BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 1.1 Jumlah Sel Darah Putih (Leukosit) Ikan Lele Dumbo Pada penelitian ini dihitung jumlah sel darah putih ikan lele dumbo untuk mengetahui pengaruh vitamin dalam meningkatkan kekebalan tubuhnya. Jumlah sel darah putih ikan lele dumbo yang diuji dalam penelitian ini pada minggu ketiga, yaitu minggu terakhir aklimatisasi dihitung jumlahnya dan dirata-rata sebagai jumlah awal sel darah putih ikan lele dumbo, yaitu sebanyak 96.125 sel/ml (Lampiran 6). Sejalan dengan pendapat Bond (1977), yaitu jumlah sel darah putih pada ikan normal berkisar antara 20.000-150.000 sel/ml. 600000 Jumlah Sel Darah Putih 500000 400000 300000 200000 100000 A B C D = Vitamin A = Vitamin C = Vitamin E = Vitamin A, C, dan E 0 3 4 5 6 Minggu Ke- Keterangan : a. Minggu ke-3 merupakan minggu pemeliharaan dengan pakan komersil b. Minggu ke-4 merupakan minggu pemeliharaan dengan pakan yang telah tambahkan vitamin c. Minggu ke-5 dan ke-6 merupakan minggu saat bakteri pseudomonas fluorescens telah diinfeksikan Gambar 1 Rata-rata Jumlah Sel Darah Putih Ikan Lele Dumbo Setiap Minggu Pada Gambar 4 terlihat bahwa selama penelitian jumlah sel darah putih pada minggu keempat meningkat yang menunjukkan bahwa pemberian vitaminvitamin mampu meningkatkan jumlah sel darah putih karena vitamin sebagai imunostimulan efektif dalam menstimulasi produksi sel darah putih sesuai dengan
pernyataan Sohne (2000) dalam Alifuddin dkk. (2001). Sedangkan peningkatan jumlah sel darah putih pada minggu kelima dan keenam selain karena peran vitamin sebagai imunostimulan juga menunjukkan bahwa ikan tersebut sedang mengalami infeksi bakteri. Jumlah sel darah putih terbanyak terlihat pada perlakuan D, perlakuan dengan pemberian kombinasi vitamin A, C dan E. Tingginya jumlah sel darah putih pada perlakuan ini karena kombinasi fungsi vitamin A berperan dalam menstimulasi produksi dan maturasi limfosit (Linder 1992) dan vitamin C yang berperan dalam menstimulasi respon imun nonspesifik, fagosit oleh neurofil dan monosit (Johnny dkk. 2005). Sedangkan jumlah sel darah putih terendah terlihat pada perlakuan C, perlakuan dengan pemberian vitamin E. Rendahnya jumlah sel darah putih pada perlakuan C (vitamin E) dibandingkan dengan perlakuan dengan penambahan vitamin A, vitamin C maupun vitamin kombinasi karena vitamin E berperan untuk meningkatkan jumlah trombosit/keping darah yang berfungsi dalam pembekuan darah serta berperan dalam menghasilkan protein kekebalan yang disebut interleukin-2, yang menginduksi perbanyakan sel darah putih. Oleh sebab fungsinya yang tidak langsung berdampak terhadap sel darah putih maka vitamin E membutuhkan waktu dalam meningkatkan jumlah sel darah putih. Hasil analisis sidik ragam memperlihatkan bahwa ikan uji yang diberi pakan dengan vitamin A dan kombinasi vitamin A, B dan C memberikan pengaruh yang nyata terhadap penambahan jumlah sel darah putih (Lampiran 7). Hasil uji berjarak Duncan pada taraf 5% memperlihatkan bahwa perlakuan A (vitamin A) dan D (kombinasi vitamin A, C dan E) berbeda nyata terhadap perlakuan B (vitamin C) dan C (vitamin E).
Tabel 1. Jumlah Sel Darah Putih (Leukosit) Ikan Lele Dumbo Minggu Ke-4 (Pemeliharaan Dengan Pakan yang Telah Ditambahkan Vitamin) Jumlah Sel Darah Putih Perlakuan (sel/ml) Notasi Pada Minggu Ke-4 A (Vitamin A) 408.000 b B (Vitamin C) 271.500 a C (Vitamin E) 255.125 a D (Vitamin A, C dan E) 435.000 b Keterangan: Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata menurut uji Duncan pada taraf 5% Pada Tabel 2 terlihat bahwa jumlah sel darah putih pada perlakuan A (vitamin A) dan D (kombinasi vitamin A, C dan E) menghasilkan jumlah sel darah putih yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan B (vitamin C) dan C (vitamin E). Tingginya jumlah sel darah putih pada perlakuan A (vitamin A), karena vitamin A berperan dalam menstimulasi produksi dan maturasi limfosit (Linder 1992), sedangkan pada perlakuan D (kombinasi vitamin A, C dan E) merupakan kombinasi fungsi vitamin A yang berperan dalam menstimulasi produksi dan maturasi limfosit (Linder 1992) dengan vitamin C yang berperan dalam menstimulasi respon imun non-spesifik, fagosit oleh neurofil dan monosit (Johnny dkk. 2005). Pada perlakuan B (vitamin C) dan C (vitamin E) memiliki jumlah sel darah putih yang lebih sedikit dibandingkan dengan perlakuan A (vitamin A) dan D (kombinasi vitamin A, C dan E), karena vitamin E berperan untuk meningkatkan jumlah trombosit/keping darah yang berfungsi dalam pembekuan darah serta berperan dalam menghasilkan protein kekebalan yang disebut interleukin-2, yang menginduksi perbanyakan sel darah putihsehingga dibutuhkan waktu yang cukup lama untuk vitamin E dalam meningkatkan jumlah sel darah putih. Sedangkan belum diinfeksikannya bakteri pada ikan lele dumbo membuat vitamin C yang berperan dalam menstimulasi respon imun non-spesifik, fagosit oleh neurofil dan monosit (Johnny dkk. 2005) belum benar-benar terlihat, diduga pula bahwa konsentrasi vitamin C dalam penelitian ini konsentrasinya kurang dalam meningkatkan jumlah sel darah putih.
Pada minggu Ke-5 dan Ke-6 setelah penginfeksian bakteri, hasil analisis sidik ragam jumlah sel darah putih dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf 5% (Lampiran 8 dan Lampiran 9) memperlihatkan bahwa perlakuan A (vitamin A) tidak berbeda nyata dengan perlakuan B (vitamin C) dan D (kombinasi vitamin A, C dan E). Perlakuan B (vitamin C) tidak berbeda nyata dengan perlakuan A (vitamin A) dan C (vitamin E) namun berbeda nyata dengan perlakuan D (kombinasi vitamin A, C dan E). Perlakuan C (vitamin E) berbeda nyata dengan perlakuan A (vitamin A) dan D (kombinasi vitamin A, C dan E) namun tidak berbeda nyata dengan perlakuan B (vitamin C). Perlakuan D (kombinasi vitamin A, C dan E) berbeda nyata dengan perlakuan B (vitamin C) dan C (vitamin E) namun tidak berbeda dengan perlakuan A (vitamin A). Tabel 2. Jumlah Sel Darah Putih (Leukosit) Ikan Lele Dumbo Minggu Ke-5 dan Ke-6 Setelah Penginfeksian Bakteri Perlakuan Jumlah Sel Darah Putih (sel/ml) Minggu Ke-5 Minggu Ke-6 Notasi A (Vitamin A) 423.875 426.625 bc B (Vitamin C) 351.500 355.375 ab C (Vitamin E) 277.500 281.000 a D (Vitamin A, C dan E) 474.750 478.000 c Keterangan: Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata menurut uji Duncan pada taraf 5% Pada Tabel 3 di atas terlihat bahwa jumlah sel darah putih pada perlakuan A (vitamin A) dan D (kombinasi vitamin A, C dan E) lebih tinggi dari perlakuan B (vitamin C) dan C (vitamin E). Sama seperti minggu ke-4 (sebelum diinfeksikan bakteri), namun pada minggu ke-5 dan ke-6 memperlihatkan bahwa perlakuan B (vitamin C) tidak berbeda nyata dengan perlakuan A (vitamin A) yang tidak sama dengan minggu ke-4 (sebelum diinfeksikan bakteri yang diberi pakan dengan penambahan vitamin). Hal ini terjadi karena vitamin C yang berperan dalam menstimulasi respon imun non-spesifik, fagosit oleh neurofil dan monosit (Johnny dkk. 2005) sudah mulai terlihat oleh karena bakteri sudah diinfeksikan sehingga jumlahnya meningkat lebih banyak, tidak sama dengan perlakuan C (vitamin E) yang hanya meningkat sedikit jumlahnya yaitu sebesar
22.375 sel/ml dari minggu ke-4 (sebelum diinfeksikannya bakteri) dan tetap menjadi perlakuan dengan jumlah sel darah putih terkecil, dapat terlihat selisih jumlah sel darah putih tesebut pada Tabel 4 berikut: Tabel 3. Peningkatan Jumlah Sel Darah Putih Ikan Lele Dumbo pada Setiap Perlakuan Perlakuan Jumlah Sel Darah Putih (sel/ml) Minggu Ke-4 Minggu ke-5 Selisih (sel/ml) A (Vitamin A) 408.000 423.875 15.875 B (Vitamin C) 271.500 351.500 80.000 C (Vitamin E) 255.125 277.500 22.375 D (Vitamin A, C dan E) 435.000 474.750 39.750 Vitamin A dan vitamin C sebagai bahan imunostimulan dalam penelitian ini bekerja menekan komponen sistem kekebalan tubuh sejalan dengan pendapat Agrawal dan Singh 1999. Vitamin A yang berfungsi dalam menstimulasi produksi dan maturasi limfosit (Linder 1992), vitamin C yang berperan dalam menstimulasi respon imun non-spesifik, fagosit oleh neurofil dan monosit (Johnny dkk. 2005), sedangkan vitamin E meningkatkan jumlah dan agragasi trombosit juga berperan menghasilkan protein kekebalan yang disebut interleukin-2, yang menginduksi perbanyakan sel darah putih (Combs 1998) sehingga dapat diduga bahwa kombinasi ketiganya meningkatkan aktivitas sel pembunuh alami yang membuat sel darah putih dalam tubuh lebih agresif melawan dan mencegah infeksi dari berbagai macam mikroorganisme (Linder 1992) yang dalam hal ini adalah bakteri Pseudomonas. Pada penelitian ini terlihat bahwa kombinasi ketiganya meningkatkan sel darah putih yang paling tinggi dari pada perlakuan masingmasing vitamin. Sel darah putih pada ikan merupakan bagian penting dari sistem pertahanan tubuh yang bersifat non-spesifik. Sel-sel ini berfungsi untuk memangsa pathogen yang masuk ke dalam tubuh.
1.2 Tingkat Kelangsungan Hidup (SR) Ikan Lele Dumbo Grafik kelangsungan hidup harian selama masa infeksi (Gambar 5) memperlihatkan bahwa pemberian vitamin A, C, E maupun kombinasi vitamin ketigannya bekerja dengan baik dalam menjaga ketahanan ikan lele dumbo terhadap infeksi Pseudomoniasis. Terlihat bahwa setelah hari kedelapan penginfeksian, kelangsungan hidup ikan lele dumbo menjadi stabil. Gambar 2. Kelangsungan Hidup Ikan Lele Dumbo Harian Nilai perhitungan rata-rata tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo (Lampiran 10) selama masa penginfeksian disajikan dalam grafik pada Gambar 6 berikut : Gambar 3. Rata-rata Tingkat Kelangsungan Hidup Ikan Lele Dumbo Dengan Pemberian Vitamin yang Berbeda
Pada Gambar 6 dapat dilihat bahwa tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo tertinggi sebesar 97.5% terdapat pada perlakuan D yaitu perlakuan dengan penambahan kombinasi vitamin A, C dan E dalam pakan. Tingginya tingkat kelangsungan hidup pada perlakuan D (kombinasi vitamin A, C dan E) karena selain menambah jumlah sel darah putih yang meningkatkan imunitas sehingga melindungi tubuh dari serangan bakteri, vitamin A bermanfaat dalam mendukung proses pembaharuan kulit atau regenerasi sel-sel kulit (Linder 1992), vitamin C dapat mempercepat proses penyembuhan luka dengan merangsang prolin dan lisin dalam pembentukkan kolagen (Muray et al. 1999), serta vitamin E yang berperan dalam memelihara integritas semua sel termasuk kulit (Combs 1998), sehingga kombinasi ketiganya sangat baik dalam meningkatkan kelangsungan hidup. Sedangkan tingkat kelangsungan hidup yang terendah terdapat pada ikan lele dumbo dengan perlakuan C yaitu perlakuan dengan penambahan vitamin E pada pakan, hal ini terjadi karena fungsi vitamin E yang hanya dapat memelihara integritas semua sel termasuk kulit (Combs 1998) juga berperan menghasilkan protein kekebalan yang disebut interleukin-2, yang menginduksi perbanyakan sel darah putih membutuhkan waktu dalam prosesnya, sehingga perlindungan dari sel darah putih dalam maningkatkan imunitas terhadap infeksi kurang efektif. Vitamin A, C dan E dalam penelitian ini selain meningkatkan sel darah putih, juga berfungsi dalam melindungi kulit dengan memelihara fungsi sel dan perkembangannya terutama sel-sel goblet, yaitu sel kelenjar yang mensintesis dan mengeluarkan sel mukus atau lendir (Linder 1992) yang sebagaimana diketahui bahwa lendir pada ikan merupakan pelindung tubuh pertama yang bekerja dari serangan benda asing di luar tubuh, selain itu vitamin C dapat mempercepat reaksi kelompok hidroksilasi dengan formulasi kolagen dalam pemeliharaan keseimbangan alami kulit (Mahardika et al. 2004). Terlihat dari gejala klinis yang terjadi saat penelitian, dimana pada setiap perlakuan didominasi oleh ikan uji dengan gejala bercak merah saja dan hanya beberapa yang terkena kerusakan lebih lanjut. Hasil analisis sidik ragam nilai rata-rata tingkat kelangsungan hidup ikan lele dumbo menyatakan bahwa keempat perlakuan tidak memberikan perbedaan
yang nyata (Lampiran 11), namun nilai persentase hasil uji statistik (Tabel 5) memperlihatkan perlakuan D (kombinasi vitamin A, C dan E) dalam penelitian ini memberikan kecenderungan kelangsungan hidup yang tertinggi yaitu sebesar 97,5%. Tabel 4. Rata-rata Tingkat Kelangsungan Hidup Ikan Lele Dumbo Perlakuan Jumlah Ikan Awal (No) Jumlah Ikan Akhir (Nt) Tingkat Kelangsungan Hidup (%) A (Vitamin A) 20 19,3 96,3 B (Vitamin C) 20 18,0 90,0 C (Vitamin E) 20 17,5 87,5 D (Vitamin A, C dan E) 20 19,5 97,5 1.3 Gejala Klinis Ikan Lele Dumbo Pengamatan gejala klinis ikan lele dumbo yang diinfeksi dengan bakteri P. fluorescens dilakukan dengan melihat kerusakan yang timbul pada permukaan kulit tubuh ikan lele dumbo. Pada kurun waktu 24 jam setelah dilakukan penyuntikan bakteri P. fluorescens belum muncul gejala klinis pada permukaan kulit tubuh ikan lele dumbo, namun ikan lele dumbo terlihat bergerak lambat. Pada hari ke-2 pengamatan, gejala klinis muncul dengan terlihatnya bercak merah pada permukaan kulit tubuh ikan lele dumbo (Gambar 7) sebagai tanda bahwa bakteri sudah beradaptasi dan mendegradasi jaringan kulit ikan lele dumbo dengan tujuan mencari nutrisi untuk kelangsungan hidupnya. Gambar 4. Bercak Merah pada Kulit Ikan Lele Dumbo (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2013)
Pada hari ketiga setelah penginfeksian, terjadi kerusakan pada sirip dan kulit serta permukaan tubuh menghasilkan lendir yang berlebih (Gambar 8) yang mengindikasikan bahwa bakteri telah berhasil memperbanyak diri sehingga kerusakan kulit pada ikan lele dumbo lebih banyak. Gambar 5. Kerusakan Sirip dan Kulit Ikan Lele Dumbo (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2013) Pada hari kelima setelah penginfeksian, perut ikan lele dumbo menjadi kembung dan terlihat pendarahan didalamnya (Gambar 9). Infeksi bakteri yang banyak telah mengalami fase stasioner sehingga pendegradasian jaringan berhasil hingga masuk ke dalam tubuh dan mulai menginfeksi organ dalam ikan lele dumbo seperti hati, usus dan ginjal. Gambar 6. Pendarahan, Perut Kembung (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2013) Pada hari keenam setelah penginfeksian, sirip dan ekor ikan lele dumbo rontok serta terjadi pendarahan pada tubuh ikan lele dumbo (Gambar 10). Bakteribakteri yang telah menginfeksi ikan lele dumbo akan mengalami fase kematian sehingga memerlukan nutrisi lebih banyak untuk kelangsungan hidupnya yang
mengakibatkan baik tubuh ikan lele dumbo bagian luar maupun bagian dalam rusak hebat, seperti ekor yang membusuk dan pendarahan pada organ dalam tubuh. Gambar 7. Sirip dan Ekor Busuk Serta Pendarahan (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2013) Penambahan vitamin A, C dan E pada pakan ikan lele dumbo, memberikan kelangsungan hidup yang relatif tinggi hingga akhir penelitian. Ini menunjukkan bahwa vitamin A, vitamin C maupun vitamin E bekerja dalam meningkatkan ketahanan ikan lele dumbo. Vitamin A dapat menstimulasi respon imun dengan membuat sel darah putih serta antibodi dalam tubuh lebih agresif melawan dan mecegah infeksi antigen juga memelihara fungsi sel dan perkembangannya pada kulit terutama sel goblet yang mengeluarkan sel mukus atau lendir (Linder 1992) yang sebagaimana diketahui bahwa lendir pada ikan merupakan pelindung tubuh pertama yang bekerja dari serangan mikroorganisme di luar tubuh yang membahayakan, serta mempertahankan perkembangan epiteal sehingga mempecepat penyembuhan luka. Vitamin C mempunyai fungsi meningkatkan respon imun non-spesifik dengan membantu mempercepat produksi sel darah putih (Johnny et al. 2005), juga mempercepat reaksi kelompok hidroksilasi prolin dan lisin dalam pembentukan kolagen guna memelihara keseimbangan alami kulit beserta jaringannya sehingga mempercepat penyembuhan luka (Mahardika et al. 2004).
Vitamin E memiliki fungsi meningkatkan jumlah dan agragasi trombosit dan memelihara integritas membran semua sel termasuk pada kulit (Combs 1998) sehingga dapat terhindar/meminimalisir apabila akan terjadi pengrusakan. Setelah terjadi fase kematian bakteri di hari kedelapan, kelangsungan hidup ikan lele dumbo mulai stabil. Setelah hari kedelapan, ikan lele dumbo yang hidup merupakan ikan dengan gejala klinis bercak merah dan kerusakan pada sirip (Gambar 11). Hal ini membuktikan bahwa vitamin A, C, E maupun kombinasi vitamin A, C dan E mampu meningkatkan imunitas ikan lele dumbo sehingga menghambat bakteri dalam memberikan kerusakan yang lebih parah pada permukaan kulit tubuh ikan lele dumbo. Gambar 8. Kerusakan Kulit dan Sirip Ikan Lele Dumbo pada Akhir Penelitian (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2013)
Secara garis besar gejala klinis setiap perlakuan yang timbul selama penelitian dapat dilihat pada Tabel 6 berikut: Tabel 5. Gejala Klinis yang Timbul Selama Penelitian Perlakuan Gejala Klinis 1 2 3 4 A (Vitamin A) x - - - B (Vitamin C) x x x - C (Vitamin E) x x x x D (Vitamin A, C dan E) x - - - Keterangan : 1. Bercak merah (ringan) 2. Kerusakan sirip dan kulit (sedang) 3. Pendarahan (parah) 4. Sirip dan ekor busuk (sangat parah) Pada Tabel 6 di atas terlihat bahwa kerusakan sangat parah terjadi pada perlakuan C (perlakuan dengan penambahan vitamin E) dengan gejala klinis sirip dan ekor busuk. Keseluruhan ikan lele dumbo selama penelitian mengalami gejala becak merah (ringan) pada hari kedua setelah penginfeksian dan menyebabkan kematian pada semua perlakuan sebanyak 1 2 ekor. Kerusakan sirip dan kulit (gejala sedang) yang terjadi pada hari ketiga menyebabkan empat ekor ikan lele dumbo pada perlakuan B (vitamin C) mati. Perut kembung dan pendarahan (gejala parah) yang terjadi pada hari kelima menyebabkan satu ekor ikan lele dumbo pada perlakuan B (vitamin C) dan lima ekor ikan lele pada perlakuan C (vitamin E) mati. Sirip dan ekor busuk disertai pendarahan (gejala sangat parah) yang terjadi pada hari keenam menyebabkan empat ekor ikan lele dumbo pada perlakuan C (vitamin E) mati. Ikan lele dumbo yang hidup disetiap perlakuan hingga akhir penelitian merupakan ikan dengan gejala klinis bercak merah (gejala ringan). Penambahan kombinasi vitamin A, C dan E kedalam pakan menjadi lebih baik dalam membantu meningkatkan ketahanan ikan lele dumbo terhadap penyakit Pseudomoniasis baik dari dalam tubuh (peningkatan jumlah sel darah putih) maupun dari luar tubuh, yaitu ketahanan sel-sel pada kulit serta mukosa (gejala klinis).
Pada Tabel 7 berikut merupakan hasil pengamatan dari beberapa parameter yang diamati dengan perlakuan yang berbeda untuk mengetahui efektivitas penambahan vitamin yang dapat mencegah infeksi penyakit Pseudomoniasis. Tabel 6. Efektivitas Penambahan Vitamin Kedalam Pakan Terhadap Jumlah Sel Darah Putih, Kelangsungan Hidup, dan Gejala Klinis Untuk Mencegah Penyakit Pseudomoniasis Parameter yang Diamati Perlakuan Jumlah Sel Darah Putih (sel/ml) Kelangsungan Hidup (%) A (vitamin A) 423.875 96,3 1 B (vitamin C) 351.500 90,0 3 C (vitamin E) 277.500 87,5 4 D (vitamin A, C dan E) 474.750 97,5 1 Keterangan : 1. Bercak merah (ringan) 2. Kerusakan sirip dan kulit (sedang) 3. Pendarahan (parah) 4. Sirip dan ekor busuk (sangat parah) Gejala Klinis Pada Tabel 7 di atas terlihat bahwa perlakuan D (perlakuan dengan penambahan kombinasi vitamin A, C dan E kedalam pakan) merupakan perlakuan terbaik yang menghasilkan jumlah sel darah putih dan nilai kelangsungan hidup tertinggi serta gejala klinis ringan, yaitu bercak merah. Pada Tabel 7 tersebut dapat dilihat pula bahwa vitamin A (perlakuan A) paling efektif dibandingkan vitamin C dan E yang digunakan pada penelitian ini dalam mencegah infeksi penyakit Pseudomoniasis, terlihat dari besarnya jumlah sel darah putih dan tingginya kelangsungan hidup, serta gejala klinis yang ringan yaitu bercak merah dibandingkan vitamin C dan E yang mencapai kerusakan parah hingga sangat parah yaitu pendarahan serta pembusukan pada ekor dan sirip.