ε ijk = Galat perlakuan Data yang diperoleh diuji dengan uji F pada taraf 5%. Jika dalam sidik ragam perlakuan berpengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan uji lanjut Uji Wilayah Berganda Duncan (DMRT) taraf 5%. Selain itu juga dilakukan analisis regresi mengenai pengaruh berbagai konsentrasi kinetin terhadap jumlah tunas dan jumlah akar yang dihasilkan. Pelaksanaan Penelitian Perbanyakan Stek Perbanyakan stek ubi kayu di lapang dilakukan untuk mendapatkan tunas samping sebagai bahan tanam (eksplan). Bahan tanam berupa stek ubi kayu varietas Adira 2 dan Adira 4 diperoleh dari Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik (BB Biogen) Cimanggu, Bogor. Stek ditanam di polybag dengan komposisi media tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1 (Gambar 3).
16 a b Gambar 3. Perbanyakan Stek Ubi Kayu:(a) Penanaman Stek Ubi Kayu Varietas Adira 2 dan Adira 4 di Polybag, (b) Stek Ubi Kayu Varietas Adira 2 dan Adira 4 yang Telah Berumur 2 Minggu Pembuatan Media MS0 dan Media Perlakuan Media MS0 dibuat sesuai dengan komposisi yang sudah ditentukan (Lampiran 1). Tahap pembuatan dimulai dengan mencampurkan semua larutan stok (larutan dengan konsentrasi pekat) yang berisi unsur hara meliputi stok A, B, C, D, E, F, Vitamin, dan Myo-Inositol. Pembuatan media MS untuk perlakuan dilakukan dengan mengambil larutan stok sesuai konsentrasi, dan kinetin serta CaP sesuai perlakuan yang dibutuhkan. Semua bahan dicampurkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala kemudian tera dengan aquades hingga volumenya menjadi 1 liter. Keasaman media dilakukan dengan menambahkan NaOH 0.1 N atau KOH 0.1 N agar ph mencapai 5.8. Botol yang berisi media disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 121 0 C, tekanan 17.5 psi (pound per square inch) selama 15 menit dan kemudian disimpan di ruang kultur. Sterilisasi Alat dan Media Sterilisasi dilakukan untuk membersihkan alat, media, dan Laminar Air Flow Cabinet sebelum digunakan. Sterilisasi Laminar Air Flow Cabinet (LAFC) dilakukan dengan penyemprotan Alkohol 70% sebelum penanaman eksplan dilakukan. Sterilisasi peralatan dilakukan dengan mencuci alat dengan air mengalir kemudian dibungkus rapi dengan menggunakan kertas dan setelah itu disterilisasi menggunakan autoclave dengan suhu 121 0 C pada tekanan 17.5 psi selama 30 menit. Alat-alat yang telah disterilisasi disimpan dalam oven pada suhu 50⁰C. Sterilisasi media kultur dilakukan dengan suhu 121 0 C dan tekanan 17.5 psi selama 15 menit.
17 Persiapan Eksplan untuk Kultur Asenik Potongan tunas samping yang didapatkan dari lapang dibersihkan dengan air mengalir selama 30 menit kemudian disikat menggunakan deterjen + tween-20 sampai bersih (Gambar 4). Setelah bersih, potongan tunas tersebut dibilas di bawah air mengalir selama 30 menit. Proses sterilisasi dilanjut dengan merendam potongan tunas ke dalam campuran larutan Agrept (2 g/l) dan Dithane (2 g/l) selama 2 jam, kemudian potongan tunas tersebut dibilas dengan air steril sebanyak 3 kali. Tahap selanjutnya, potongan tunas tersebut direndam dalam larutan antibiotik Chloramfenicol (2 g/l) selama satu malam. Sterilisasi kemudian dilanjutkan di dalam laminar air flow cabinet. Potongan tunas yang telah direndam dalam larutan antibiotik Chloramfenicol kemudian dicuci bersih dengan air steril sebanyak 3 kali. Setelah itu, potongan tunas tersebut direndam dengan Clorox 10% selama 5 menit, kemudian dibilas dengan air steril 3 kali. Merendam kembali potongan tunas dalam Clorox 5% selama 2 menit, kemudian dibilas dengan air steril 3 kali. Potongan tunas yang sudah steril kemudian diletakkan dalam cawan petri untuk selanjutnya diteteskan betadine. Tunas yang telah disterilisasi ditanam pada media pre kondisi (MS0), 4-5 eksplan per botol selama 4 MST. Potongan tunas tersebut diharapkan akan membentuk tunas untuk diambil batangnya sebagai stek mikro buku tunggal dan dipergunakan sebagai eksplan dalam perlakuan. a b Gambar 4. Persiapan Eksplan Untuk Kultur Asenik:(a) Potongan Tunas Sebelum Disterilisasi dan (b) Sterilisasi Potongan Tunas dengan Menggunakan Deterjen + Tween-20
18 Penanaman Eksplan Penanaman eksplan dilakukan di dalam LAFC yang telah disterilkan dengan Alkohol 70 %. Gunting dan pinset yang digunakan untuk memindahkan bahan tanaman dibakar dahulu kemudian diletakkan ke dalam botol steril yang berisi alkohol 96 %. Eksplan yang digunakan adalah stek mikro buku tunggal ubi kayu dengan panjang 1-3 mm. Eksplan tersebut ditanam di media MS sesuai perlakuan. Eksplan yang sudah ditanam terlebih dahulu diletakkan di ruang gelap selama 1 minggu, dengan tujuan untuk menginisiasi terbentuknya tunas. Setelah 1 minggu di ruang gelap, eksplan dipindahkan ke ruang kultur dengan penyinaran cahaya selama 24 jam dan suhu 21⁰C. Kemudian eksplan yang sudah menjadi planlet sempurna selanjutnya digunakan sebagai bahan untuk aklimatisasi. Aklimatisasi Setelah melewati masa inkubasi selama 8 minggu, planlet diaklimatisasi ke lingkungan luar. Media yang digunakan untuk aklimatisasi adalah campuran tanah dan kompos (1:1 v/v). kedua media tersebut disterilisasi di dalam autoclave selama 30 menit. Tanah dan kompos steril dicampurkan dalam bak dan disiram dengan air mendidih hingga jenuh untuk meningkatkan kesterilan media. Campuran diaduk agar merata. Setelah media tidak panas lagi, media dimasukkan ke dalam pot-pot yang telah dilubangi bagian bawahnya. Lubang tersebut berfungsi sebagai jalan keluarnya air dari dalam pot sehingga media tidak terlalu basah. Media dimasukkan hingga memenuhi 2/3 volume pot. Planlet yang akan diaklimatisasi dicuci dengan aquades steril dengan cara menyiramkan air pada planlet secara perlahan. Pada saat pencucian, sisa media in vitro yang terbawa pada akar planlet dibersihkan untuk memeperkecil resiko serangan cendawan maupun bakteri. Planlet yang bersih ditanam pada media aklimatisasi dan disungkup menggunakan plastik yang transparan. Setiap pot hanya ditanam satu planlet untuk menghindari penularan kontaminan antar tanaman. Semua pot diberi label yang berisi kode perlakuan, tanggal aklimatisasi, dan identitas planlet yang diaklimatisasi.
19 Pengamatan dan Analisis Data Pengamatan pada penelitian ini dilakukan saat kultur in vitro dan saat aklimatisasi. Beberapa peubah yang diamati saat kultur in vitro diantaranya adalah: 1. Waktu munculnya tunas pertama 2. Waktu munculnya kalus 3. Jumlah dan persentase eksplan berkalus (%) 4. Jumlah dan persentase eksplan bertunas (%) 5. Jumlah tunas per eksplan 6. Diameter kalus (mm) 7. Warna kalus 8. Struktur kalus 9. Panjang tunas terpanjang (mm) 10. Keragaan atau morfologi tunas 11. Jumlah daun 12. Jumlah eksplan berakar 13. Jumlah akar 14. Jumlah buku Peubah 1 dan 2 diamati setiap hari selama periode pengamatan berlangsung dan penentuannya berdasarkan pada saat muncul tunas atau kalus pertama. Peubah 3-14 diamati mulai pada satu minggu setelah tanam (1 MST) dan dilakukan setiap seminggu sekali hingga 10 MST. Selain pengamatan terhadap beberapa peubah saat kultur in vitro, dilakukan juga pengamatan terhadap beberapa peubah saat aklimatisasi. Pengamatan ini dilakukan dari minggu pertama hingga empat minggu setelah aklimatisasi. Peubah-peubah tersebut diantaranya adalah: 1. Persentase hidup (%) 2. Tinggi tanaman (mm) 3. Jumlah daun Hasil pengamatan baik pada saat kultur in vitro maupun saat aklimatisasi tersebut kemudian diolah dan dianalisis dengan uji berganda (DMRT), sedangkan
20 satu variabel yaitu jumlah tunas menggunakan uji lanjut Dunnett. Pengolahan data dilakukan dengan menggunakan software SAS. Diagram alur pelaksanaan penelitian kultur ubi kayu varietas Adira 2 dan Adira 4 disajikan pada Gambar 5. Penanaman stek batang ubi kayu varietas Adira 2 dan Adira 4 (tunas yang telah berumur 2 minggu siap digunakan sebagai eksplan untuk kultur asenik) Persiapan botol kultur Persiapan media MS Sterilisasi permukaan tunas samping Penanaman pada media MS0 (ditanam 2-3 minggu sampai eksplan steril) Penanaman pada media perlakuan Inkubasi di ruang kultur Pengolahan data Pengamatan (dilakukan selama 10 MST) Aklimatisasi Pengamatan (dilakukan selama 20 HSA) Gambar 5. Diagram Alur Pelaksanaan Penelitian Kultur In Vitro Ubi Kayu Varietas Adira 2 dan Adira 4