Lampiran 1. Tatacara karakterisasi limbah tanaman jagung a. Kadar Air Cawan kosong (ukuran medium) diletakkan dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan cawan kosong tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Cawan kosong tersebut ditimbang. Bahan masing-masing ditimbang 6 2 gram ke dalam cawan. Masukkan cawan yang telah berisi bahan ke dalam oven 105 o C selama 16-24 jam. Pindahkan menggunakan penjepit ke desikator untuk didinginkan selama 30 menit. Cawan berisi bahan tersebut ditimbang. b. Kadar Bahan Ekstraktif Kadar air% (bk) = (berat awal sampel berat sampel akhir) x 100 berat sampel awal Labu didih ukuran 250 ml disiapkan dalam oven (105 o C) atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan labu kosong tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Labu kosong tersebut ditimbang. Keran air dicek menyala atau tidak sebagai pendingin sokhlet. Siapkan kertas saring segi empat (sebagai kokon), tali pengikat, gunting, kapas, dan pensil 2B. Masukkan bagas masing-masing sebanyak 3 gram (berat kering oven) ke dalam kokon, tutup dengan kapas dan ikat dengan tali, kemudian tuliskan kode sampel pada kokon menggunakan pensil 2B. Kokon dipasangkan pemberat yaitu magnetic stirer. Masukkan kokon pada perangkat sokhlet dan tuang pelarut alkohol-benzene (1:2) sebanyak sekitar 2/3 isi labu didih. Ekstraksi selama 6 jam pada suhu sekitar 90 o C (set angka 50 pada hot plate), keluarkan kokon dari sokhlet, masukkan ke oven 105 o C semalam. Masukkan kembali pelarut dalam wadahnya, sementara labu yang berisi hanya zat ekstraktif di dalam oven 105 o C, keringkan semalam. Masukkan labu yang berisi zat ekstraktif ke desikator selama 30 menit, kemudian timbang. Catatan : sampel yang telah bebas ekstraktif dipisahkan untuk uji klason lignin dan holoselulosa. c. Klason Lignin (SNI 0492:2008) Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut, sedangkan cawan digunakan untuk mengukur kadar air bagas bebas ekstraktif (lihat prosedur pengukuran kadar air, namun berat bagas diganti hanya 0,5 gram). Siapkan labu takar ukuran 50 ml untuk membuat larutan H 2 SO 4 72%. Masukkan bagas bebas ekstrakif sebanyak 0.5 gram kering ke dalam beaker glass ukuran 50 ml. Selanjutnya masukkan 7.5 ml H 2 SO 4 72%. Diaduk sesekali (dapat digunakan dengan menggunakan magnetic stirer dan memasang angka 10 pada stirer plate) selama 4 jam pada suhu kamar (dilakukan dengan menuangkan air sebelum pengadukan sekitar beaker glass yang telah disangga cawan petri), masukkan bagas yang telah diaduk selama 4 jam tersebut ke dalam erlenmeyer ukuran 300 ml. Tambahkan masing-masing 280 ml akuades ke dalam erlenmeyer. Tutup erlenmeyer dengan alumunium foil rangkap dua dan diautoklaf 121 o C selama 15 menit (pada autoklaf pasang timer +20, sehingga menjadi 35). Saring langsung dengan gelas filter IG3. Cuci dengan air panas masing-masing 100 ml. Keringkan gelas IG3 yang telah berisi filtrat pada suhu 105 o C selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang. Catatan : Pembuatan H 2 SO 4 72% yaitu tuangkan 37.89 ml H 2 SO 4 95% ke dalam labu takar 50 ml, kemudian secara perlahan tambahkan akuades sampai tanda tera. d. Holoselulosa (SNI 01-1303-1989) Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut. Masukkan bagas ekstraktif sebanyak 1.5 gram kering ke dalam 26
erlenmeyer 100 ml. Kemudian masukkan masing-masing 90 ml akuades, 2.4 ml NaClO 2, 25% dan 0.12 ml asam asetat glasial 100%. Tutup dengan plastik tahan panas kemudian alumunium foil rangkap, panaskan dalam waterbath selama 1 jam (gunakan masker udara). Kemudian tanpa menunggu dingin tambahkan masing-masing 2.4 ml NaClO 2 25% dan 0.12 ml asam asetat glasial 100% berulang-ulang setiap jam sampai serbuk bagas berwarna putih (untuk TKKS 2 x penambahan, untuk hardwood 3x penambahan, untuk softwood 2x penambahan). Serbuk bagas yang telah menjadi putih segera dimasukkan ke dalam gelas filter IG3 sambil divakum, sementara menunggu penyaringan siapkan nampan yang telah diberi es batu dan air untuk memadamkan erlenmeyer yang belum disaring. Cuci dengan air dingin 250 ml pada setiap bagas. Bilas dengan aseton. Keringkan gelas filter IG3 yang telah berisi filter pada suhu 105 o C selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian timbang. Catatan : Hasil penyaringan holoselulosa siap digunakan untuk persiapan kadar alfaselulosa. e. Alfaselulosa (SNI 0444:2009) Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut. Timbang 2 labu takar 100 ml untuk membuat larutan NaOH 17.5%. Letakkan di atas cawan penyangga yang telah dituang air di stirer plate yang dipasang pada angka 10 selama 30 menit. Tambahkan maing-masing 12.5 ml akuades, biarkan selama 5 menit. Saring menggunakan gelas filter IG3. Cuci dengan akuades selama sekitar 3 menit. Cuci dengan 20 ml asam asetat glasial 10%. Cuci masing-masing dengan 500 ml air panas. Keringkan glass filter IG3 yang telah berisi filter pada suhu 105 o C selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang. Catatan : Pembuatan NaOH 17.5% : larutkan 17.5 gram NaOH pure pellets ke dalam labu takar 100 ml dengan akuades sampai tanda tera. Pembuatan asam asetat 10% : larutkan 10 ml asam asetat glasial 100% ke dalam labu takar 100 ml dengan akuades sampai tanda tera. 27
Lampiran 2. Analisis Fermentasi Analisis yang dilakukan terhadap hasil fermentasi adalah : 1) Pengukuran Biomassa Pengukuran total padatan dengan mengeringkan sampel pada oven selama 24 jam. Pengukuran dilakukan dengan penyaringan menggunakan kertas saring. Biomassa kemudian dikeringkan menggunakan oven dan ditimbang hingga bobotnya konstan Total biomassa = (bobot kertas dan bahan-bobot kontrol) g/l. 2) Kadar etanol Pengukuran kadar etanol sampel dilakukan dengan menggunakan GC (Gas Chromatography). Penentuan dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan waktu retensi standar etanol. 3) Total Gula Pereduksi (Miller, 1959) Efisiensi pemanfaatan substrat dihitung dari selisih kadar gula pereduksi awal substrat fermentasi dengan kadar gula pereduksi akhir substrat fermentasi dibanding kadar gula pereduksi awal substrat fermentasi ( S/S) dikali 100%. Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi asam 3.5- dinitrosolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 µm. a) Penyiapan Pereaksi DNS Pereaksi DNS dibuat dengan melarutkan 10.6 g asam 3.5-dinitrosolisilat dan 19.8 g NaOH ke dalam 1416 ml air. Setelah itu ditambah 306 g Na-K Tartrat. 7.6 g fenol yang telah dicairkan pada suhu 50 o C dan 8.3 g Na-metabisulfit. Larutan ini diaduk rata kemudian 3 ml larutan ini dititrasi dengan HCl 0.1 N dengan indikator Phenolphtalein. Banyaknya titran berkisar 5-6 ml. Jika kurang dari itu harus ditambahkan 2 g NaOH untuk setiap ml kekurangan HCl 0.1 N. b) Penentuan Kurva Standar Kurva standar dibuat dengan mengukur atau mengetahui kadar gula pereduksi pada glukosa pada selang 0.2-0.5 mg/l. Kemudian nilai gula pereduksi dicari dengan metode DNS. Hasil yang didapat diplotkan pada grafik secara linier. c) Penetapan Kadar Gula Pereduksi Pengujian gula pereduksi menggunakan kurva standar DNS adalah sebagai berikut : 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 3 ml pereaksi DNS. Larutan tersebut ditempatkan dalam air mendidih selama 5 m,enit. Biarkan sampai dingin pada suhu ruang. Ukur absorbansi pada panjang gelombang 550 nm. 28
Lampiran 3. Hasil Uji Etanol Mikroorganisme cerevisiae cerevisiae dan Pichia stipitis Waktu (Jam) 24 3,71 1,42 2,56 48 9,78 2,92 6,35 72 11,05 0,79 5,92 96 4,34 1,66 2,99 Pichia stipitis 24 3,79 1,58 2,68 48 13,49 1,58 7,53 72 36,93 2,45 19,69 96 5,84 1,42 3,63 Lampiran 4. Total Gula Pereduksi Terkonversi Mikroorganisme cerevisiae cerevisiae dan Pichia stipitis Waktu (Jam) Gula Pereduksi 1 (g/l) Etanol 1 (g/l) Etanol 2 (g/l) Ratarata 24 8,92 1,74 5,33 48 11,12 2,29 6,71 72 15,53 2,29 8,91 96 3,79 2,84 3,31 Gula Pereduksi 2 (g/l) Ratarata 24 8,79 2,53 5,66 48 13,71 7,70 10,70 72 28,14 4,38 16,26 96 33,42 24,15 28,79 24 6,68 16,98 11,83 48 7,83 11,81 9,82 72 10,60 23,34 16,97 96 18,34 34,10 26,22 Pichia stipitis 24 19,52 9,83 14,68 48 29,33 16,38 22,85 72 29,94 14,58 22,26 96 32,05 19,32 25,69 29
Lampiran 5. Uji Analisis Ragam Klasifikasi Satu-Arah terhadap Y(p/s) pada 96 jam. Keterangan S. cerevisiae Campuran Pichia stipitis Ulangan 1 0.071 0.082 0.110 Ulangan 2 0.054 0.031 0.027 Total Nilai Tengah 0.125 0.113 0.137 0.375 Rata-Rata 0.063 0.057 0.068 0.063 JKT 0.00491546 JKK 0.00505729 JKG 0.00014183 Sumber Keragaman Jumlah Derajat Bebas Kuadrat Tengah f Hitung Nilai Tengah Kolom 0.00014183 2 7.09173E-05 0.043282 Galat 0.00491546 3 0.001638485 Total 0.00505729 5 *α = 0.05 *f 0.05 {2.3}= 9.55 *f Hitung < f 0.05. maka perlakuan tidak berpengaruh nyata pada α = 0.05 30
Lampiran 6. Uji Analisis Ragam Klasifikasi Satu-Arah terhadap Y(x/s) pada 96 jam. Keterangan S. cerevisiae Campuran Pichia stipitis Ulangan 1 0,136 0,104 0,169 Ulangan 2 0,073 0,031 0,153 Total Nilai Tengah 0,209 0,136 0,323 0,667 Rata-Rata 0,104 0,084 0,238 0,142 JKT 0,005 JKK 0,084 JKG 0,080 Sumber Keragaman Jumlah Derajat Bebas Kuadrat Tengah f Hitung Nilai Tengah Kolom 0,080 2 0,040 25,106 Galat 0,005 3 0,002 Total 0,084 5 *α = 0.05 *f 0.05 {2.3}= 9.55 *f Hitung >f 0.05. maka perlakuan berbeda nyata pada α = 0.05 31